第五节 免疫耐受
免疫耐受是指抗原特异性淋巴细胞在发育或分化过程中被阻断而造成的免疫无反应性。正常个体中有成熟的T淋巴细胞，可以识别自身抗原。在淋巴细胞发育过程中，免疫系统去除了自身反应性T细胞克隆，自身耐受在胸腺得以建立而在外周得以维持。如果能造成宿主对移植抗原的免疫耐受，不仅可以避免排斥，而且可以保持机体正常防御功能，它将是解决器官移植的最佳途径。
早在20世纪50年代，就有人尝试用脾细胞注入胚胎或初生小鼠以诱导移植耐受。早期发现耐受性可因输入已被供者致敏的同系动物的淋巴样细胞而消除，当时认为这种耐受是由于受者体内对抗原应答的免疫细胞被灭活的结果，即中枢性免疫衰竭，随着研究的深入，发现耐受性也是主动免疫反应的结果。其原因为：①耐受性并非终生维持，随着抗原的消失，动物逐渐恢复对该抗原的应答能力；②即使在新生时已诱发耐受性的动物，仍可测出微弱的细胞、体液免疫反应；③在产生耐受性的动物体内发现一种抑制细胞，将该细胞输给其他动物，可使后者亦产生对原移植的耐受。因此，免疫耐受实质是某些抑制性细胞抑制了免疫活性细胞所致。
免疫耐受可分为完全耐受和部分耐受，完全耐受是指中枢性免疫抑制造成对移植物的细胞、体液免疫反应完全缺乏，即所谓“经典耐受”，它的产生有赖于诱导抗原的持续作用。部分耐受指对移植物起反应的细胞和体液因素呈不同程度的低反应状态。在这种情况下，移植物虽可较长期存活，但最终会因慢性排斥反应而毁坏。
诱导免疫耐受的方法有：①新生时耐受，动物在胚胎或出生时，因免疫活性细胞的功能尚未成熟，抑制性细胞功能较强，容易诱发获得性耐受。②成年期耐受，成年期免疫系统已发育成熟，诱发耐受难度较大，但更具有实际意义，常用的方法有以下几种：①抗淋巴细胞血清加骨髓输入，70年代末报道的动物实验中，在小鼠皮片移植前后用抗淋巴细胞血清处理受者并输入供者的骨髓细胞，能显著延长皮片的存活期。如先切除受者胸腺，就有可能长期存活；②放射线照射加骨髓输入法；③大剂量多次注入抗原和PHA等。
目前，在动物模型中，已能成功诱导对移植抗原的耐受。可通过胸腺形成中枢耐受，也可通过从胸腺游移出的淋巴细胞形成外周耐受。可通过激活诱导的凋亡而剔除对某一抗原反应的T细胞克隆，从而形成耐受。如，角膜是免疫豁免位点，FasL的表达可促使浸润的Fas阳性淋巴细胞产生凋亡，从而阻断免疫反应。但是，诱导人体对特定外来抗原耐受而继续保持对其他外来抗原的免疫反应，仍是一具有挑战性的课题。
在胸腺T细胞成熟过程的适当时段接触抗原，可导致针对特定抗原T细胞克隆的剔除，如同自身反应性克隆。这需要有完整的外周免疫系统，因而免疫抑制治疗可逆转或阻断免疫耐受的产生。
在实验模型中，中枢耐受可导致外来淋巴细胞参与宿主循环而不受攻击，这叫“嵌合”。嵌合的维持，甚至少量细胞嵌合（称为“微嵌合”），不仅标志着耐受状态，而且在外周耐受的维持中也很重要。在免疫抑制状态（常是经放射照射）下，输注供者造血干细胞，可在成熟的免疫系统中诱导嵌合状态。在实验动物中，全身照射后进行骨髓移植或干细胞移植，可造成嵌合状态。但这在临床应用上受到限制，因为常发生致死性的移植物抗宿主病（GVHD）。在大鼠和低等动物中，进行全淋巴结照射，包括免疫器官和脾，可诱导嵌合和免疫耐受而不发生GVHD，治疗Hodgkin病，但尚未用于人类。
在供者细胞输注时用多克隆或单克隆抗淋巴细胞抗体以诱导嵌合，或对供者和受者骨髓均进行微量照射。在动物模型中，移植前输注供者特异性血或骨髓细胞，可导致MHC-Ⅰ或Ⅱ类抗原错配的移植物长期存活。由此可见，可以在不用免疫抑制剂的情况下使免疫系统耐受移植组织。在耐受的维持中需要移植物或嵌合细胞中持续存在同种异体抗原。
有关抗原特异性耐受的机制正在动物模型中进行探索。在用多克隆抗T细胞抗体并骨髓移植的动物模型中，可鉴定出抑制免疫反应的T细胞克隆，称为veto细胞。用供者MHC分子多态性区域肽诱导特异性T细胞耐受的研究正在进行中。CTLA-4Ig是一种重组融合蛋白，含CTLA-4的胞外区并与IgG1的稳定区相连，可阻断CD28介导的共刺激信号，阻断移植物B7分子和受者CD28分子间的作用。CTLA-4与B7的亲和力远高于CD28，因而是B7-CD28作用的高效抑制因子。在缺乏CTLA-4的小鼠中，可由于辅助性T细胞增殖而迅速产生致死性的淋巴增殖病。在TCR-MHC作用时抑制共刺激信号可产生T细胞无能状态。CTLA-4Ig输注可抑制体内抗同种异体移植物的抗体和T细胞反应。
此外，在动物模型中，阻断另一条共刺激途径：CD40-CD40L，也可诱导完全耐受。
近年来，人们进行了一系列新方法的尝试，其中较多的是应用合成HLA多肽片段来诱导免疫耐受，这种方法使用简便，费用低廉，如若成功将具有重要意义。
移植排斥的主要靶分子是MHC分子，因此人们早就把注意集中在MHC分子上，在CsA出现前，人们采用输入全血或血制品的方法来调节排斥反应，随着CsA的广泛应用，曾一度减慢了这方面的研究，但从CsA有可能阻断产生耐受的必需免疫反应以及血制品的安全性等方面考虑，促使研究者又转向MHC分子的应用。
80年代以来，人们发现胸腺内注射MHC-Ⅰ类抗原可延长移植器官的存活时间，抑制排斥反应，后来有人将该方法扩展为胸腺内注射转染MHC-Ⅰ类分子的成纤维细胞，让后者在胸腺内持续表达和分泌MHC-Ⅰ类分子，以此来调节受者的免疫反应。结果发现此举可使受者对随后的肝、心脏移植产生较好的耐受。但其他试验观察到，肌内注射这种成纤维细胞，对排斥作用的影响不明显。
目前认为给予MHC分子的方式，使用剂量以及MHC基因本身是影响免疫反应的几个主要因素。应用MHC分子的主要替代方法是使用人工合成多肽，其主要优点为易于得到，且可减少抗MHC抗体的反应。人们发现与HLA-A2相应的合成多肽可特异性地抑制CTL对HLA同种抗原的识别，HLA-A2α区域98-113残基多肽抑制大部分HLA-A2特异性CTL细胞的识别。后来，人们发现HLA-A2另一区域的多肽可抑制T细胞的细胞溶解作用，同样的结果在人和鼠中均可观察到。
最近，人们对这些多肽的作用机制有进一步的了解，多肽与T细胞表面的72kD和74kD分子结合引起T淋巴细胞内的Ca2+增加，此外，多肽可与HSP70家族的膜结合，改变多肽序列可影响其作用效果，说明合成多肽是通过一个新的作用途径调节T细胞反应。
MHC-Ⅱ类多肽可调节同种异体免疫反应，阻断增殖的特异性CD4+细胞反应，还可抑制混合淋巴细胞的增殖，但对丝裂原或流行性腮腺炎病毒引起的增殖无效，这种抑制作用无种属差异。
以下是对耐受诱导的几种机制，希望通过对自身耐受机制的研究，能找出诱导T细胞对移植中引入的外源性同种抗原产生耐受的方法。
一、免疫清除
清除是指通过凋亡去除特异性的T细胞或T细胞克隆，被认为是最强的耐受诱导机制，因为它能将T细胞从T细胞库中完全清除。
1.耐受诱导的胸腺清除机制
利用超抗原和TCR转基因小鼠已建立了很好的动物模型：表达对MHC/自身肽复合物特异性的TCR的胸腺细胞在胸腺内接受通过凋亡引起死亡的信号。发育中的T细胞和胸腺内表达的MHC/自身肽复合物的高亲和性作用引起克隆清除。有两种方法可以诱导胸腺清除：胸腺内直接注射同种抗原和混合的同种异体抗原性骨髓嵌合。
2.耐受诱导的外周清除机制
胸腺内的克隆清除虽能有效清除T细胞群中的大多数自身反应性T细胞克隆，但不能清除所有潜在的同种反应性T细胞。离开胸腺的自身反应性T细胞并不一定会产生针对外周表达的特异性自身抗原的免疫反应，可能的机制有若干。有的情况下，抗原被自身反应性细胞所“忽略”，但对于活化的自身反应性T细胞群而言，这只是一种不稳定的情况，或许通过对环境中的抗原交叉反应，或通过分子模拟，都会引起自身免疫损伤。在另外的情况下，自身反应性T细胞群可能通过下调TCR或其受体分子，引起对外周抗原的无反应性。这种类型的无反应性，常常见于自身抗原以低水平在外周表达的情况。外周抗原的刺激能够引起不同水平的耐受。T细胞表现出的耐受水平，取决于自身抗原的剂量及自身抗原表达局部细胞因子的情况。潜在的自身反应性T细胞可以通过增加外周自身抗原表达的水平或剂量而被引入更深程度的耐受状态。
二、免疫无能
无能是指T细胞的功能性无反应或失活而不伴有细胞死亡。重要的是，无能在反应性T细胞是作为TCR信号转导的直接结果，而不需要第二信号即调节性T细胞的作用。
幼期T细胞的活化传统上认为至少依靠两个信号。信号1由TCR同MHC/特异抗原肽复合物相互作用组成；信号2是由同一APC递呈的共刺激信号。最具代表性的共刺激分子是APC上表达的B7分子CD80（B7-1）和CD86（B7-2）及其T细胞上的受体CD28。在移植免疫中第二个最重要的共刺激途径是CD40-CD40L（gp39，CD154）相互作用。CD40在 APC上表达，CD40L在激活的CD4+T细胞上表达。对T细胞的共刺激作用引起IL-2分泌和抗凋亡蛋白Bcl家族包括Bcl-xL的表达。
1.输血效应与无能的关系
20世纪60年代，当肾移植成为可行的临床治疗手段以后，临床医生担心给贫血的透析患者反复输血会造成同种抗原致敏而使肾移植不可能进行。若干研究小组开始研究多次大量接受输血的患者的移植肾是否更易被排斥，结果令人吃惊：大量多次接受输血的患者移植存活率反而更高。
类似输入供者血的实验方法是移植前输入供者来源的幼期B细胞。静止B细胞看来是诱导无能的理想材料。这些细胞表达高水平的MHC-Ⅰ类和H类抗原，但无B7分子表达，且在体外缺乏共刺激能力。然而静止B细胞在输入体内后可能被激活的事实常常被忽略，这种情况下，激活B细胞能有效地免疫受者，使其抗供者的MHC抗原，而不是诱导同种反应性T细胞无能。尽管有理论上的危险，幼稚B细胞已经被用于一些实验模型中诱导移植耐受。
2.过客白细胞清除和无反应诱导
移植物中的白细胞是组织免疫原性的主要来源的概念，这种细胞通常被称为“过客白细胞”。为了将过客白细胞从移植物中除去，Lafferty及其同事们将甲状腺组织和胰岛细胞放在含有95%O2和5%CO2的空气中延长培养到14天。经过这样的预处理之后的上述组织被植入完全MHC不相配的同种异体的有免疫能力的受者体内，移植物无限期存活。体外培养将MHC E类抗原阳性的APC从移植物中完全去除，但培养过的同种异体移植物依然带有能被识别的同种异体抗原。其他的成功研究包括用抗MHC R类抗原和抗DC单抗去除过客白细胞都证实了过客白细胞在启动同种排斥中的关键作用。虽然用体外延长培养的办法可以去除游离组织如胰岛或甲状腺中的过客白细胞，要想除去实质脏器内的供者来源的APC要困难得多。正由于此，现在的研究方向转向封闭同种移植物排斥的启动环节——即供者APC/T细胞相互作用的环节。
3.封闭T细胞共刺激作用与耐受诱导
T细胞的共刺激作用对于T细胞活化极为重要。许多封闭共刺激作用的实验方法都能有效延长同种移植物存活并诱导耐受。
CTLA4-Ig是第一个显示能够延长同种异体和异种移植物存活的共刺激作用封闭分子。CTLA4-Ig是CTLA4的胞外段与人IgG1 Fc段融合形成的融合蛋白。CTLA4-Ig与APC上表达的B7-1（CD80）和B7-2（CD86）的亲和力高于T细胞上表达的CD28与B7和B7-2的亲和力。CTLA4-Ig的作用是抑制CD28介导的T细胞共刺激作用。封闭CD40/CD40L途径，也能延长小鼠和灵长类的同种异体移植物存活。如果联合CTLA4-Ig和抗CD40L单抗封闭这两种共刺激作用途径将显著延长移植物存活。
三、免疫调节/抑制
调节或抑制被认为是当其他细胞参与免疫应答时发生。这种情况下，抗原特异性T细胞仍然保留在外周循环中，但其免疫反应性被其他细胞抑制或改变了，这种调节是抗原特异性模式。传统上用过继输注的实验证实抑制性细胞的存在。实验中，从长期存活的同种移植受者体内分离细胞，输注给同基因受体，再用新鲜的同种移植物刺激第二受者，可以观察到过继输入的细胞能够抑制排斥反应。
抑制性细胞常常在能长期维持同种异体移植物有功能存活的动物体内发现（>50天）。可能抑制细胞对于维持长时间的耐受至关重要。在维持阶段，从胸腺产生的原始同种异体反应性细胞必须被抑制，从而防止了移植物排斥。
四、免疫忽略
忽略是指T细胞忽略一种抗原，尽管这一抗原在体内表达，但T细胞却保持无反应性。T细胞能识别每一个体递呈的稀有抗原，但这些细胞正常情况下都不被激活。自身免疫性可能反映了这种免疫忽略细胞的活化。抗原表达的部位能决定T细胞是否对这一抗原忽略。忽略对于移植耐受的诱导看来并不十分主要。与任何移植过程相关手术损伤及非特异性炎症，可能激活APC和局部的内皮细胞，使得同种抗原在解剖学上的消失是不可能的，因此同种反应性T细胞不可能保持忽略。尽管如此，在维持耐受期间，一旦非特异性炎症消失或减弱，可以设想同种反应性T细胞可能仍然忽略表达在移植物实质细胞上的同种抗原。
对机体诱导和维持自身耐受机制的研究，使人们得出多种成功诱导移植耐受的实验方案。虽然传统的免疫抑制剂仍然是人类器官移植的主要治疗手段，但我们相信，特异性免疫抑制和耐受诱导的成功可能就在不远的将来。
（陈刚 张雷）