第五节　钉螺的实验室检测

根据各种防治工作需要，在钉螺调查工作结束后，还需要进行一系列的实验室检测工作。钉螺的实验室检测主要包括钉螺生存状态检测、成螺幼螺的鉴别、雌雄鉴别以及感染性钉螺的检查等等。

一、检查前准备

（一）器械准备

解剖镜、解剖针、白大褂、乳胶手套、培养皿、小铁锤、镊子、碘酒等。

（二）样本数量

已多年查不到感染性钉螺地区，为使检查结果能较准确地反映钉螺血吸虫感染情况，解剖钉螺数需要多些。一般是以螺点为单位，当查到的钉螺数少于1 000只时，要全部采集；当查到钉螺较多时，每个螺点至少采集1 000只。

（三）样本送检

查螺队以螺袋形式将现场采集的钉螺样本在24小时内送实验室待检，实验室专业人员应在3天内完成检查，以保证检查结果的准确性。

（四）样本保存

现场查到的钉螺应放入螺袋内，切勿放在有水的瓶子里，否则钉螺会很快死亡。螺袋应放置室内干燥的草纸上及阴凉通风处，否则在温度较高时，钉螺极易死亡。

（五）个人防护

检取钉螺要用镊子或竹筷，不能用手拾取。检查时应戴有防护作用的手套。

此外，由南京市江宁区疾病预防控制中心研制并投入生产的全自动钉螺压碎机，自2015年在江苏省、市有关专家的指导下，获得两项了国家专利。该设备一键自动压螺，结构简单、操作方便，可放置于实验台上工作。传统手工压碎钉螺时，常因钉螺尾部不能压碎而要多次返工，手工压碎钉螺的效率差、精度低和有因手工操作而感染血吸虫病的风险，手工捣碎田螺、福寿螺等其他淡水螺类用时较长，而使用自动压螺机能提高工作效率数十倍。有条件的地区可以使用该设备辅助钉螺实验室检测工作。

二、钉螺生存状态检测

钉螺死活鉴别一般采用三步法，最后确定死活需用敲击法。

（一）爬行法

将草纸铺于平底瓷盘底部，在草纸中心上画直径为5cm的圆圈，瓷盘内加入少许脱氯水使草纸湿润。将钉螺置于草纸上的圆圈内，置室温（20～25℃）下放置24小时后，观察钉螺爬动情况。若钉螺开厣活动或爬到圈外，则为活螺。在原位不动的钉螺，通过压碎法或敲击法鉴别钉螺是否存活。

（二）敲击法

将钉螺置于平板玻璃或硬物上，用小铁锤轻击使之破碎，如见钉螺软组织有收缩反应则为活螺，反之为死螺。

（三）压碎法

将钉螺置于平板玻璃上，每块玻片上放置钉螺若干只，钉螺相互分开，另用一块较厚的玻片将钉螺轻轻压碎，用解剖针将黏附在上面玻片上的钉螺软组织拨到下面玻片上，然后在每个螺体上加一滴脱氯清水。如压碎后钉螺有收缩反应，且见新鲜软体组织者为活螺，反之为死螺。

（四）温水法

将现场捕捉的钉螺放入温水（20～25℃）中，15分钟后发现钉螺开厣活动的即为活螺，无开厣活动的钉螺，通过压碎法或敲击法鉴别钉螺是否存活。

三、成、幼螺鉴别

将钉螺洗净后，逐个按下表所列要点进行鉴别。亦可根据螺旋数判定成、幼螺，凡螺旋数≥5者为成螺，＜5者为幼螺（表3-2）。

表3-2　湖北钉螺成、幼螺鉴别要点

四、雌、雄螺鉴别

（一）透视法

把洗净的钉螺放在灯光下，用放大镜透视，体螺旋背部有红色“指状”阴茎为雄螺；在螺体腹侧体螺旋底部具灰白色副腺的为雌螺。

（二）直窥法

在钉螺开厣活动时，直接从壳口见阴茎的为雄螺；在钉螺交配时，拉开两螺，见阴茎的为雄螺；没有阴茎的为雌螺。要注意到有时两个雄螺也可作交配状。

（三）解剖法

压碎钉螺，观察到阴茎者为雄螺，否则为雌螺。

五、感染性钉螺检测

采用压碎镜检法、逸蚴法或分子生物学方法，检测钉螺体内是否含有日本血吸虫胞蚴、尾蚴或血吸虫DNA。

（一）压碎镜检法

将钉螺置于载玻片上，另用一张较厚的玻片将钉螺轻轻压碎，然后在螺体上加一滴脱氯清水，将钉螺置于解剖镜（10 × 倍）或显微镜（4 × 物镜，10 × 目镜）下，用解剖针拨开外壳，依次撕碎钉螺消化腺等软体组织，发现日本血吸虫尾蚴、胞蚴即为感染性钉螺，感染早期的钉螺有时可检获母胞蚴。解剖针每拨弄一次螺软组织后，应及时擦干净，防止尾蚴污染。

（二）逸蚴法

将钉螺放在指形试管内，每管放一只钉螺，加脱氯水至试管口，用尼龙纱盖好管口。置20～25℃、光照条件下，4～8小时后用肉眼或放大镜在灯光下观察指管水面有无日本血吸虫尾蚴。如无法鉴别，可用铂金饵钩取表面水滴于载玻片，在显微镜或解剖镜下观察。如待检钉螺数量较多，感染率又不高时，可用较大的指管，每管放10只钉螺，对检出有感染性钉螺的指管，再按照单个螺逸蚴的方法辨别感染性钉螺。

（三）基于血吸虫核酸检测的分子生物学方法

1.钉螺处理

将钉螺置于载玻片上，用另一块较厚的玻片将钉螺轻轻压碎，尽量弃去螺壳残渣，仔细挑取钉螺软体组织至干净的离心管（1.5ml或2.0ml）内，移液器吸取适量的TE缓冲液（pH 8.0）覆盖钉螺软体组织，漩涡振荡器振荡漂洗组织，8 000r/min离心30秒，弃上清液。

2.核酸提取

将清洗干净的钉螺软体组织用商用或者自行配置的组织基因组提取试剂（通过研磨-匀浆组织-DNA结合-洗脱等步骤）提取DNA，紫外可见分光光度计测定DNA含量及纯度。亦可进一步行1.0%琼脂糖凝胶电泳测试基因组提取质量。

3.基因扩增

将提取的基因组DNA作为模板，以日本血吸虫特异引物为探针，用聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）、荧光定量PCR、重组酶介导的核酸等温扩增（RAA）等方法进行核酸扩增反应，通过观察颜色反应或有无目的条带判断被检钉螺中有无血吸虫特异性核酸序列，以判定钉螺日本血吸虫感染情况。下面主要介绍下现场工作中使用较多的LAMP技术以及近期杨坤等人新建立的RAA法检测感染性钉螺技术。

（1）环介导等温扩增法（LAMP）检测技术：

是由Notomi等于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增结果。这种方法应用针对6个靶序列的4条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst）在等温条件下（65℃左右）保温1～2小时，即可实现核酸的大量扩增，通过肉眼观察扩增产物颜色的变化即可判断样本中是否存在特异性DNA扩增片段。

1）实验器材和主要试剂：

恒温水浴箱（可调温37～65℃）；移液器（或移液枪）一套（量程包括 20～200μl，0.5（或 1μl）～10μl）；微量离心机（或称迷你离心机，0.2ml转头）；移液枪头（量程包括 20～200μl，0.5（或 1μl）～10μl）；1.5（和 2.0ml）微量离心管（灭菌处理）。主要试剂：钉螺体内血吸虫核酸检测试剂盒（环介导等温扩增技术）。

2）操作规程：

①LAMP检测混合样本的准备，LAMP反应体系配制前，需预先准备混合样本，即将同一个环境的钉螺基因组DNA按照50个钉螺软体组织DNA进行混合，从每管样本分别吸取5～10μl钉螺基因组DNA溶液入一个干净的1.5ml离心管中，组成1个混合样本用于LAMP检测（通常5管并1管）。②LAMP反应，按25μl反应体系进行LAMP反应。按照设计，取无菌（消毒处理）的0.2ml PCR反应管，分别加入待测钉螺基因组 DNA 模板 2.0μl、2 × LAMP 反应缓冲液 12.5μl、扩增引物混合物 1.0μl、灭菌去离子水7.5μl、BstDNA聚合酶1.0μl、显色试剂1.0μl，充分混匀反应体积，另外分别以日本血吸虫成虫基因组DNA、灭菌去离子水代替抽提的DNA模板设置阳性、阴性对照。将反应管插入浮标上，放置于65℃水浴锅，恒温孵育60～120分钟。结果判定：肉眼观察反应管内液体颜色变化，液体变成绿色判定为阳性；阴性为（棕）黄色。③注意事项：a）所有Tip、微量离心管实验前均需无菌处理（建议高压蒸汽灭菌）；b）LAMP反应水浴锅（箱）宜用小型的几孔样式，需用蒸馏水或去离子水，并能每次进行LAMP反应前及时更换蒸馏水或去离子水；c）因在运输过程中样本或试剂可能黏附在管壁或管盖上，开盖操作前需将试剂和样本于冰上或4℃溶解（Bst酶须置-20℃或冰上，不能放4℃），并低速离心（＜2 000r/min）5～10秒；d）LAMP检测试剂需-20℃保存，避免反复冻融10次以上；e）LAMP结果判读时，若阴性对照反应管内液体显示绿色，说明实验室或检测系统可能受到外源DNA污染，需重新试验；

LAMP显色完后置黑色背景（或白色背景）拍照成图片，反应管可用塑料袋密封-20℃保存。

（2）重组酶介导的核酸等温扩增（RAA）技术：

杨坤等学者以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列，根据RAA反应原理设计合成引物，建立的RAA法，可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA，反应可在30分钟内完成。以重组质粒为模板，RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/µl；以基因组DNA为模板，RAA法最低可检测浓度为0.01ng/µl。该方法反应快捷、敏感性和特异性均较高，具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值。在此基础上，杨坤等学者还进一步探索建立了荧光RAA法，进一步提高了RAA法检测的敏感性，有望成为新的钉螺检测适宜技术，推动血吸虫病监测预警工作。现简要介绍RAA法检测感染性钉螺的主要步骤。

1）待扩增序列选择及引物设计：

选择SjG28基因片段作为待扩增的靶序列。根据重组酶介导的等温扩增反应原理设计用于SjG28特异性扩增的正向和反向引物，正向引物序列：5′-TACCTCAAGAAGTAATGTCCTTCCATTGTG-3′，反向引物序列：5′-ATGCGAGGTTTCAGGAGACCAAGAAGAACG-3′。

2）RAA反应体系的建立：

根据重组酶介导的等温扩增反应原理，在0.2ml PCR管中建立包含如下组分的 50µl反应体系：Tris缓冲液（30～50mmol/L）、醋酸钾（60～120mmol/L）、醋酸镁（10～20mmol/L）、二硫苏糖醇（4～9mmol/L）、聚乙二醇（质量浓度5.5%～7.8%）、ATP（1～6mmol/L）、dNTPs（0.1～0.4mmol/L）、磷酸肌酸（20～100µg/U）、单链结合蛋白（300～1 000ng/µl）、重组酶（50～500ng/µl）、UvsY 蛋白（50～200ng/µl）、DNA 聚合酶（60～150ng/µl）、正向和反向引物（浓度均为 200～600mmol/L）、日本血吸虫基因组 DNA（40～60ng）。将以上反应体系混合均匀，置水浴箱或PCR反应仪在37℃条件下反应30分钟。反应结束后，将反应管取出，每个反应管中加入50µl酚/氯仿（1∶1），振荡均匀，12 000 × g离心1分钟。吸取10µl上层溶液进行琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1%，100V）45分钟，置紫外灯下观察。