二、材料和方法
所有化学品均购自 Sigma-Aldrich（St.Louis，MO），细胞培养试剂购自 Mediatech（Manassas，VA），除非另有说明。
（一）拓扑衬底制备
采用软性光刻、缝合和压印相结合的混合技术来制造面积足以进行细胞研究的聚二甲基硅氧烷（PDMS）拓扑表面。PDMS基板还提供了光学清晰度和力学性能，可以承受细胞收缩力。简而言之，这种混合技术利用传统的软光刻技术，将一次硅模的图形连续地转移到二次PDMS复制件上。二级PDMS复制品被缝合到一个更大的二级模具中，并压印在一个三级聚苯乙烯涂层硅片上。第三个模型用于制造所需拓扑的PDMS复制品。使用这种混合动力技术制造了PDMS基片（Sylgard®184，康宁），其多聚物前体与固化剂的比例为10∶1，网格组成的大小间距为300nm、500nm和1μm（宽度∶周长＝1∶2），高度为350nm。平面PDMS控制是通过在平面硅片表面（宽度＝0nm）进行热固化制成的。图8-1显示了我们研究中使用的理想拓扑的典型PDMS复制品。将PDMS复制物切割成21mm直径的圆盘，放入12孔组织培养板中。细胞播种前，先用70%乙醇消毒1小时，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗 2次。
图8-1 采用混合技术制作的PDMS网格
PDMS网格的SEM显微图：A.平面控制，B.300nm，C.500nm，D.1μm网格。样品的高度为350nm，宽度∶周期（w∶p）比为 1∶2μm。 比例尺＝2μm。
（二）THP-1细胞培养
人类单核细胞/巨噬细胞，THP-1（ATCC马纳萨斯，弗吉尼亚州），用含1640培养基，添加10%胎牛血清、100U/ml青霉素和链霉素、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠以及0.05mmol/L β-巯基乙醇。将细胞添加到无菌的PDMS网格样品中，密度为2×105/cm2，在12孔组织培养聚苯乙烯（TCPS）板，加入2ml的完全培养基。每个网格尺寸组选取3个视野（n＝3），用于每个时间点观测。在接种后24小时内，用50ng/ml的 PMA处理THP-1细胞，化学诱导细胞分化和黏附。在37℃恒温箱中培养细胞（二氧化碳浓度为5%，湿度为95%）。每隔1天更换1次细胞培养基，分别于培养的第1、3、7天，用甲醇固定、染色细胞，以观察细胞的黏附性和形态学。收集上清液，离心，除去非黏附细胞和细胞碎片，-80℃保存，用于细胞因子分泌水平的分析。
（三）PBMC来源的巨噬细胞培养和FBGC融合
从美国红十字会卡罗来纳血液服务中心（ARCBS，Durham，NC）购买的全血，按照制造商的协议和文献中描述的标准程序，通过ficol-paque离心（GE Healthcare Biosciences，Piscataway，NJ）分离外周血单核细胞来源的巨噬细胞。简单地说，从血液中分离出来的单核细胞在Hanks平衡盐溶液（HBSS）中洗涤3次，然后在RPMI 1640培养基中重新悬浮，培养基中添加1%的抗生素（100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素）。细胞接种于含有无菌PDMS网格的12孔组织培养板上，密度为2×106细胞/板，在2ml的培养基中加入20%的血清，在37℃下培养2小时，使单核细胞黏附在PDMS网格上。2小时和24小时后，将上清液替换为含有抗生素的新鲜培养基，将组织培养板放在含5%CO2的培养箱中：温度37℃，湿度为95%。第3天，在培养基中添加抗生素、5%热灭活血清（56℃灭活1小时）和15ng/ml重组人 IL-4（R & D Systems，Minneapolis，MN）。 细胞培养到第 7天，每隔一天更换一次培养基。该巨噬细胞培养体系利用IL-4在体外异物反应模型中启动FBGC融合。
在每个时间点（第1天、第3天和第7天），对甲醇固定样本进行染色，观察巨噬细胞黏附、形态变化和FBGC融合情况。在每个时间点收集上清液，离心除去非黏附细胞和细胞碎片，放置于-80℃储存。取每个网格尺寸的3个视野，用于每个时间点观测。统计学数据取平均值±标准误。本实验伦理符合杜克大学、美国卫生与公众服务部（DHHS）和ARCBS机构审查委员会（IRB）的规定（2008年7月1日批准）。
（四）组织学染色及图像分析
在每个时间点，将拓扑图网格上的黏附细胞于100%冰冷甲醇中固定5分钟，然后用吉姆萨染色，为显微镜成像（Nikon TE2000U）做准备。每个样本随机选择8～10个不同视野进行观察（放大20倍和40倍）。不同供体的THP-1和PBMC来源巨噬细胞的显微图像具有代表性。每个网格尺寸至少有120个细胞（n＝3）进行形态学测量。R-ratio是衡量细胞伸长率和形态学变化的指标，为细胞长轴的长度∶细胞短轴的长度。一个完美的圆形细胞R值是1。伸展细胞在我们的研究中定义为R值≥2.5。 使用 ImageJ（NIH，Bethesda，MD）和 ImagePro（Media Cybernetics，Bethesda，MD）进行图像分析。
（五）细胞因子分泌谱免疫分析
THP-1和初级单核细胞/巨噬细胞在应对拓扑Bio-Plex阵列系统上进行黏附相关细胞因子检测（Bio-Rad，CA），使用多路复用悬珠免疫方法检测（微孔、BILlerca MA）9个因子：IL-1受体激动剂（IL-1ra）、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、炎症蛋白-1α（MIP-1α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和血管内皮生长因子（VEGF）。简单地说，上清液在4℃下与抗体微球孵育过夜，然后与细胞因子结合微球二抗孵育1小时。通过生物素-链霉亲和素（biotin-streptavidin）的结合，将藻蓝菊染料与微球结合30分钟。除另有说明外，所有培养步骤均在室温下的平板振动筛上进行。根据平均荧光强度读数测量细胞因子浓度（pg/ml），并与试剂盒中已知细胞因子浓度读数生成的4和5参数 Logistic（4PL和5PL）标准曲线进行比较。Bio-Plex阅读器在每次读取之前都经过校准和验证，严格遵循制造商的说明。
（六）吞噬作用分析
吞噬作用测定使用直径1μm的黄绿色羧酸盐微球（Polysciences沃灵顿，PA），配制10%的溶液，37℃孵育30分钟，然后添加培养基，稀释10倍（每个细胞对应10个微球）。在37℃的黑暗环境中，这些微球与黏附的THP-1细胞在各自的PDMS网格上孵育3小时，从而被细胞吞噬。荧光标记聚苯乙烯微球用于细胞吞噬实验，其信号噪声比。孵育后，用冷PBS洗涤三次，除去未被吞噬的微球，立即用4%多聚甲醛固定。采用小麦胚芽凝集素对该细胞膜进行无渗透性反染，按照产品说明书进行处理。使用荧光凝胶（电子显微镜科学，Hatfield，PA）固定和染色样品，固定和染色样品安装在玻璃盖片上，将聚苯乙烯微球（激发：441nm，发射：486nm）和细胞膜（激发：555nm，发射：565nm）的荧光成像（尼康TE2000U）。每个样本随机观察8～10个独立区域的图像（放大倍数分别为20倍和40倍）。每个网格大小至少测定150个细胞（n＝3）的吞噬活性，通过计算至少有一个聚苯乙烯微球被摄取的细胞数量占细胞总数的百分比，计算出吞噬率。
（七）统计分析
数据采用均数±平均标准误表示，采用方差分析对不同治疗组进行统计学分析。所有成对的多重比较都是使用Tukey法事后测试进行的。P<0.05认为差异有统计学意义。