第三节 群体反应性抗体检测

群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）检测的是患者血清中针对人白细胞抗原（HLA）所产生的一系列抗体。PRA检测的方法有很多，如标准补体依赖的细胞毒性（CDC）试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞仪检测 PRA法（FLOW-PRA）等。目前国内最多使用的是应用ELISA方法进行PRA的检测。

【检测方法】

1.标准补体依赖性细胞毒试验

将已知抗原的淋巴细胞通过特殊处理，以固定的细胞含量事先点在微孔板上。应用时，将患者血清点在细胞板上，经过一段时间的孵育（90分钟）及补体的参与，如患者血清中含有与淋巴细胞表面特异性结合的抗体，可发生细胞溶解作用，根据细胞的溶解程度判断患者的免疫状态及HLA抗体的特异性。

2.酶联免疫吸附试验PRA检测

将事先纯化的包括当地人种绝大部分的HLA特异性抗原预先包被在检测板上，利用酶联免疫的原理，将患者待检血清加到此种抗原板上，孵育一定时间后，加入酶标记的抗人IgG或IgM的单克隆抗体，再加入酶作用的底物显色，根据颜色的深浅，可测定出HLA抗体的特异性和滴度。

目前实验室采用的ELISA方法，包括PRA-STAT、LAT以及LATM技术，其中LATM技术具有快速、简捷，价格低廉并能同时测出Ⅰ类和Ⅱ类抗体的优点，但该技术不能确定抗体水平和分辨特异性，PRA-STAT技术对Ⅱ类抗体的分辨存在一定困难，而LAT技术所需要的活淋巴细胞运输与保存不便。在酶联免疫吸附试验中，不同的试剂制造商可能采用不同的cutoff值计算法和结果判读方式，因此方法学上亟待标准化。

3.流式细胞仪检测PRA法（FLOW-PRA）

采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测PRA，包括普通流式细胞仪分析方法（flow cytometric crossmatch，FCXM）和免疫磁珠流式细胞仪分析方法（flow PRATMbeads）两种。1983年FCXM方法开始应用于HLA抗体的筛选，可分为T细胞FCXM和B细胞FCXM，该技术具有较高的敏感性，但特异性有争议，导致排除掉了一些可能的供者，而且重复性不稳定，同时该技术难以检测到HLA-Ⅱ抗体；FCXM操作繁琐、技术难度大，这对该技术在一般实验室推广带来一定的障碍。Flow PRATMbeads技术是该领域的最新进展。

Flow PRATMbeads技术是基于荧光流式细胞仪和免疫标记技术相结合的一项免疫学技术，它有机地整合了有色微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则。该方法采用单克隆抗体技术从EB病毒转染的细胞株中纯化HLA抗原，包括所有常见的和稀有的HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原。抗原分别包被在数十个微颗粒免疫磁珠上（30个Ⅰ类磁珠和30个Ⅱ类磁珠）。这些颗粒珠与待检血清孵育一段时间后与带有荧光标记的抗人IgG抗体结合，通过流式细胞仪可检测出血清标本中HLA抗体的特异性及强度。为了减少血清背景因素的影响，Flow PRATMbeads技术利用混在其中的能发出特异荧光却不带HLA抗原的控制小球（Flow PRA control beads），来消除血清背景荧光的干扰。

该技术能够实现应用1个试剂同时检测1份标本中1～100个指标，极大地简化了临床检测程序，减少了临床检测成本，不仅能检测出PRA含量，还能指定PRA的种类，具有灵敏度高、特异性好、自动化、智能化并且简便、省时等优点。目前仍存在所需仪器比较昂贵的问题，已有较大的实验室将该技术作为常规方法用于PRA的检测。

【临床意义】

PRA是检测一组特定HLA反应抗体。临床HLA配型（检测HLA抗原）和PRA百分比（检测HLA抗体）是影响肾移植存活率的主要因素。HLA配型工作在我国的大中型肾移植中心已经列为常规检测项目，HLA抗体的检测也于1998年开始在大的器官移植中心开展，尤其是二次以上的器官移植患者、反复输血患者和有过妊娠史的女性患者，PRA检测能帮助临床医生系统地了解其体内的抗体水平并及时有效地选择器官和决定移植时机，可降低术后超急性排斥和急性排斥反应的发生率，提高移植肾的存活率。

移植物受者体内含有高水平循环抗HLA抗体称为致敏。根据抗体水平的高低，可分为未致敏（PRA 0～10%）、轻度致敏（PRA>11%～20%）、中度致敏（PRA 21%～40%）和高度致敏（PRA>40%）。致敏抗体与肾移植超急性排斥反应、移植物功能延迟、急性排斥反应和移植物存活降低有关。

根据受者体内的HLA抗体的水平和性质，选择移植器官、决定移植手术的时机。HLA抗体阳性（>10%）的受者，移植物存活率明显低于抗体阴性（<10%）受者，而抗体>40%的受者，存活率又明显低于抗体水平11%～40%的受者。>80%的强阳性者公认为是肾移植的禁忌证，除非找到HLA相配的供肾。对于抗体阳性的受者，需采用适当的治疗方法改善机体的免疫状态，待抗体水平降到允许范围后再考虑移植。HLA抗体阳性的受者，移植前一定要行交叉配型。确定抗体的特异性，避免应用具有相应靶抗原的供体器官。如受者体内存在HLA-A11特异性抗体时，应避免选择具有HLA-A11抗原的供体器官。

由于抗体的波动性，应定期检测，一般为每月检测一次。尤其是对于首次移植失功、术前有输血史和妊娠史的受者，更应密切监测。移植后HLA抗体水平的监测，有助于判断机体的免疫状态，帮助调整免疫治疗方案及指导免疫抑制剂的应用。

【致敏受者的处理】

1.预防对策

针对致敏的主要原因，采取相应的预防措施，最大限度地减少致敏的发生是最根本、最有效的途径。

（1）术前输血：

鉴于输血引起的致敏效应远远大于输血效应、新型免疫抑制剂联合应用的效果使目前的输血效应基本消失，因此，如无特殊需要，应避免移植前任何时间输血或输入血液成分。对术前贫血的处理采用EPO治疗。

（2）育龄期妇女：

采取计划生育和有效的节育措施，避免反复的妊娠、流产，尤其应避免多次分娩。

（3）严格掌握首次移植的适应证：

特别是免疫学方面的筛选应引起国内移植医师的高度重视。因为目前引起致敏的首要原因是曾有移植史，尤其是移植物免疫失功史。措施包括挑选HLA相容的供肾、定期检测PRA水平、规范交叉配型的方法以及合理应用免疫抑制剂等。尽最大努力减少首次移植物免疫原因的排斥反应和失功。

（4）再次移植：

应避免HLA的重复错配，尤其是HLA-DR抗原的重复错配。

（5）检测移植受者抗体特异性：

筛选出抗HLA-IgG抗体并确定其特异性具有重要意义。抗HLA-IgG抗体包括Ⅰ类抗体和Ⅱ类抗体。现有的临床研究显示，Ⅰ类抗体对移植物的影响是明确的，既影响早期、短期存活和排斥反应，也影响其长期存活。Ⅱ类抗体的作用尚有争论，有资料显示，其对移植物早期存活和排斥反应影响不明显，可能对长期存活不利。

确定抗HLA-IgG抗体特异性的另一个重要性在于挑选供体时，通过避免选择含有相应靶抗原的供肾，使移植获得成功。如肾移植致敏受者的抗体特异性为HLA-A11、DR7，在挑选供肾时，不要选择具有HLA-A11、DR7抗原的供肾。这样，特异性抗体就失去了靶细胞，避免了对移植物的攻击和破坏作用。

2.处理措施

随着临床器官移植的进展，目前处理抗体的技术方法有多种：两次血浆分离（DFPP）或蛋白A免疫吸附（IA）直接清除抗体，丙种球蛋白静脉输注，受体脾脏或移植物切除，抗CD52单抗克隆抗体（Campath-1H）或抗CD20单抗克隆抗体（Rituximab）等单抗克隆抗体的应用，以及移植前吗替麦考酚酯、西罗莫司等免疫抑制剂的应用，都提供了清除抗体的不同有效方法。

（1）血浆置换：

血浆置换是将患者的血液抽出，分离出血浆和细胞成分，去掉血浆，而将细胞成分和所需补充的白蛋白、新的血浆回输体内，以达到去除患者体内致敏抗体的目的。

（2）免疫球蛋白：

近年来有报道运用静脉注射大剂量免疫球蛋白的免疫调节作用来降低高致敏患者的敏感性。本法可使HLA-Ⅰ类抗体的反应性下降33%。对静脉注射小剂量的免疫球蛋白不起作用的患者，加大剂量（自2g/kg增至3g/kg）可奏效。静脉注射免疫球蛋白的作用机制，是通过受体介导作用，抑制了T细胞激活和抑制抗体产生。但是对丙种球蛋白处理抗体和治疗自身免疫性疾病的作用机制，目前尚无完整的解释。

（3）免疫吸附：

免疫吸附是利用金黄色葡萄球菌壁上的蛋白A具有人类Ig受体的特性，以达到体内相应致敏抗体目的。其原理是将蛋白A和基质按一定比例和密度混合后制成吸附柱，当患者血浆通过时，基质中蛋白A可与血浆中致敏性抗体特别是IgG型抗体结合。这是一种可逆性、pH敏感的结合，将pH降至2.3～2.5时，蛋白A与所结合的抗体解离，抗体被洗脱清除，将pH恢复至7.0时，蛋白A又恢复吸附能力，这样可不断重复循环吸附抗体，从而达到缓解和治疗疾病的目的。采用IA能迅速清除患者体内抗HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ抗体，降低PRA水平，提高移植物存活率。