第四章　超声分子成像概论

第一节　超声分子成像

超声分子成像（ultrasound molecular imaging）是指将特异性配体连接到超声造影剂表面，通过血液循环特异性地聚集于靶组织，观察靶组织在分子或细胞水平的特异性改变，以此来反映病变组织在细胞、亚细胞及分子水平上的病理变化。它是近年来提出的新一代医学超声成像方法，在肿瘤、心脑血管等疾病的早期检测和疗效评价方面有重大应用前景。

（一）超声分子显像剂

超声造影剂为直径1～4μm，膜包裹气体的气-液乳剂。在超声波照射下，微泡内气体核心的强声反射性能显著增强了造影剂/周围背景组织信号比。超声造影剂由不同的膜材料（如磷脂、生物相容性聚合物、蛋白质）和气体（如空气、全氟化碳、六氟化硫及氮气）合成。与空气比较，高分子气体溶解度低，使得微泡更稳定并能在血液循环中停留更长的时间。

超声分子探针是一类能特异性识别和结合于靶组织的配体、抗体等与超声造影剂以特定方式相结合而形成的复合物。用于分子成像的靶向配体可以是抗体和多肽，可以在合成微泡的过程中或微泡合成后被直接整合于膜壳中，或在分子末端连接聚乙二醇臂。

超声分子探针中造影剂分类

（1）按粒径大小不同，超声造影剂可以分为微米级超声造影剂和纳米级超声造影剂。

微米级超声造影剂为常规超声造影剂，平均直径约1～4μm，小于红细胞，可以自由通过肺循环，但不能穿过正常毛细血管基底膜，是一种血池显像剂。因此，微米级超声造影剂应用范围较局限，常用于血管腔内一些伴随有细胞表型改变的疾病，如动脉粥样硬化斑块、炎症、肿瘤血管、缺血再灌注损伤、移植排斥反应等血管或者淋巴管上异常的靶分子成像。

纳米级微泡的问世对于超声分子影像学发展是一个巨大的进步，与普通造影剂相比具有以下优势：①极强的穿透力。普通造影剂微泡不能透过血管内皮间隙，而纳米级造影剂能够穿透血管壁到达血管外，实现靶组织血管外显像；②聚集成像。粒径小于700nm的造影剂可以透过肿瘤新生血管，在肿瘤组织中聚集，从而达到了靶组织增强和背景噪声低的目的；③纳米微泡表面积相对较大，吸附能力强，具有良好的生物亲和性；④稳定性较强，可以在血液循环中存留更长时间。目前已有的研究证实，粒径在500nm左右的纳米脂质超声微泡能够穿过肿瘤血管进入组织间隙，Wang等的研究证实携载前列腺特异性膜抗原单抗的靶向纳米级超声微泡能使前列腺癌移植瘤显影信号的强度高于普通纳米级超声微泡。

纳米级微泡主要包括三大类：①含气纳米微泡，直径小于1μm，由磷脂包裹全氟化碳气体组成，比如Gao等以针对卵巢癌的CA-125抗体共价连接于纳米微泡表面，结果显示靶向微泡造影信号较非靶向微泡高2倍。但是含气纳米微泡的缺点在于微泡直径的缩小不仅影响了颗粒的声反射能力，也使得含气微泡在溶液中的稳定性降低，比如Gao等的研究中显像只能在注射造影剂后10分钟内进行，这一缺点限制了临床转化；②相变纳米液滴。由脂质、蛋白或聚合物膜包裹沸点低于人体温度的氟碳化合物液体颗粒，注入人体后仍处于液态，在受热、超声辐照或光照作用下，内部液体气化并体积增大，使颗粒具备良好的声反射特性；③产气纳米颗粒。纳米颗粒在特殊微环境下产生具有声反射特性的气体，如Min等的研究中，基于PLGA的产气纳米颗粒在碳酸酯共聚物水解时可产生CO₂气体，纳米颗粒静脉注射于荷瘤小鼠后在肿瘤组织聚集并产生CO₂气体，在长达4小时内可以探测到气体强回声。

（2）按不同的功能，超声分子探针又可分为单功能（只用于超声分子显像）、多模态。后者包括：①超声-磁共振成像。如Liu等以“一锅合成法”聚合反应合成了含有超顺磁性氧化铁纳米颗粒、基于PBCA的聚合物微泡，研究表明上述微泡可以同时用于超声和磁共振成像；②光声成像。光声成像基于使用短脉冲激光束激发组织发色团，后者导致组织的热弹性膨胀并发射宽带超声，超声换能器可捕获发射的超声波并用于图像重建。这使得光声成像具有光学成像的分子敏感性和超声成像的空间分辨力；③声光成像。声光造影剂是通过在微泡合成时或直接向已合成的微泡中掺入光学成像造影剂（如有机染料）而制备的。声-光造影剂探针可以量化靶向配体在微泡的表面覆盖度，也可用于研究微泡与生物靶标的结合动力学和静脉内给药后气泡的转归；④超声-核素显像。放射性标记的微泡通常用于研究静脉注射后微泡的生物分布。与光学成像相比，放射性核素成像技术能更好地进行定量分析。然而，光学成像和放射性核素成像的问题在于无法区分完整的微泡及其片段。

（二）超声分子显像剂的配体

通常连接于靶向超声微泡上的配体主要包括多肽、蛋白质、多聚体、抗体、纳米抗体。理想的配体要求具备以下条件：①高度的靶向特异性：配体的特异性对于靶向对比超声成像来说至关重要，配体的特异性保证了其靶向黏附于特异靶点，以实现对感兴趣区域的显像；②快速的结合和良好的抗解离能力：理想的配体要有能够耐受血流切应力的能力，以实现同靶点快速牢固地结合，这样才能保证在注射造影剂后迅速而长时间的显影；③非免疫原性：选择配体时，应选用人源化的抗体片段或非免疫原性的配体以避免免疫反应；④稳定性：不仅要求配体在存储过程中要保持稳定性，还要求其在注入体内后仍能保持稳定性，以实现对靶组织的良好显影。

目前的研究倾向用小分子配体取代大分子抗体与微泡连接构建靶向微泡，已有研究报道精氨酸-精氨酸-亮氨酸（arginine-arginine-leucune，RRL）肽、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginineglycine-aspartate）肽、P选择素糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）蛋白的糖硫肽片段构建靶向微泡。

（三）微泡与配体结合技术

靶向微泡造影剂具有靶向性的关键在于将选择性配体连接于微泡外壳，其制备是一个相当复杂的过程。过去30年，配体连接化学主要在靶向核素和MRI造影剂领域有很好的发展和应用。配体与微泡的结合需考虑以下因素：这种连接不能削弱配体与靶点的结合能力；必须选用可经静脉给药的配体；微泡表面连接的配体密度要足够大。目前常用的微泡-配体连接方法有以下几种：

1.静电吸附法

在不添加任何外在化学成分的情况下通过自身离子键、物理吸附等方法将靶向配体或靶向配体混合物直接连接到微囊成分上，该方法制备靶向超声造影剂过程简单，不需改变造影剂制备过程，仅在制备完成后通过调节溶液pH值、离子强度、温度、时间将靶向配体吸附到微囊表面，得到靶向超声造影剂。

2.偶联剂连接法

偶联剂是一类两端带有不同性质基团的物质，它的分子中一部分基团可与有机分子中一部分基团或与无机物分子特定基团反应，形成化学键，另一部分基团可与有机分子反应，形成牢固黏合。偶联剂连接方式：一种是先将配体共价结合到偶联剂上，微泡形成后这些配体和偶联剂就镶嵌于囊上；另一种是先将偶联剂嵌入囊中，微泡形成后再结合配体。

3.桥连接剂结合法

又称共价结合法，与偶联剂连接法的区别是此法首先引入必要的化学基团对桥连接剂进行结构修饰形成功能基团，而桥连接剂本身属于微囊构成成分，微泡形成后激活功能基团，然后与配体结合。其核心是磷脂衍生物（或PEG-磷脂）的活化羧基与配体分子的氨基形成酰胺连接。其优点是多数抗原的IgG单抗已商品化；IgG分子序列中赖氨酸较多，其氨基残基可随机黏附于微泡表面而不会降低抗体与抗原的结合力。缺点是：抗体消耗量大，因为酰胺化反应需要弱碱性环境，而多数活化磷脂在弱碱性条件下发生水解作用（副反应）无法与抗体结合，只有少数未水解的脂类可连接抗体，因此必须加入超量的抗体才能保证微泡表面连接的抗体密度足够大，可用于临床研究。

4.非吸附性非共价键结合的免疫化学固定

通过一种非共价非吸附性固定抗原抗体方法使脂质微囊富集于病灶，典型代表为生物素-亲和素（Biotin-avidin）连接法。该方法适用于体外研究和动物实验。其优点是在研究的初期阶段可快速将各种新配体连接于微泡，目前大量生物素化的靶向配体（如单抗）已商品化；所需（生物素化）配体量少，节约费用，调控配体与微泡的比例可使绝大部分配体连接到微泡上。限制其临床应用的缺点是链霉亲和素是一种异体蛋白，可引起人体免疫反应；合成的多个步骤需反复多次的离心漂洗，较烦琐。

（四）超声分子成像定量技术

超声分子成像的前提是靶向结合的微泡信号和背景信号之间有显著差别。低机械指数成像可以避免破坏微泡。微泡在超声波正向和负向压力的作用下膨胀和收缩而发生直径改变，产生非对称性非线性振荡，后者产生谐波和次谐波，利用不同的显像技术可以将谐波信号（如脉冲反转和幅度调制）提取出来，提高显像的信噪比。研究表明这些技术甚至可以探测到单个微泡。上述超声造影成像技术已经用于临床非靶向超声造影。不同于非靶向性显像，超声分子成像需要将结合于靶分子的小剂量造影剂从周围背景和循环中与未与靶分子结合的微泡信号识别开来。其中一种方法是静脉注射后10分钟成像，等待血管内游离微泡清除。这一方法直接，也可以进行定量分析，但前提条件是靶区有足够的靶向微泡，缺点是不利于进行长时间动态监测，因为靶向微泡会随着时间的推移而降解。

破坏-再灌注成像是一种更适合定量分析的技术。通过采集破坏微泡前后的图像并扣除代表循环内游离微泡的再灌注微泡信号，可以得到靶向结合的微泡信号。这一技术的缺点在于后处理耗时，另外，微泡破坏过程中的超声空化效应可能导致生物学损伤。

现有的超声成像技术致力于不需要破坏微泡的快速、实时、易于临床转化的数据定量分析方法。其中一个概念是基于阈值、从单个成像像素提取的“微泡驻留时间”，后者可以将靶向结合的微泡与循环中的游离微泡信号识别开来。另外一种新的概念是利用声辐射力的定量技术得到残留-饱和信号比（声辐射力脉冲作用前后信号比），这一定量技术不受超声衰减和系统设置的影响。Rychakk等和Frinking等的研究分别证实，应用声辐射力使得P-选择素特异性微泡与股动脉炎性部位结合增加20倍，VEGFR2靶向微泡（BR55）在实验性大鼠前列腺癌血管中的结合也得到了增强。

（五）超声分子成像临床应用领域

普通超声微泡经静脉注射进入人体后会被循环中的血液迅速稀释，到达特定部位的浓度很低，超声分子成像需对普通微泡进行特殊的靶向微泡协助成像。靶向微泡体内靶点目前局限于血管内皮，主要用于炎症、肿瘤血管生成、血栓、缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）损伤等分子成像研究，在了解疾病发生的分子机制、指导肿瘤治疗、研发新的治疗靶点和药物等方面发挥重要作用。

1.炎症

炎症是采用靶向微泡造影剂观察的最佳病变区，其发生和发展的病理过程均在微循环中进行，而微泡亦存在于微循环内，微泡在声学特性保持不变的情况下被激活的中性粒细胞和单核细胞黏附并吞噬，因此可以用来发现炎症的发生部位。

2.心肌缺血

研究发现P-选择素可作为一种特异性的缺血记忆成像靶标。Kaufmann等用生物素-亲和素-生物素（biotin-streptavidin-biotin，BSB）配体桥连技术，制备携带抗P-选择素单克隆抗体靶向超声微泡，用于评价心肌缺血-再灌注损伤。P-选择素靶向超声微泡能在心肌坏死前确定缺血心肌的存在，并能明显增强微泡的成像效果。Bettinger等作了进一步研究，制备了携带重组P-选择素糖蛋白配体（recombinant P-selectin glycoprotein ligand-1 analogue，rPSGL-Ig）的靶向超声造影剂，在实验过程中发现，用重组P-选择素糖蛋白配体进行心肌成像时，I-R损伤心肌声像图的回声强度明显增高，是非特异性超声造影剂的20倍。

3.评价心脏移植后的急性排斥反应

心脏排斥反应的病理生理主要为内皮功能的异常，其特点表现为白细胞黏附因子的炎性上调，促使血液中白细胞经血管壁进入炎性区。发生急性心脏排斥反应时，内皮细胞上有ICAM-1的过度表达，若在此造影剂外衣上结合抗ICAM-1抗体，经外周静脉注入造影剂后，则在心脏排斥区通过抗ICAM-1抗体与内皮细胞上的ICAM-1相结合，促使超声造影剂在排斥区滞留，局部造影剂浓度增加。因此，超声分子成像可利用携带细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的靶向微泡评价心脏移植后的急性排斥反应。此外，通过携带黏附素细胞黏附分子1（mucosal addressin cell adhesion molecule-1，MAdCAM-1），靶向微泡造影剂还可非侵入性、准确地诊断及评估炎性肠病。

4.血栓

在血栓形成过程中，血管内膜受损，内皮下胶原暴露，激活血小板和凝血系统，血小板的黏附、活化以及纤维蛋白原介导血小板间的大量聚集在血栓形成过程中起着关键的作用。活化的血小板膜表面高浓度表达一些糖蛋白整合素受体，如血小板膜糖蛋白受体（GlycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa）、整合素受体等。MRX-408 脂质微泡（aerosomes）是一种GPⅡb/Ⅲa受体靶向造影剂，其表面连接了一个可以被GPⅡb/Ⅲa受体精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸结合位点识别的寡肽序列，故可用于靶向性血栓显影。Unger等报道MRX-408脂质微泡可结合特异性寡肽，与活化血小板的GPⅡb/Ⅲa受体具有强的亲和力。显微镜下观察发现，微泡可特异性地结合到血凝块上，这些微泡不仅被血栓周边或表面摄取，而且吸收到血栓块的深部。该研究者认为，相对于陈旧性血栓，新鲜血栓有更多表达GPⅡb/Ⅲa受体的血小板，可黏附更多的微泡，因此，MRX-408可有助于新鲜与陈旧性血栓的鉴别。

5.动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）

AS的形成是动脉对血管内膜损伤作出炎症-纤维增生性反应的结果。从脂纹到纤维斑块和粥样斑块，乃至不稳定斑块的生成、破裂和血栓形成，始终都有各种炎症细胞和大量炎性递质参与。炎症反应中，内皮细胞表达细胞膜黏附蛋白免疫球蛋白、血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、ICAM-1和选择素 E、P、L（E-selection，P-selection，L-selection）家族等明显升高，因此，若以这些分子为靶点可实现对粥样硬化斑块的良好显影。Villanueva等利用构建的靶向ICAM-1的微泡，作用于培养的正常或由白介素活化的冠状动脉内皮细胞，荧光显微镜定量发现，靶向组内皮细胞ICAM-1微泡量是非靶向组的40倍。Kaufmann等以VCAM-1为靶点同样实现了对动脉粥样硬化区域的良好的靶向显影。李馨等建立腹主动脉粥样硬化兔模型，分别经兔外周静脉注射白蛋白微泡及携带CD54的ICAM-1单克隆抗体靶向造影剂，造影后血管内膜、粥样斑块峰值密度与造影前基值相比均有增加。携带CD54靶向造影剂与普通造影剂相比，对内膜及斑块有更强的靶向显影价值，免疫组织化学检测也验证了这一点，同时可发现普通造影剂所漏诊的弱回声斑块，从而提高超声诊断的敏感性。

6.肿瘤和新生血管

血管新生（angiogenesis）是指在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧和炎症等情况下，原有微血管内皮细胞经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程。整合素家族是一个内皮细胞膜蛋白家族，它是一种跨膜黏附受体，作为含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽的细胞外基质蛋白的黏附受体，能够控制肿瘤血管内皮细胞的增殖和存活。α_Vβ₃受体是整合素家族中最重要的一种分子，它在静息细胞内几乎不表达，在平滑肌细胞上也仅有少量的表达，而在肿瘤新生血管和肿瘤细胞中均高表达。因此，利用作用于α_Vβ₃的靶向微泡将可实现肿瘤新生血管的显影。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达与血管形成程度之间有紧密的联系。通常情况下，单独的VEGF表达水平处于静息状态，只有当它与血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）结合后才能发挥作用。其中，VEGFR-2是VEGF发挥功能的主要受体，在多种实体肿瘤中过度表达，其活性与肿瘤的转移和保持血管的完整性有关，是肿瘤新生血管内皮的分子标志物。因此，利用靶向作用于VEGFR-2的靶向微泡也可以实现肿瘤新生血管的显影。

Willmann等将携带抗VEGFR-2单抗的脂质微泡用于评价肿瘤血管新生，在成功复制大鼠胶质瘤和小鼠血管肉瘤模型的基础上，注入靶向和非靶向超声微泡，观察到在两种不同的肿瘤模型中靶向微泡的信号均要明显强于非靶向微泡。目前，双靶向微泡的制备已经取得了成功并应用于肿瘤血管新生的评价。Willmann等成功制备同时携带抗VEGFR-2单抗和抗α_Vβ₃单抗的双靶向微泡，并将其用于评价人卵巢癌模型。结果显示双靶向微泡的信号强度要明显强于二种不同的单靶向微泡。双靶向微泡造影剂的出现大大地提高了靶向超声分子成像识别肿瘤血管新生的敏感性，更加有利于肿瘤的早期发现和治疗效果的动态监测。Anna等通过复制小鼠乳腺癌2LMP细胞模型，成功将α_Vβ₃、P-选择素和VEGFR-2进行整合，通过超声分子成像多靶点微泡造影来评价早期肿瘤的抗血管生成治疗。

对于肿瘤性疾病来说，及早显示新生血管能早期发现肿瘤及微小转移灶，有利于肿瘤患者的治疗；而动态监测新生血管则可以评估抗肿瘤治疗的效果。有研究经静脉注入表面偶联单克隆抗体或Echistatin分子（一种可与表达在新生血管内皮细胞特定分子结合的解离素）的脂质体超声微泡，然后通过活体显微镜发现，Echistatin和单抗包被的脂质体微泡紧密黏附在微血管内皮上。在此基础上，他们给大鼠皮下注射由肿瘤分泌的胶状物质，造模10天后，注入靶向超声微泡造影剂，超声发现微泡量与新生血管数密切相关。

虽然超声微泡技术具有其他技术无法比拟的优点，如无创性或微创性、靶向性和可重复使用性等。但是，这种新技术目前仍有许多有待解决的问题：①超声微泡与靶向分子的偶联技术尚需进一步完善，这是超声分子影像研究的基础；②改善微泡化学组成，以延长微泡在靶器官中的停留时间；③进一步阐明靶向微泡的声学特性；④超声分子探针的安全性及如何向临床应用转化的问题；⑤拓展靶向超声微泡的应用领域。尽管目前还存在许多难题，但随着超声分子影像学的发展及多学科的交叉融合，超声造影剂将在疾病的诊断和治疗中发挥更大的作用，具有广阔的应用前景。

第二节　超声靶向破坏微泡释放药物

药物携载近年来迅速发展，是目前临床医学重要的研究领域之一。目前大多数靶向制剂尚处于试验研究阶段，其发展还有很多问题有待解决，如脂质体靶向系统存在靶向分布不理想，自身稳定性欠佳等缺点；磁性制剂尚处于研究开发阶段，使用磁场不易聚焦，很难达到靶向要求等。因此，如何将治疗药物安全、高效、靶向性地导入人体内特定器官、组织并在靶细胞内起作用是目前研究重点。超声波具有良好的组织穿透性，且能够灵活聚焦于病灶局部，利用其进行药物靶向释放的研究日益备受关注。

一、超声靶向破坏微泡释放药物的机制

超声靶向破坏微泡（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）释放药物是近些年研究的热点。超声介导药物靶向递送系统是局部或全身给予携带药物或基因的微泡，当超声微泡到达特定组织时，超声波破坏携带药物的微泡，通过空化效应在靶器官局部释放药物，达到定向治疗的目的（图4-1，图4-2）。

超声波空化效应是指存在于液体中的微气核空化泡在声波的作用下振动，当声压达到一定值时发生的生长和崩溃的动力学过程。空化效应分为两类：稳态空化效应和瞬态空化效应。稳态空化指微泡在超声作用下沿着平衡半径左右多次振荡，在每一个振动微泡周围的不均一环状区域将产生直径较小的稳定、均匀的微流，在此过程中无微泡的破裂。随声强的增大，空化核将随着超声周期相而膨胀、收缩及爆破，最后在瞬间内爆阶段，微泡释放出内部聚集的巨大能量，并伴有强大冲击波、高速微射流和自由基的产生，此为瞬态空化。研究表明，瞬态空化作用通过以下机制促进药物释放：

（一）提高细胞膜通透性

细胞膜是治疗药物进入细胞需要克服的屏障之一，细胞膜通透性改变是药物治疗的前提。超声照射可使组织和液体内存在的微气泡发生空化效应，在细胞膜上产生一过性的空隙，即声孔效应，这种小孔有利于药物进入细胞内，增强药物疗效。超声造影剂微泡的加入增强空化效应，降低空化阈值，因而明显增加药物进入细胞。

（二）提高血管通透性

空化作用通过以下不同机制改变血管通透性：①在血管内皮细胞表面形成瞬态孔隙即声孔作用，促进大分子吸收进入细胞内；②破坏血管内皮完整性，使大分子通过细胞间隙进行转运；③通过超声辐照产生的热效应增加磷脂双分子膜的流动性；④刺激细胞内吞摄取作用，促进细胞内递送。

（三）增强细胞内吞和细胞外泌作用

微泡空化对细胞内反应的影响常被忽略，由于人们普遍认为细胞膜声孔效应和机械破坏血管完整性为促进药物靶向递送的主要机制。然而最近研究表明，与细胞接触的振动微泡产生的机械扰动可改变细胞膜电位，刺激细胞内吞作用。

二、UTMD释放药物影响因素

UTMD释放药物受以下因素的影响：①微泡携带药物的方式，即药物是否与微泡混合或负载于微泡上；②微泡和药物给药途径；③超声参数；④治疗的时相性。

（一）微泡与药物直接混合

微泡与药物混合注射是UTMD介导药物释放的方法之一，其优点之一是可以应用市场上可以购买得到的临床级微泡如Optison，Definity，Lumason和SonoVue。Sorace等以Definity混合化疗药物注射于小鼠乳腺癌模型后进行超声辐照（1.0MHz，脉冲重复时间为5秒，机械指数0.5，20%占空比，辐照时间5分钟）。治疗3周后，肿瘤显示40%抑制率，与单纯药物治疗组相比坏死率更高。Wang等2013年注射混合了自杀基因（HSV-TK）的SonoVue，超声辐照（机械指数1.2，辐照时间10分钟）后，小鼠卵巢癌TKmRNA表达上升47倍，凋亡率上升2倍。

直接混合的缺点在于：①一些药物或RNA会快速降解；②有可能会增加其他器官的毒性（而不是聚集于普通微泡常被清除的脏器，如肝脏或脾脏）。为了解决这个难题，人们试图修饰超声微泡表面，采取不同途径将治疗药物连接于微泡或整合入微泡的膜内。比如药物包被于膜内，溶解于气体和膜之间的脂质层或与微泡表面相连。然而，这种方法药物负载率常常很低。为了提高负载率，人们试图将包载了药物的脂质体或纳米微泡连接于微泡膜上。

（二）药物和微泡的给药途径

药物和微泡的给药途径包括静脉注射，瘤内注射以及腹腔注射，瘤内和腹腔注射，可以得到局部高浓度释放，但是具有创伤性。

1.大多数动物实验中微泡和药物都是经静脉注射。缺点是可能存在潜在的全身毒性，如果是基因转染，可能导致药物在循环里面的迅速降解。这两个缺点都可以通过将药物直接连接于微泡或将药物负载于纳米颗粒而得以克服。全身给药的另外一个缺点为对于一些乏血供肿瘤，药物释放效率可能较低，因为这一途径有赖于肿瘤内有足够的血管以保证足够量的微泡和药物悬浮于靶区域。

2.瘤内注射早期的动物实验证实微泡辐照后可以提高药物释放。主要优点在于该方法局部药物释放浓度高，全身毒性作用低。但是，位置较深的病灶无法接受局部注射，而且该方法为有创性。

3.腹腔注射适合腹腔内病变或伴随腹腔转移的病灶。微米级微泡经腹腔注射后可以在腹腔内稳定存在较长时间而被淋巴系统清除。Pu等向小鼠卵巢癌腹腔转移模型注射针对LHRH受体的载紫杉醇微泡，微泡特异性结合于表达LHRH的肿瘤细胞，超声辐照后药物被选择性释放于肿瘤部位。该治疗方法造成高达2倍的细胞凋亡率，治疗组小鼠平均存活时间延长了37～47天，肿瘤血管生成减少了55%。

（三）超声辐照参数

很多研究成功应用临床超声显像设备进行了药物释放试验，但是药物释放效率各报道互不一致。目前尚无明确的超声辐照参数标准。到目前为止，用于药物释放的临床诊断用超声仪器尚无标准化的超声辐照参数，原因可能为这些仪器无法进行标准化的参数调节。这使得在这些仪器上无法进行系统化和定量的优化药物释放研究。优化超声辐照参数有助于提高治疗效果。为了确定有效释放的优化条件，一些研究应用可以自由设定超声参数的定制的超声设备，以比较药物释放结果，并且在体外细胞水平和整体动物水平均进行了大量参数试验。以下是文献报道的体内药物释放的参数条件：

1.超声频率

0.4～3MHz。造成空化效应所需要的压力域值随着频率的减低而减低。超声强度：0.3～3w/cm²。这一范围接近或高于诊断超声（0.1～100mW/cm²），但是低于高强度聚焦超声。这使得向肿瘤内释放药物时对正常组织的损伤最小化。

2.机械指数

0.2～1.9。机械指数的定义为负压峰值与中心频率平方根的比值，它指示发生空化效应的可能性。空化效应发生的可能性随超声强度的提高和频率的减低而增加，声场的机械指数也是临床超声诊断仪器的安全参数之一。FDA规定临床诊断超声机械指数上限为1.9。人们认为机械指数低于0.7不会发生空化效应。但是，微泡的存在致使发生空化效应的域值大大降低，这使得UTMD释放药物可以在机械指数低于1.9的水平得以实现。

3.占空比

＜ 1%～90%。占空比表示脉冲超声发射时间所占的比例。不同文献报道所用的占空比不一致，常常取决于所用的超声强度。总的来说，高占空比联合高强度可以产生热效应。因此，应用高强度超声时，占空比会减低以免产生热效应。

4.超声辐照持续时间

10秒～30分钟。持续时间需足够长以破坏微泡。但是，为安全起见，辐照时间应尽可能短以减轻对组织的损伤。大多数研究者采用过1～5分钟的辐照时间。

（四）治疗策略

治疗策略包括给药时间顺序，UTMD治疗时间，治疗时间和重复治疗周期之间的时间间隔可能对治疗效果产生巨大影响。由于UTMD在数秒和数小时提高通透性，治疗药物在超声辐照后的不同时间点给药会导致完全不同的治疗效果，比如Zhao等2012年针对乳腺癌小鼠的治疗中，在辐照前2小时，辐照后2小时或超声辐照的同时注射载阿霉素的脂质体。辐照后2小时给药组抑瘤率最低，这表明药物释放应于辐照后2小时以内进行。了解治疗窗口期对于UTMD治疗肿瘤至关重要。Liao等研究了治疗间隔时间长短对疗效的影响，研究以UTMD释放endostatin和calreticulin给皮下种植肝细胞癌模型，第一组动物每周辐照给药一次，第二组动物每天辐照给药，观察4周后发现第一组动物治疗效果显著好于第二组，因此研究认为血管生成抑制治疗每周一次较短时间高剂量更为有效。

三、UTMD释放药物的应用领域

（一）在心血管系统的应用

1.超声溶栓治疗

Slikkerveer等2012年在阿姆斯特丹开始了应用超声溶栓治疗ST段抬高型心肌梗死的临床试验研究。他们对10例初次发生ST段抬高型心肌梗死的患者以超声辐照微泡联合注射tPA进行了溶栓治疗，研究表明治疗有效，并且副作用发生率与安慰剂组没有显著差异。另有研究表明超声辐照微泡可以击碎冠脉和脑血管中的致病血栓。

2.抑制动脉新生内皮形成

在经皮介入治疗后数天和数周，主要的担忧是患者新生内皮的形成和动脉损伤部位的炎症，在这种情况下再狭窄的发生率高达25%～50%。日本学者应用UTMD释放细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）siRNA进行治疗，通过抑制ICAM-1，血管受损的小鼠显示有限的炎症反应和新生内皮形成。

（二）在肿瘤治疗中的应用

大量研究显示UTMD介导的药物释放可成功治疗不同肿瘤。这一技术可以提高肿瘤化疗效果，提高了药物在肿瘤内的生物学分布，扭转了一部分肿瘤的耐药。有人提出该技术可以作为肿瘤治疗的新的辅助手段。

1.增强抑瘤效果

大量研究表明UTMD释放药物可以提高抑瘤效果，抑制肿瘤生长，促进肿瘤凋亡和坏死，抑制血管生成，调节相关蛋白的表达。比如，Goertz等发现静脉注射化疗药物多西塔赛和微泡至前列腺癌肿瘤模型，辅以超声辐照，治疗后24小时肿瘤坏死率高于单纯多西塔赛治疗组4倍。UTMD释放多种药物可以进一步提高抑瘤效果，Yu等对皮下移植肝癌模型的研究表明，UTMD转染两种质粒HSV-TK/GCV和基质金属蛋白酶3组织抑制剂，与单一一种基因转染相比，抑瘤率提高30%。UTMD治疗转移性肿瘤同样有效，Park等的研究表明，UTMD经颅释放曲妥珠单抗，与单纯静脉注射曲妥珠单抗组比较，UTMD释放药物组可以提高动物生存时间，显著抑制肿瘤生长，有些动物甚至可以完全缓解。

2.减轻化疗药物毒性

化疗最为严重的副作用是其全身毒性，包括心脏毒性和骨髓抑制。Cochran等以UTMD辐照负载阿霉素的微泡于皮下种植肝脏肿瘤模型，与同剂量直接注射药物组相比，肿瘤组织内药物浓度显著增高，心肌组织内药物浓度减低50%。这一研究结果具有很好的临床应用前景：一方面可能减低患者全身副反应，另一方面可以减轻一些需要应用昂贵化疗药物治疗患者的经济负担。

3.扭转耐药

对于很多肿瘤，药物抵抗是导致治疗失败的常见原因。尽管吉西他滨是胰腺癌的一线化疗药，但75%的胰腺癌患者对吉西他滨耐药。乳腺癌中，高于60%～70%的肿瘤患者对蒽环类化疗药物耐药。耐药常常是由于肿瘤细胞部分受体表达上调，抑制细胞对药物的摄取，将药物自胞质泵出细胞外。Yan等研究发现UTMD释放药物可以显著下调乳腺癌细胞内p-糖蛋白（多药耐药相关蛋白泵）的表达。阿霉素耐药的MCF-7乳腺癌细胞经阿霉素脂质体微泡辐照后，细胞对阿霉素摄取增加，细胞核药物浓聚增加，药物释放减少，细胞内P-糖蛋白水平显著减低。

4.其他肿瘤治疗方案的辅助治疗

辅助化疗或放疗常常用于术后减少局部肿瘤复发和肿瘤转移。UTMD介导下将药物释放于手术切除面有可能成为减少肿瘤局部复发率的多模态治疗方法的一部分。Sorace等提出UTMD介导释放西妥昔单抗可以作为小鼠头颈部肿瘤手术切除后的辅助治疗措施，治疗后60天，UTMD释放药物组未出现复发，但是单纯手术全切后的动物66%出现复发。

（三）UTMD在神经系统的应用

血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）由脑毛细血管内皮细胞之间的紧密连接、基底膜以及毛细血管周围的星形胶质细胞突起构成，其中血管内皮细胞及其紧密连接是BBB的重要形态学基础。98%以上的治疗药物难以通过BBB进入脑内，只有极少部分具有高脂溶性和分子量小于400～500D小分子物质能穿过BBB。对于危及生命的中枢神经系统疾病如脑肿瘤、脑卒中、脊髓和脑部创伤、HIV感染等都没有有效的治疗方法。上述一些疾病可以用药物、酶、基因或者大分子生物科技产物如重组蛋白进行治疗，但是这些药物都不能顺利透过BBB。为促进中枢神经系统药物释放，人们试图以鞘内或脑室穿刺直接给药，或对药物进行化学修饰，改变分子量大小和电荷，但是前者技术操作要求较高，且为有创性，后者研究进展缓慢，均难以广泛应用于临床。

1.聚焦超声开放血脑屏障

以往文献中，可用于开放血脑屏障的超声波包括：聚焦超声、诊断超声（如经颅多普勒超声）和低频超声（如频率43kHz的超声波）。但以聚焦超声的应用最为广泛和深入。1995年，Vykhodtseva等观察不同参数下BBB的通透性改变及脑组织损伤情况。研究者发现高脉冲作用时间造成了出血和难以控制的组织崩解，并猜测这些BBB的破坏可能是由于空化效应所产生。随着研究的深入，Hynynen等提出了使用聚焦超声联合超声微泡Optison促使BBB的开放的新方法，研究表明该超声联合微泡对大脑组织的损伤微不足道。聚焦超声开放BBB的优势在于：在MRI影像设备的定位下，聚焦超声可以“瞄准”靶点区，注射超声微泡后精准开放目标区域血脑屏障和释放药物，而周围的脑组织却不受影响，最大限度地减少了药物的毒副作用；更重要的是，在适宜的参数下，聚焦超声联合微泡所引起BBB的开放，是暂时和可逆的，即可以多次、重复给药。

2.聚焦超声联合微泡开放BBB的时相

超声联合微泡辐照所致BBB的开放持续时间的长短因各种检测方法的不同而不尽相同。以光镜显示BBB开放区脑组织损伤情况和电镜检查毛细血管内皮细胞紧密连接的开闭提示BBB可持续开放72小时。早期的研究常采用经典的示踪剂伊文思蓝（分子量为961D）观察BBB开放情况，经静脉注射后的伊文思蓝立即与血浆白蛋白结合，形成伊文思蓝-白蛋白复合物（ESA），并在血液中持续存在数小时。由于ESA分子量大，不能透过正常的BBB，超声开放BBB后ESA通过BBB进入脑实质并使其染色，可应用分光光度计在最大吸收光谱635nm处检测脑组织中的伊文思蓝含量，判断并定量检测BBB开放的程度，有研究以此方法显示超声开放BBB的时间在15分钟至数小时。该方法优点在于血脑屏障开放区域蓝染，可直观显示BBB开放范围，缺点在于需处死动物后检测，无法在活体水平实时监测BBB开放。

增强MRI则能无创、实时监测BBB开放情况。在超声辐照后立即以MRI增强扫描（T₁相），超声辐照开放区可得以强化。Hynynen等以MRI增强显影的方法报告开放持续的时间长度不一，一般照射当时的信号增强最大，之后即开始衰减，至3小时后所测得的信号强度只有最初的10%～20%，说明此时BBB的完整性已开始恢复，至5小时后再次扫描未能看到BBB的开放增强，由此认为辐照5小时后BBB就已经完全恢复。但他另一组的研究报道在6小时后还可见到MRI增强，至24小时未见强化。McDannold等做了更长时间的监测，发现72小时乃至4周后都没有强化，这些研究说明了这种持续开放最长时间在24～72小时以内。另外，MRI监测UTMD开放血脑屏障需要磁共振兼容的超声辐照系统（图4-1）。

3.UTMD经颅释放药物种类

（1）UTMD开放BBB转运单克隆抗体：

抗体可以用于一些脑部疾病的治疗，比如针对人表皮细胞生长因子的单克隆抗体——曲妥珠单抗（赫赛汀），可以用于治疗乳腺癌脑部转移灶，抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗（美罗华）可以治疗恶性淋巴瘤，针对Aβ肽抗体可以扭转早期阿尔茨海默病遗传缺陷。但是这些药物因为分子量大，在中枢神经系统的应用受到限制。因此，如果采用静脉途径给药，UTMD开放BBB有望提高上述药物在局部的浓度。有研究以UTMD转运多巴胺D4受体抗体，在10ms的脉冲作用时间，脉冲重复频率1Hz，作用时间20秒，频率680kHz的条件辐照脑部，在超声波辐照区域的基底神经节的海马和小细胞内可以检测到抗体。同一研究小组使用相同的超声辐照参数，成功地以超声协同微泡促进赫赛汀透过BBB并于颅内释放。另有研究将Aβ肽抗体成功转运入TgCRND8阿尔茨海默病模型。

（2）转运化疗药物：

BBB开放有助于化疗药物在脑部肿瘤的靶向释放。关于化疗药物的转运，首次报道的是转运脂质体包裹的阿霉素，研究表明在10ms脉冲作用时间，PRF 1Hz，作用120秒，频率1.5MHz及1.7MHz辐照条件下，大鼠脑内辐照部位阿霉素浓度较对侧显著提高，脑组织内的药物浓度与微泡浓度呈线性相关，0.1ml/kg浓度下，组织中的药物浓度可以达到1 000ng/g，如果能够在肿瘤组织聚集，阿霉素浓度将足以产生临床治疗效果。

（3）转运基因：

对于很多中枢神经系统疾病，基因治疗具有非常好的临床应用前景。但是由于治疗基因分子量大无法穿过BBB，限制了该疗法在这一领域的研究与应用。为了证实超声微泡在中枢神经系统基因转染中的应用价值，Huang等以超声辐照微泡的方式将绿色荧光蛋白基因释放入小鼠脑内，发现EGFP在辐照区神经元胞质内表达，该区域仅见少许红细胞渗出，EGFP mRNA表达显著上调。研究表明UTMD可以成功将裸质粒DNA、病毒表达载体、siRNA寡核苷酸等转运入颅内。

UTMD辅助释放药物具有无创、可重复、不良反应小、靶向性强等优点，尽管很多体外试验和一部分体内动物试验证实UTMD释放药物能有效治疗肿瘤和心血管疾病，并且对优化治疗参数进行了探讨，但是是否可以应用于大动物甚至人类还不确定，尤其是一些声窗不好，易于出现衰减，位置较深的部位。另外，限制UTMD药物释放在临床应用的另外一个因素是安全性和实现实时监测的问题。尽管诊断超声联合微泡在临床诊断上的应用被认为是安全的，但是超声和微泡用于治疗的安全性还需要系统、深入的研究。少数动物试验研究采用了一些较为简单的观察指标，比如体重，进食习惯和死亡率，但在转化为临床应用前尚需要进行全面的毒性试验研究。

（张艳容）

参考文献

[1] Klibanov，AL. Ligand-carrying gas-filled microbubbles：ultrasound contrast agents for targeted molecular imaging. Bioconjug Chem，2005，16（1）：9-17.

[2] Wu W，Wang Y，Shen S，et al. In vivo ultrasound molecular imaging of inflammatory thrombosis in arteries with cyclic Arg-Gly-Asp-modified microbubbles targeted to glycoprotein IIb/IIIa. Invest Radiol，2013，48（11）：803-812.

[3] Wang H，Felt SA，Machtaler S，et al. Quantitative Assessment of Inflammation in a Porcine Acute Terminal Ileitis Model：US with a Molecularly Targeted Contrast Agent.Radiology，2015，276（3）：809-817.

[4] Su H，Du Y，Qian Y，et al. Targeted ultrasound contrast imaging of matrix metalloproteinase-2 in ischemiareperfusion rat model：ex vivo and in vivo studies. Mol Imaging Biol，2011，13（2）：293-302.

[5] Yin T，Wang P，Zheng R，et al. Nanobubbles for enhanced ultrasound imaging of tumors. Int J Nanomedicine，2012，7：895-904.

[6] Fan X，Wang L，Guo Y，et al. Experimental investigation of the penetration of ultrasound nanobubbles in a gastric cancer xenograft. Nanotechnology，2013，24（32）：325102.

[7] Wang L，Li L，Guo Y，et al. Construction and in vitro/in vivo targeting of PSMA-targeted nanoscale microbubbles in prostate cancer. Prostate，2013，73（11）：1147-1158.

[8] Gao Y，Hernandez C，Yuan HX，et al. Ultrasound molecular imaging of ovarian cancer with CA-125 targeted nanobubble contrast agents. Nanomedicine，2017，13（7）：2159-2168.

[9] Tang H，Zheng Y，Chen Y. Materials chemistry of nanoultrasonic biomedicine. Adv Mater，2017，29（10）：1604105.

[10] Liu J，Shang T，Wang F，et al. Low-intensity focused ultrasound（LIFU）-induced acoustic droplet vaporization in phase-transition perfluoropentane nanodroplets modified by folate for ultrasound molecular imaging. Int J Nanomed，2017，12：911-923.

[11] Yang L，Cheng J，Chen Y，et al. Phase-transition nanodroplets for real-time photoacoustic/ ultrasound dualmodality imaging and photothermal therapy of sentinel lymph node in breast cancer. Sci Rep，2017，7：45213.

[12] Min HS，Son S，You DG，et al. Chemical gas-generating nanoparticles for tumor-targeted ultrasound imaging and ultrasound-triggered drug delivery. Biomaterials 2016，108：57-70.

[13] Liu Z，Lammers T，Ehling J，et al. Iron oxide nanoparticle-containing microbubble composites as contrast agents for MR and ultrasound dual-modality imaging.Biomaterials，2011，32：6155-6163.

[14] Wang，Lihong V. Prospects of photoacoustic tomography. Med Phys，2008，35（12）：5758-5767.

[15] Fokong S，Siepmann M，Liu Z，et al. Advanced characterization and refinement of poly N-butyl cyanoacrylate microbubbles for ultra- sound imaging. Ultrasound Med Biol，2011，37（10）：1622-1634.

[16] Palmowski M，Morgenstern B，Hauff P，et al. Pharmacodynamics of streptavidin-coated cyanoacrylate microbubbles designed for molecular ultrasound imaging.Invest Radiol，2008，43（3）：162-169.

[17] Klibanov AL，Rasche PT，Hughes MS，et al. Detection of individual microbubbles of ultrasound contrast agents：imaging of free-floating and targeted bubbles.Invest Radiol，2004，39（3）：187-195.

[18] Deshpande N，Needles A，Willmann JK，et al. Molecular ultrasound imaging：current status and future directions. Clin Radiol，2010，65（7）：567-581.

[19] Willmann JK，Cheng Z，Davis C，et al. Targeted microbubbles for imagingtumor angiogenesis：assessment of whole-body biodistribution with dynamic micro- PET in mice. Radiology，2008，249（1）：212-219.

[20] Pochon S，Tardy I，Bussat P，Bettinger T，et al. BR55：a lipopeptide-based VEGFR2-targeted ultrasound contrast agent for molecular imaging of angiogenesis. Invest Radiol，2010，45（2）：89-95.

[21] Willmann JK，Paulmurugan R，Chen K，et al. US imaging of tumor angiogenesis with microbubbles targeted to vascular endothelial growth factor receptor type 2 in mice. Radiology，2008，246（2）：508-518.

[22] Pysz MA，Guracar I，Tian L，et al. Fast microbubble dwell-time based ultrasonic molecular imaging approach for quantification and monitoring of angiogenesis in cancer. Quant Imaging Med Surg，2012，2（2）：68-80.

[23] Wang S，Mauldin FW Jr，Klibanov AL，et al. Ultrasound-based measurement of molecular marker concentration in large blood vessels：a feasibility study. Ultrasound Med Biol，2015，41（1）：222-234.

[24] Rychak JJ，Klibanov AL，Ley KF，et al. Enhanced targeting of ultrasound contrast agents using acoustic radiation force. Ultrasound Med Biol，2007，33（7）：1132-1139.

[25] Frinking PJ，Tardy I，Théraulaz M，et al. Effects of acoustic radiation force on the binding efficiency of BR55，a VEGFR2-specific ultrasound contrast agent. Ultrasound Med Biol，2012，38（8）：1460-1469.

[26] Kaufmann BA，Lewis C，Xie A，et al. Detection of recent myocardial ischaemia by molecular imaging of P-selectin with targeted contrast echocardiography. Eur Heart J，2007，28（16）：2011-2017.

[27] Bettinger T，Bussat P，Tardy I，et al. Ultrasound molecular imaging contrast agent binding to both E- and P-selectin in different species. Invest Radiol，2012，47（9）：516-523.

[28] Weller GE，Lu E，Csikari MM，et al. Ultrasound imaging of acute cardiac transplant rejection with microbubbles targeted to intercellular adhesion molecule-1. Circulation，2003，108（2）：218-224.

[29] Bachmann C，Klibanov AL，Olson TS，et al. Targeting mucosal addressin cellular adhesion molecule（MAdCAM）-1 to noninvasively image experimental Crohn’s disease.Gastroenterology，2006，130（1）：8-16.

[30] Weller GE，Villanueva FS，Tom EM，et al. Targeted ultrasound contrast agents：in vitro assessment of endothelial dysfunction and multi-targeting to ICAM-1 and sialyl Lewisx. Biotechnol Bioeng，2005，92（6）：780-788.

[31] Sorace AG，Warram JM，Umphrey H，et al. Microbubble-mediated ultrasonic techniques for improved chemotherapeutic delivery in cancer. J Drug Target，2012，20（1）：43-54.

[32] Zhang Y，Tan H，Bertram EH，et al. Non-Invasive，Focal Disconnection of Brain Circuitry Using Magnetic Resonance-Guided Low-Intensity Focused Ultrasound to Deliver a Neurotoxin. Ultrasound Med Biol，2016，42（9）：2261-2269.

[33] Zhang Y，Liao C，Qu H，et al. Testing Different Combinations of Acoustic Pressure and Doses of Quinolinic Acid for Induction of Focal Neuron Loss in Mice Using Transcranial Low-Intensity Focused Ultrasound. Ultrasound Med Biol，2019，45（1）：129-136.

[34] Wang XL，Zhao XY，Li S，et al. A novel plasmid and SonoVue formulation plus ultrasound sonication for effective gene delivery in nude mice. Life Sci，2013，93（16）：536-542.

[35] Greco A，Di Benedetto A，Howard CM，et al. Eradication of therapy-resistant human prostate tumors using an ultrasound-guided site-specific cancer terminator virus delivery approach. Mol Ther，2010，18（2）：295-306.

[36] Haag P，Frauscher F，Gradl J，et al. Microbubbleenhanced ultrasound to deliver an antisense oligodeoxynucleotide targeting the human androgen receptor into prostate tumours. J Steroid Biochem Mol Biol，2006，102（1-5）：103-113.

[37] Carson AR，McTiernan CF，Lavery L，et al. Ultrasoundtargeted microbubble destruction to deliver siRNA cancer therapy. Cancer Res，2012，72（23）：6191-6199.

[38] Wang DS，Panje C，Pysz MA，et al. Cationic versus neutral microbubbles for ultrasound-mediated gene delivery in cancer. Radiology，2012，264（3）：721-732.

[39] Sirsi SR，Borden MA. State-of-the-art materials for ultrasound-triggered drug delivery. Adv Drug Deliv Rev，2014，72：3-14.

[40] Fukumura D，Jain RK. Tumor microenvironment abnormalities：causes，consequences，and strategies to normalize. J Cell Biochem，2007，101（4）：937-949.

[41] Iwanaga K，Tominaga K，Yamamoto K，et al. Local delivery system of cytotoxic agents to tumors by focused sonoporation. Cancer Gene Ther，2007，14（4）：354-363.

[42] Duvshani-Eshet M，Benny O，Morgenstern A，et al.Therapeutic ultrasound facilitates antiangiogenic gene delivery and inhibits prostate tumor growth. Mol Cancer Ther，2007，6（8）：2371-2382.

[43] Pu C，Chang S，Sun J，et al. Ultrasound-mediated destruction of LHRHa-targeted and paclitaxel-loaded lipid microbubbles for the treatment of intraperitoneal ovarian cancer xenografts. Mol Pharm，2014，11（1）：49-58.

[44] Kotopoulis S，Delalande A，Popa M，et al. Sonoporation-enhanced chemotherapy significantly reduces primary tumour burden in an orthotopic pancreatic cancer xenograft. Mol Imaging Biol，2014，16（1）：53-62.

[45] Kohane DS，Tse JY，Yeo Y，et al. Biodegradable polymeric microspheres and nanospheres for drug delivery in the peritoneum. J Biomed Mater Res A，2006，77（2）：351-361.

[46] Tsai M，Lu Z，Wang J，et al. Effects of carrier on disposition and antitumor activity of intraperitoneal Paclitaxel. Pharm Res，2007，24（9）：1691-1701.

[47] Newman CM，Bettinger T，Gene therapy progress and prospects：ultrasound for gene transfer. Gene Ther，2007. 14（6）：465-475.

[48] Yu BF，Wu J，Zhang Y，et al. Ultrasound-targeted HSVtk and Timp3 gene delivery for synergistically enhanced antitumor effects in hepatoma. Cancer Gene Ther，2013，20（5）：290-297.

[49] Sonoda S，Tachibana K，Uchino E，et al. Inhibition of melanoma by ultrasound-microbubble-aided drug delivery suggests membrane permeabilization. Cancer Biol Ther，2007，6（8）：1276-1283.

[50] Ghoshal G，Swat S，Oelze ML. Synergistic effects of ultrasound-activated microbubbles and doxorubicin on short-term survival of mouse mammary tumor cells.Ultrason Imaging，2012，34（1）：15-22.

[51] Apfel RE，Holland CK. Gauging the likelihood of cavitation from short-pulse，low-duty cycle diagnostic ultrasound. Ultrasound Med Biol，1991，17（2）：179-185.

[52] Dubinsky TJ，Cuevas C，Dighe MK，et al. High-intensity focused ultrasound：current potential and oncologic applications. AJR Am J Roentgenol，2008，190（1）：191-199.

[53] Leslie TA，Kennedy JE. High-intensity focused ultrasound principles，current uses，and potential for the future. Ultrasound Q，2006，22（4）：263-272.

[54] O’Brien WD Jr. Ultrasound-biophysics mechanisms.Prog Biophys Mol Biol，2007，93（1-3）：212-255.

[55] Zhao X，Zhang J，Tong N，et al. Protective effects of berberine on doxorubicin-induced hepatotoxicity in mice.Biol Pharm Bull，2012，35（5）：796-800.

[56] Liao ZK，Tsai KC，Wang HT，et al. Sonoporation-mediated anti-angiogenic gene transfer into muscle effectively regresses distant orthotopic tumors. Cancer Gene Ther，2012，19（3）：171-180.

[57] Grossman R，Tyler B，Hwang L，et al. Improvement in the standard treatment for experimental glioma by fusing antibody Fc domain to endostatin. J Neurosurg，2011，115（6）：1139-1146.

[58] Slikkerveer J，Kleijn SA，Appelman Y，et al. Ultrasound enhanced prehospital thrombolysis using microbubbles infusion in patients with acute ST elevation myocardial infarction：pilot of the Sonolysis study. Ultrasound Med Biol，2012，38（2）：247-252.

[59] Rubiera M，Ribo M，Delgado-Mederos R，et al. Do bubble characteristics affect recanalization in stroke patients treated with microbubble-enhanced sonothrombolysis.Ultrasound Med Biol，2008. 34（10）：1573-1577.

[60] Reis ED，Roque M，Dansky H，et al. Sulindac inhibits neointimal formation after arterial injury in wild-type and apolipoprotein E-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（23）：12764-12769.

[61] Goertz DE，Todorova M，Mortazavi O，et al. Antitumor effects of combining docetaxel（taxotere）with the antivascular action of ultrasound stimulated microbubbles.PLoS One，2012，7（12）：52307.

[62] Park EJ，Zhang YZ，Vykhodtseva N，et al. Ultrasoundmediated blood-brain/blood-tumor barrier disruption improves outcomes with trastuzumab in a breast cancer brain metastasis model. J Control Release，2012，163（3）：277-284.

[63] Rahman AM，Yusuf SW，Ewer MS，et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity and the cardiac-sparing effect of liposomal formulation. Int J Nanomedicine，2007，2（4）：567-583.

[64] Cochran MC，Eisenbrey JR，Soulen MC，et al. Disposition of ultrasound sensitive polymeric drug carrier in a rat hepatocellular carcinoma model. Acad Radiol，2011，18（11）：1341-1348.

[65] Ducreux M，Rougier P，Fandi A，et al. Effective treatment of advanced biliary tract carcinoma using 5-fluorouracil continuous infusion with cisplatin. Ann Oncol，1998，9（6）：653-656.

[66] Carey LA，Perou CM，Livasy CA，et al. Race，breast cancer subtypes，and survival in the Carolina Breast Cancer Study. JAMA，2006，295（21）：2492-2502.

[67] Yan F，Li L，Deng Z，et al. Paclitaxel-liposome-microbubble complexes as ultrasound-triggered therapeutic drug delivery carriers. J Control Release，2013，166（3）：246-255.

[68] Sorace AG，Korb M，Warram JM，et al. Ultrasoundstimulated drug delivery for treatment of residual disease after incomplete resection of head and neck cancer.Ultrasound Med Biol，2014，40（4）：755-764.

[69] Vykhodtseva NI，Hynynen K，Damianou C. Histologic effects of high intensity pulsed ultrasound exposure with subharmonic emission in rabbit brain in vivo. Ultrasound Med Biol，1995，21（7）：969-979.

[70] Tempany CM，Stewart EA，McDannold N，et al. MR imaging-guided focused ultrasound surgery of uterine leiomyomas：a feasibility study. Radiology，2003，226（3）：897-905.

[71] Hynynen K，McDannold N，Sheikov NA，et al. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for transskull sonications. Neuroimage，2005，24（1）：12-20.

[72] McDannold N，Vykhodtseva N，Raymond S，et al.MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound：histological findings in rabbits.Ultrasound Med Biol，2005，31（11）：1527-1537.

[73] Kinoshita M，McDannold N，Jolesz FA，et al. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochem Biophys Res Commun，2006，340（4）：1085-1090.

[74] Kinoshita M，McDannold N，Jolesz FA，et al. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（31）：11719-11723.

[75] Jordao JF，Ayala-Grosso CA，Markham K，et al. Antibodies targeted to the brain with image-guided focused ultrasound reduces amyloid-beta plaque load in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer’s disease. PLoS One，2010，5（5）：10549.

[76] Treat LH，McDannold N，Vykhodtseva N，et al. Targeted delivery of doxorubicin to the rat brain at therapeutic levels using MRI-guided focused ultrasound. Int J Cancer，2007，121（4）：901-907.

[77] Huang Q，Deng J，Xie Z，et al. Effective gene transfer into central nervous system following ultrasound-microbubbles-induced opening of the blood-brain barrier.Ultrasound Med Biol，2012，38（7）：1234-1243.

[78] Alonso A，Reinz E，Leuchs B，et al. Focal Delivery of AAV2/1-transgenes Into the Rat Brain by Localized Ultrasound-induced BBB Opening. Ann Neurosci，2014，21（1）：22.

[79] Burgess A，Huang Y，Querbes W，et al. Focused ultrasound for targeted delivery of siRNA and efficient knockdown of Htt expression. J Control Release，2012，163（2）：125-129.