第二节　一氧化氮与心血管疾病

一、内源性NO发现的历史

1772年，Priestly在体内发现NO的存在，它是一种无色透明的气体，寿命一般为6~10s。1980年，Furchgott发现在血管内皮完整的情况之下，内皮细胞在乙酰胆碱刺激后能产生一种内皮源性的舒张因子（endothelium-derived relaxing factor，EDRF）。在这项研究中发现，无论是乙酰胆碱还是其他激动剂导致血管舒张作用都依赖于EDRF。该因子是一种不稳定的具有扩散性的非前列腺素物质，最终作用于血管平滑肌细胞（VSMC）舒张血管。1987年Moncada团队、Ignarro团队和Furchgott团队分别证明了EDRF就是NO。一年后，Moncada团队进一步证明内源性NO是由精氨酸合成，而早在1977年Murad就已经证实硝基扩血管药（如硝酸甘油、硝普钠）可以刺激可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）的生成，从而达到扩张血管的效果。所有这些工作为NO在心血管系统作为信号分子的作用研究奠定了基础。

1992年Science杂志的封面将NO列为“年度明星分子”。1998年诺贝尔生理学或医学奖授予三位科学家Furchgott、Ignarro和Murad，表彰他们 “一氧化氮作为心血管系统信号分子”的发现。1999年，Moncada由于对NO进行的开创性工作被评为“90年代最受推崇的英国科学家”。

截至1993年，人们认识到NO参与发病机制的疾病范围仅仅为高血压、感染性休克和痴呆，到20世纪末，发现NO的生物学效应几乎覆盖整个生物医学领域，包括心血管功能、神经传递、疼痛、糖尿病、伤口愈合和组织修复、皮肤疾病、癌症、免疫功能、感染、呼吸功能、眼睛疾病和其他疾病。直至今天，研究报道与NO稳态改变相关的疾病仍在不断增加。尽管内皮细胞有许多其他的功能，最早出现于1983年的术语“内皮细胞功能障碍”已经成为NO生物活性减少的代名词。因此，众多与NO有关的疾病的治疗方法均通过提高NO生物利用率、增强内皮细胞释放NO等途径来产生疗效。

二、NO的代谢与调节

体内NO的产生有两种途径，即酶促途径和非酶促途径。在酶促途径中，NO由底物L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的催化及辅助因子黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和四氢生物蝶呤（BH4）的参与下而产生。酶促途径是最主要的途径，也是主要的研究对象，非酶促途径与NOS无关。

1989年Casino等在体内用放射标记法进行光谱分析证实NO的氮原子来自L-Arg，氧原子来自氧气，由NOS催化生成（图9-1）。NO极不稳定，在有氧和水的环境中仅能存在6~10s，随即很快与亚铁血红素和—SH键结合而失活。NO的最终代谢产物为亚硝酸盐和硝酸盐，两者的量大致相等。NO少量通过呼吸作用排出体外。

早期阶段所取得的NO生物学效应分子机制研究方面的进展都是源于对NOS的研究。1987年，大量文献支持哺乳动物细胞能够合成一氧化氮这一推测。1989年，有文献报道内皮细胞胞质中含有由Ca2+直接或间接调控的酶，能够把L-Arg转化成一种化合物从而刺激可溶性鸟苷酸，并表现出类似于EDRF的作用。后经证实这一化合物就是NO。

第一个发现的NOS即神经元型NOS（neuronal NOS，nNOS），来自大脑的内皮细胞和神经元。随后诱导型NOS（inducible NOS，iNOS）从巨噬细胞中分离出来。诱导型NOS在细胞因子和/或微生物刺激几个小时以后产生，多种细胞都有表达。之后内皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）从牛主动脉内皮细胞中分离出来。按照这三种酶（nNOS、iNOS和eNOS）的发现顺序依次命名为NOS1、NOS2和NOS3。

NOS为一含铁的单氧化酶，三种NOS分子结构相似，都具有N端氧合酶区、钙调蛋白结合区和C端还原酶区，其中C端还原酶区包含了辅酶因子结合位点，NOS的酶活性依赖于这些辅酶因子结合位点的存在。

nNOS和eNOS最初被认为是结构型NOS（constitutive NOS，cNOS），在生理条件下产生极少量的NO，需要Ca2+的调节。iNOS在病原微生物、毒性产物或者炎症因子的刺激下诱导NO大量生成。最近20年来的广泛研究证明nNOS和eNOS也可受到诸多因素的调节，且对各种调节因素反应迅速，而iNOS也可在生理条件下持续存在。

eNOS的活性调控因素包括Ca2+/钙调素、翻译后修饰（如Akt1磷酸化）、蛋白质-蛋白质相互作用（如caveolin-1或热休克蛋白90），以及其他调节因素。NO的生成量受多种血管活性因子调节，包括儿茶酚胺、5-羟色胺、缓激肽等，以及机械刺激如血管张力、剪切应力和血液脉冲流动等。NO具有亲脂性，这一特性使得它可自由穿过细胞膜到达血管腔内，接近血细胞如中性粒细胞和血小板从而在生理水平缓冲活性氧（ROS）的作用，同时也可以使之进入血管平滑肌细胞调节血管舒张。

在血管平滑肌细胞，NO与血红素上的铁结合，激活它的主要受体NO敏感性鸟苷酸环化酶，产生第二信使cGMP，从而激活cGMP依赖蛋白激酶（PKG），通过各种机制降低细胞内Ca2+浓度，抑制肌凝蛋白轻链去磷酸化，导致血管平滑肌细胞松弛、血管扩张。NO还可以直接作用于大电导Ca2+激活钾通道（BK_ca）和ATP敏感的钾通道（K_ATP）等离子通道从而舒张血管。

三、NO在心血管疾病中的生物学效应

在心血管系统中NO主要由eNOS催化L-Arg生成，血管内皮细胞、平滑肌细胞等均可以产生。一般情况下动脉产生NO的量较静脉多。NO作为一种可溶性气体信号分子对维护心血管系统的正常功能起着关键作用。该气体分子作用广泛，包括调节血管通透性、维持血管张力、调节血管舒缩、抑制平滑肌细胞的增殖、抑制血小板聚集、抑制血小板或单核细胞黏附于内皮细胞、抑制LDL氧化、抑制黏附分子表达和内皮素的产生等。

NO的合成障碍导致血管内皮细胞功能紊乱是心血管系统多种疾病发生发展的关键步骤。内皮细胞中的L-Arg/NOS/NO通路紊乱导致NO生成减少有各种原因：缺乏底物L-Arg；缺乏辅助因子如BH4；酶的表达减少；内源性一氧化氮合酶抑制物非对称二甲基精氨酸（ADMA）增加。NO生物利用率下降会导致内皮依赖性的心血管系统功能紊乱，通常是氧化应激或硝化应激增加，抗氧化酶活性减少，从而引起一系列疾病或病变，如高血压、动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）、冠心病、糖尿病、高胆固醇血症、血管再狭窄等。

（一）一氧化氮与高血压

高血压（hypertension）严重威胁人类健康，是脑血管疾病、缺血性心脏病、心力衰竭和肾衰竭的重要始动因素，其发病原因不明，最基本的病理改变为全身细小动脉硬化，主要病理生理学变化包括血管舒缩功能异常和血管重构等。高血压导致的血管重构最典型的特征包括血管中膜增厚、内径缩小及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积。

高血压的发病机制非常复杂，内源性NO生成不足和生物利用度下降是高血压及血管重构的重要发病机制之一。一般情况下，NO在血管内皮细胞中不断产生，调控血压和血管通透性；调节血小板和单核细胞与血管内皮细胞的黏附；参与血管成形术后的血管重塑；与硫醇基团相互作用，后者携带了内皮细胞的关键酶，如超氧化物歧化酶（抗氧化酶）、半胱天冬酶（细胞凋亡重要的酶）、细胞色素氧化酶（线粒体呼吸链重要的酶）。

NO参与了血流动力至关重要的三种调节机制，由此调节正常人和高血压患者的血压：①对血管静息张力的调节；②调节血流以适应组织代谢的需求；③调节血管直径以适应血流量。

原发性高血压患者的血清NO及NOS均低于正常人，表明高血压患者有内皮细胞功能受损，存在内皮依赖性血管舒张功能缺陷。同时发现原发性高血压患者血液内皮素（ET）水平明显高于正常人，NO/ET比例下降，血管舒缩功能失调，血压升高。

研究发现，在原发性高血压患者的冠状动脉中，无论是化学刺激（如乙酰胆碱、缓激肽等）、机械刺激（如血管张力、剪应力、内皮细胞变形及血液脉冲流动）还是药物刺激都能够检测到NO的生物利用率下降，而且内皮细胞功能障碍的程度与冠状动脉硬化程度有关。随着高血压病程的不断进展，左心室肥厚加重，冠状动脉的内皮细胞功能障碍也逐渐加重。

NO所介导的生理和病理生理效应依其来源和浓度不同而异。生理情况下NO可以增加血管舒张程度，但过量的NO使ROS产生增加反而促进高血压的发展。生理情况下，NO的浓度一方面取决于eNOS的活性，另一方面取决于过氧化物的浓度。在正常条件下，过氧化物的生成与清除由各种抗氧化酶来保持平衡。然而，氧化和抗氧化之间的不平衡造成了氧自由基增加，进而损伤细胞，导致动脉收缩。氧化修饰的重要靶标是eNOS的辅酶BH4，BH4氧化损伤导致eNOS解偶联和持续的氧化应激。在病理情况下，eNOS出现功能障碍不能够生成NO，而是产生超氧阴离子（），造成NO生物利用度降低及氧化应激增加，导致或加重内皮细胞功能障碍，该现象被称为eNOS脱偶联。eNOS脱偶联和氧化应激是导致内皮细胞功能紊乱的根本原因，氧化应激产生的大量ROS通过跟NO、L-Arg转运蛋白、eNOS的关键辅酶BH4和eNOS本身反应造成eNOS脱偶联（图9-2）。越来越多的证据表明，NO生物利用度下降是由于其与过量O2-形成ONOO-，最终导致内皮依赖性的舒张功能受损。

在高血压动物模型中，NOS的表达和活性在高血压早期增加，晚期减少，应用ROS的抑制剂（包括NADPH氧化抑制剂、黄嘌呤氧化抑制剂、抗氧化剂）能够抑制血压升高。在ROS生成酶敲除的小鼠模型体内，血压相对较野生型低。在自发性高血压大鼠（SHR）体内检测到ONOO-生成增加，导致NO减少。

这些研究结果表明血管内皮损伤导致NO含量下降及NO的生物利用率降低是高血压发病机制中的一个关键的因素。

（二）一氧化氮与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化（As）是目前危害人类健康的重要病变之一，是众多心血管疾病（冠心病、脑卒中、外周血管病等）共同的病理学基础。

As的各种危险因素会引起内皮细胞损伤，导致血管舒张功能异常。研究发现随着血管舒张功能逐步降低，As的病变逐步加重，证实内皮细胞功能障碍在As发生发展中是一个始动因素。内皮源性NO是一种重要的抗As分子，它可以减少单核细胞与内皮细胞之间的黏附，促进VSMC凋亡，减少VSMC的增殖和迁移，抑制血小板黏附、聚集，这在As的早期阶段具有重要意义。在As发生发展的过程中，由于内皮受到损伤，NO的释放明显减少。

研究表明eNOS源性NO能够引起As的部分消退，阻止As的进展。与野生型小鼠比较，eNOS转基因小鼠血管NO生成明显增加，抑制了As的发展。在高脂、高胆固醇饮食诱导的兔血管功能障碍实验中，NO的生物利用度明显降低，而eNOS基因过表达可促进兔主动脉的舒张反应，使血管功能障碍得到部分缓解，同时兔颈动脉黏附分子表达和炎症细胞浸润减少，兔颈动脉As病变减轻。NOS基因疗法可改善内皮依赖性血管舒张，逆转As病变内皮氧化还原状态，抑制VSMC增殖，稳定易损斑块。有研究报道，内皮细胞特异性eNOS转基因小鼠血管NOS活性增加10倍左右，行颈动脉结扎后发现与对照组比较eNOS转基因组小鼠颈动脉新生内膜形成明显减少。

与以上结果一致，eNOS-/-小鼠行永久的颈总动脉结扎后新生内膜的形成增加，中膜增厚加速。与ApoE-/-小鼠相比，eNOS-/-/ApoE-/-小鼠加速血管As病变的形成，斑块面积显著增大。长期注射抑制NO生成的精氨酸类似物N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）的大鼠，内皮细胞合成NO明显减少，进而诱导血管炎症反应，导致MCP-1表达增加，促进As的发生。ApoE-/-小鼠注射L-NAME可抑制NO介导的内皮舒张反应，也引起小鼠主动脉As病变面积增加。这些研究结果表明，体内eNOS源性NO具有抑制As发生发展的作用。

在心血管系统中，ROS是由膜结合的NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶（XO）、脱偶联的eNOS和线粒体电子传递链等多种酶系统产生的。生理浓度的ROS起着信号分子的作用，在调控血管张力、氧感受、细胞生长和增殖、细胞凋亡与炎症反应中有重要作用。过度或持续ROS的产生，超过了机体清除能力，导致氧化应激。As形成与发展的“氧化损伤学说”或“自由基理论”认为，氧化应激导致脂蛋白和磷脂的氧化修饰，是As的主要潜在机制之一。在机体内血管组织同时受到抗氧化剂的保护，以此解除ROS的氧化作用，抗氧化剂包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH）等。eNOS源性NO能够减轻ROS氧化应激反应，减少脂质和蛋白的氧化反应。此外ROS还通过激活不同的激酶对eNOS进行磷酸化修饰来改变蛋白质结构、调节eNOS活性。动物实验和临床研究都表明补充L-Arg、BH4可以改善血管内皮细胞功能，减轻As病变。

高胆固醇血症是As的危险因素之一，LDL可被ROS氧化生成ox-LDL，成为重要的促As的分子。ox-LDL由巨噬细胞通过清道夫受体途径摄取，形成巨噬细胞源性泡沫细胞（foam cell），导致As病变的形成与发展。ox-LDL能直接降解和灭活NO，阻断NO受体信号传递，引起局部血管收缩，血管平滑肌细胞异常增殖和血小板黏附、聚集，促使动脉内血栓形成，造成管腔狭窄，导致和加剧As的发生发展。NO能直接灭活氧自由基，阻滞羟自由基的形成，增加细胞内抗氧化物谷胱甘肽的水平，抑制LDL的氧化修饰，阻止ox-LDL的生成，减轻其对内皮细胞的损伤及泡沫细胞的形成。

（三）一氧化氮与心肌缺血-再灌注损伤

心肌缺血（myocardial ischemia）是指由各种原因引起的冠状动脉血流量降低导致心肌氧供不足和能量代谢不平衡的临床状态，心肌细胞功能受损或坏死，是一个由可逆损伤逐步转化为不可逆损伤的过程。心肌缺血后尽早实施再灌注对于抢救受损心肌非常必要，但再灌注是一把“双刃剑”，由于自由基和ROS大量生成，再灌注后细胞质和线粒体内钙超载及炎症细胞大量黏附、聚集进一步加重心肌缺血的程度，造成心肌缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤。

随着动脉旁路移植术、溶栓疗法、经皮腔内冠状动脉血管成形术、心脏外科体外循环、心肺脑复苏等方法的广泛开展运用，一方面使缺血心肌重新得到血液灌注，但同时可造成心肌缺血-再灌注损伤。

NO在心肌缺血-再灌注损伤中有着十分重要的作用，它通过对冠状动脉血管舒缩的调控来维持有效循环血流，对缺血后心肌功能的恢复也发挥重要影响。研究发现，在高胆固醇血症家兔缺血-再灌注心脏模型中NO生成减少，心肌梗死范围增加，而给予外源性NO供体SNAP后心肌梗死的范围减小。

缺血-再灌注损伤的重要机制之一就是大量自由基及ROS的生成，破坏了机体氧化与抗氧化平衡。提高机体的抗氧化能力或减少自由基及ROS的过度生成都能有效减少机体的氧化应激损伤。缺血-再灌注损伤降低心肌内源性NO含量主要缘于再灌注早期促进NO消耗而后期抑制NO合成，NO的合成和释放减少是加重心肌缺血-再灌注损伤的重要原因之一。电子顺磁共振研究发现，在心肌缺血后再灌注的早期阶段（几分钟内）可爆发形成大量自由基及ROS，可一直持续十几分钟。NO作为一种自由基清除剂本身可直接与自由基及ROS发生反应，从而被大量降解和消耗。内皮细胞功能正常是合成eNOS的必要条件，而心肌缺血后再灌注的晚期阶段由于短暂的冠状动脉供血障碍导致血管内皮、心内膜和心肌中的eNOS生成减少，导致NO合成障碍。同时，缺血-再灌注可诱发内皮细胞损伤和功能紊乱，即发生内皮顿抑现象，激活内源性NOS抑制物，降低eNOS含量和活性。

（四）一氧化氮与心力衰竭

生理浓度的NO可以促进和维持心力衰竭时心肌的收缩功能。有研究报道，在心力衰竭患者及心力衰竭实验模型中心脏eNOS表达均减少，NO生物活性下降，NO依赖的冠状动脉舒张功能受损，促进了心脏功能不全。心脏特异性eNOS转基因小鼠通过结扎冠状动脉模拟心肌梗死模型，研究发现与野生型组相比转基因组小鼠左室收缩功能和舒张功能改善，左室肥厚和心肌肥厚减轻。以上研究表明，NO在心力衰竭发生中具有心脏保护作用。