第六节 呼吸道疾病细菌病原学诊断
呼吸道感染是儿童最常见的感染性疾病之一，其中肺炎是儿童时期的第一位死因。其病原体包括细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体等，细菌感染在儿童呼吸道疾病相当多见。细菌病原学诊断是呼吸道疾病防治中的关键环节。快速准确的细菌病原学诊断不仅对提高临床诊断水平、合理应用抗生素、遏制与延缓耐药细菌病原体的产生具有重要意义，同时也为研究呼吸道疾病病原的致病机制和流行病学特点、指导有效预防提供依据。
呼吸道疾病的细菌病原学具有地域和时间特点，可因季节和年龄而异。目前，常见呼吸道疾病的致病菌的威胁不但没有消除，且出现了严重的耐药问题，给临床治疗带来更大困难。严峻的现实向病原微生物检验和诊断提出了更高的要求。为了更准确、更快速地检出与监测病原体，现代生物科学技术逐步应用于细菌病原的诊断与检测。
一、儿童呼吸道疾病的病原学诊断现状
传统的病原学诊断方法包括涂片革兰氏染色和培养，但革兰氏染色阳性率较低，病原菌分离培养和鉴定至少需要48小时才能报道结果，而且培养阳性率会受到之前经验性治疗的影响。由于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等易培养菌可作为共生菌存在于上呼吸道，故采用传统的分离培养技术进行诊断时要求标本为血液等无菌体液或通过侵入性方法（如肺穿刺、经纤维支气管镜等）获得的呼吸道标本，存在血培养阳性率低、侵入性方法易造成严重并发症等诸多问题。免疫学检测技术目前主要用于诊断病毒、支原体、衣原体等难培养病原体导致的下呼吸道感染，多采用酶链免疫吸附试验、免疫荧光抗体试验、对流免疫电泳等方法检测血、痰等标本中的病原体抗原或血清特异性抗体。由于缺乏统一的参考标准，免疫学检测方法的敏感性和特异性在不同实验室间差异较大，影响了其在下呼吸道感染中的诊断效用。基因诊断技术如今已在下呼吸道感染的快速病原学诊断中发挥越来越重要的作用。若以传统的血培养方法作为诊断金标准，用PCR技术对血和痰标本肺炎链球菌的检测敏感性分别可达57%～100% 和 68%～100%［1，2］。在儿童肺炎支原体、肺炎衣原体所致下呼吸道感染的诊断中，核酸扩增技术亦显示出传统培养法和血清免疫学检测方法无法比拟的优势。可以预言，一旦核酸扩增技术的现存问题得以解决，它必将成为儿童下呼吸道感染病原学诊断的最有效手段。
因此，传统的细菌分离、培养及生化反应等病原微生物的诊断方法，已远远不能满足临床和流行病学的研究需要。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学及计算机技术的不断发展，新的微生物诊断技术和方法已广泛被应用。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的微生物诊断方法，尤其是DNA探针和以PCR为代表的分子生物学技术的发展及自动化仪器的应用已明显加快了微生物检验的速度，显著提高了微生物的诊断水平。
二、儿童呼吸道疾病细菌病原标本的采集
儿童呼吸道疾病的细菌病原学鉴定与诊断的关键是标本采取。呼吸道标本的采集方法多样，常用方法有：
1.痰标本、咽拭子、鼻咽拭子等标本培养
儿童咽部正常就有带菌，来自上呼吸道的分泌物培养不能真实反映肺部感染，只能协助呼吸道疾病的细菌病原学诊断。
2.血培养
在呼吸道疾病的细菌病原学检测中常应用血培养方法，但呼吸道疾病的细菌常仅有短时的病毒血症或菌血症过程，因此血培养分离细菌病原的阳性率极低，一般不足10%［3，4］。尤其是近年来抗生素的早期广泛应用，使得绝大多数呼吸道疾病的细菌血培养阴性，例如巴西的一项3 431例儿童社区获得性肺炎研究显示，65.5%的患儿血培养，肺炎链球菌阳性率仅为0.8%。也有在6个月～18岁儿童和青少年的社区获得性肺炎中仅0.4%的血培养阳性率［5］。当合并有胸腔积液时血培养的阳性率增高，可达10%～35%。
3.肺穿刺
肺穿刺方法是目前公认的呼吸道疾病的细菌病原学检查的“金标准”，透视下肺病变部位的穿刺能够真正反映肺炎病原学情况。但这种方法对操作人员技术要求高，在儿童不能很好配合的情况下，可出现较严重的并发症，如气胸、肺出血等，患儿及家长不易接受。
4.使用经气管抽吸采取分泌物方法
可避免上呼吸道携带病原污染。实践证明这种方法可较好地减少携带菌，提高呼吸道疾病的细菌病原诊断的阳性率。但它需要负压吸引设备，吸管经咽喉部进入气管，易造成患儿刺激性咳嗽、气道短暂梗阻、呕吐等。
5.经纤维支气管镜采取标本
此方法是近年来迅速发展的一种诊疗技术，它可在直视下观察肺内各部位支气管的病理变化、采取标本、给药、灌洗和取出异物等。有报道纤维支气管镜灌洗液培养分离病原较以往的气管抽吸分泌物培养方法阳性率高，准确性更好。然而这一技术也有危险性，需要一定的设备条件，技术要求高，在多数基层医院不易广泛开展。
呼吸道疾病的病原学诊断，通常是通过痰培养和显微镜检查方法获得。咽喉部定植的复杂微生物菌群浓度高达106CFU/ml 以上，容易污染从下呼吸道排出的分泌物，而难以鉴别感染菌与定植菌。尽管用细胞学方法筛选痰标本、或行痰液洗涤及定量培养等方法可以在一定程度上减少污染，但结果仍不尽人意，且操作烦琐而影响其推广。环甲膜穿刺吸引下呼吸道分泌物虽可减少上呼吸道的污染，但并发症多，目前已较少应用。为克服上述障碍，近年来发展通过保护型毛刷经纤维支气管镜（FOB）采集下呼吸道分泌物的诊断技术能正确获得医院感染肺炎的病原学诊断。然而医院感染肺炎患者常因基础疾病病情严重，使FOB 检查在操作时间和检查项目上受到限制。经FOB直接吸引并做细菌定性定量培养，操作简单，对肺部特殊感染具较高的诊断价值。直接涂片染色可快速检测结核、卡氏肺孢菌等，但对肺部细菌性感染的诊断特异性差，仅20%～30%。经FOB进行支气管肺泡灌洗，可以获得较大面积肺泡及支气管分泌物的样本，是诊断下呼吸道感染的一种敏感工具。
三、呼吸道疾病细菌病原学诊断方法
（一）形态学检测技术
1.光镜检查
对呼吸道分泌物等标本制成的涂片，进行革兰氏或特殊染色后置普通光学显微镜下直接观察，是确定很多呼吸道疾病病原体的最基本、快速的方法。
2.电镜检查
主要用于观察细菌的超微结构，在电镜下根据不同细菌的特征性的超微结构进行诊断，对细菌感染具有快速诊断价值。
3.分离培养
分离培养是确定细菌病原最常用方法，要求标本应采集自感染肺组织。有研究表明，肺穿刺标本细菌培养阳性率在非洲儿童肺炎患者达79%。但常规穿刺显然不切临床实际，更不适合肺炎初始治疗的患儿。直接取痰或用3%～5%高渗盐水诱导获取痰液或经气管负压抽取痰液标本送培养和涂片染色（可以发现胞内菌），所得结果在一定程度上对临床有指导意义。鼻咽分泌物培养有细菌生长并不能确立该细菌就是肺炎致病菌。当怀疑有特殊病原体或耐药菌感染致肺炎或经验治疗无效时，应尽可能采集合格痰标本（可结合痰液细胞学涂片判断：中性粒细胞≥25个/低倍视野，上皮细胞＜10个/低倍视野为合格标本）以明确病原。疑有侵袭性感染的肺炎住院患儿，尤其是婴幼儿，应及时送检血培养。一项对840例0～12岁小儿肺炎的研究表明，胸腔积液培养阳性率为17.7%，因此对胸腔积液者应做胸腔穿刺以获取积液或脓液标本培养，对明确肺炎病原学有一定价值。
对病原体的分离培养不仅能使呼吸道疾病病原得以确诊，而且建立在此基础上的药敏试验可指导临床合理用药。但是某些病原体目前还无法进行体外培养，或培养步骤繁复而无法在小型实验室常规开展。更重要的是许多儿科感染常见病原体的培养结果无法及时获取以指导临床治疗，这些缺点大大限制了分离培养技术在病原学诊断中的应用。
（二）免疫学检测技术
免疫学检测技术的基本原理是抗原抗体反应，可利用单克隆抗体检测病原体的特异性抗原，也可利用病原体抗原检测患者体内的特异性抗体。免疫学检测在难培养的细菌和支原体、衣原体、立克次体等病原体的诊断中具有很大的实用价值。应用单克隆抗体结合各种形式的放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、荧光免疫分析（FIA）、时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）、化学发光免疫分析（CIA）、生物发光免疫分析（BIA），以及免疫层析法等［6］，足以检出临床标本中痕量的（1018～1021）微生物抗原，免去细菌培养过程，直接完成微生物感染的快速诊断。
1.抗血清凝集技术
早在1933年，就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性。今天已广泛用于细菌的分型和鉴定，如沙门氏菌、霍乱弧菌等。
当然，血清抗体检测还是受到一些限制，如检测血抗肺炎链球菌、流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体水平，或检测血清肺炎链球菌抗原抗体复合物。迄今尚无一种检测方法可独立用于诊断肺炎并有足够高的敏感性和特异性，对年幼儿价值更差。
2.应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物
实验室所用的载体有聚苯乙烯粒子（Latex）、明胶粒子、炭末、含蛋白A的金黄色葡萄球菌、胶体金、胶体硒等。商品试剂将白色、红色、黄色、蓝色的Latex粒子分别结合不同的单抗，可快速将细菌分群。如沙门氏菌或链球菌与此种复合的Latex试剂做凝集反应，可在1～2分钟内以出现的凝集粒子的颜色判定出A、B、C、D等群，快速检查葡萄球菌的凝固酶或DNA。
3.免疫荧光技术（immunofluorescent assay，IFA）
IFA是用荧光素标记抗体分子，借助荧光显微镜检测相应抗原，该方法可清楚地观察病原体抗原并定位，具有简单、敏感、特异等优点，已广泛应用于感染性疾病的诊断。但IFA易产生非特异性染色，所以必须有严格的对照和排除试验，才能得出准确结果。
用于快速检测细菌的荧光抗体技术主要有直接法和间接法。直接法是在检测样本上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在待检测样本上滴加已知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体，如抗沙门氏菌荧光抗体。
4.间接凝集反应
包括正向间接凝集反应和反向间接凝集反应。正向间接凝集反应是以抗原致敏载体检测标本中的相应抗体；反向间接凝集反应是以抗体致敏载体检测标本中的相应抗原。由于其操作简便、反应快速，因而常用于流行病学调查和筛选阳性标本。在标本中直接检出细菌抗原，有利于呼吸道疾病的早期诊断。比常规法节省时间，而且具有较高的特异性和敏感性。
5.酶免疫技术（enzyme immunoassay，EIA）
是20世纪60年代末建立并开始用于感染性疾病的诊断。随着反应体系的不断改进，单克隆抗体、基因表达抗原及人工多肽的广泛应用，其技术水平日趋成熟。EIA具有高度的特异性和敏感性，几乎所有可溶性抗原抗体反应系统均可检测，最小可测值可达纳克甚至皮克水平，与IFA比较具有操作简便、结果易判定、重现性好等优点。常用的EIA有免疫酶标试验、酶联免疫吸附试验、免疫印迹技术及免疫胶体金标记技术。酶联免疫技术的应用，大大提高了检测的敏感性和特异性，现已广泛地应用在病原微生物的检验中。
6.应用变态反应检查病原微生物或其抗体
变态反应是机体对某些抗原物质发生的一种可导致生理功能紊乱或组织损伤的异常免疫反应，常表现为免疫反应性增高，多发生于再次接触同种抗原的时候。变态反应亦称过敏反应（anaphylaxis）或超敏感性（hypersensitivity），引起变态反应的物质称为变应原（allergen）或过敏原（anaphylactogen），包括完全抗原、半抗原或小分子的化学物质等，如细菌、寄生虫（原虫、蠕虫）、异种血清等。这些变应原可通过呼吸道进入体内，使其致敏和激发变态反应。可利用变应原来检测病原的感染。
（三）分子生物学技术
随着分子微生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于其外部形态结构及生理特性等一般检验，而是从分子生物学水平研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（nucleic acid probe）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction）以其敏感特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于微生物的检测。
1.核酸杂交技术
核酸杂交技术是利用放射性核素或非放射性核素标记已知特异性核酸片段作为探针，将已知核苷酸序列或DNA片段用放射性核素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA片段形成杂交双链，检测标本中具有相同序列的目的核酸，借助放射自显影或其他方法示踪，其灵敏度可达5×108pg/L水平。这种能识别特异性核苷酸序列有标记的单链称为DNA分子核酸探针或基因探针。根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分成DNA探针或RNA探针，一般大多选用DNA探针。根据选用基因的不同DNA探针分成两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性。另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。
核酸探针的应用：
（1）用于检测无法培养，不能用做生化鉴定、不可观察的微生物产物以及缺乏诊断抗原等方面的检测，如肠毒素。
（2）用于流行病学调查研究，区分有毒和无毒菌株。
（3）检测细菌内抗药基因。
（4）细菌分型，包括rRNA分型。
常用方法有斑点杂交、Southern印迹、Northern印迹、原位杂交等。核酸杂交技术的特异性比免疫学检测更高，但存在耗时长、技术要求高等缺点，因此尚未能常规用于感染性疾病的病原学诊断。
2.聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）
PCR 技术自 1985年建立以来，发展迅速、应用广泛，表明其具有强大的生命力。近些年来基于PCR的基本原理，对PCR技术进行研究和改进，使PCR技术得到了进一步的完善，并在此基础上派生出了许多新的用途。如：原位PCR技术、连接酶链反应（ligase chain reaction，LCR）、依赖核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、转录依赖的扩增系统（transcript-based amplification system，TAS）、Qβ复制酶（Q-beta replicase）系统扩增法、标 记 PCR（labelled primers，LP-PCR）、彩 色 PCR（color complementation assay PCR，CCAPCR）、反向 PCR（reverse PCR）、不 对 称 PCR（asymmetric PCR）、重 组 PCR（recombinant PCR）、多 重 PCR（multiplex PCR）和免疫-PCR（immuno-PCR）等。
采用荧光多重PCR检测细菌特异基因，如肺炎链球菌编码溶血素（ply）基因、流感嗜血杆菌编码细菌荚膜多糖（bex）基因。也有选择稳定、广范围的细菌拓扑异构酶基因（gyr B/par E）序列，如利用寡核苷酸阵列结合PCR扩增技术诊断9种呼吸道感染常见细菌病原等。
PCR可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染［7，8］。PCR也可用于病原微生物的分型鉴定，如多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别等。PCR技术在敏感性、特异性、检测速度等方面的强大优势使其越来越广泛地被应用于各种感染的病原学诊断。同时，PCR技术也存在标本易污染、检测费用高、需专业设备和人员等缺点，自动化和标准化是其目前急需解决的问题。
3.基因定量诊断与基因芯片技术
基因定量诊断技术是在基因定性诊断技术基础上发展起来的新技术，包括核酸杂交定量技术和PCR定量技术。实时荧光定量PCR法为目前应用最广的基因定量诊断技术，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量，具有自动化程度高、动态监测、防止污染等优点，也有无假阳性和假阴性。基因定量诊断可用于病情评估、疗效预测、预后判断等，在感染性疾病诊断中具有重要的临床应用价值。
基因芯片技术是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展，它的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化和自动化。该技术是通过把巨大数量的寡核苷酸，肽核苷酸或DNA固定在一块面积很小的硅片、玻片或尼龙膜上而构成基因芯片，它主要是基于近年来的一种全新的DNA测序方法之一杂交测序法应运而生的。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上，所以可以一次性对大量序列进行检测和基因分析，解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂、操作序列数量少等缺点。因此可在短时间内对诊断不明的感染性疾病做出判断。基因芯片还可用于细菌变异株、基因分型、耐药基因等检测。随着该技术的日趋成熟必将在感染性疾病的病原学诊断中发挥巨大作用。液态芯片是近年来新出现的一种可用于多指标同步分析的新型芯片技术，它将细胞大小的微球作为探针的载体，为生物分子相互作用提供充分反应的液态环境。该技术既具有以往生物芯片高通量的特性，又具有优于过去芯片的操作简便、重复性好、灵敏度高的特点。
固定在玻片等支持物上的DNA 序列往往是根据特异性 PCR 扩增得到的片段（500～5 000bp）、细菌基因组的随机片段或者是人工合成的代表不同基因的单链核酸序列（20～70bp）。该方法的主要优点是可以同时鉴定多种细菌的混合污染。现在这种技术主要用来检测致病菌的基因表达水平，同时也可以快速鉴定致病菌基因。常规的PCR 检测方法只能够检测一种基因，而只是通过一个基因进行菌种鉴定的检测方法在特异性方面存在一定的不足。如大肠埃希菌O157：H7的slt-Ⅰ和slt-Ⅱ基因、eae基因、rfbE基因和fliC基因，只有同时检测到这些基因才能够鉴定为大肠杆菌O157：H7。现在应用较多的是复合PCR这种方法，此种方法也有一定的缺点，如同一个PCR 反应中由于引物间的相互作用而使检测基因的数量有一定的限制，还会因非特异性扩增和扩增片段的大小相近而不易区分。DNA 基因芯片技术由于利用的是DNA-DNA杂交而克服了上述缺点，PCR 扩增的产物必须能够和相应的基因序列杂交才能确定为阳性，而不是仅仅依靠扩增片段的大小进行确定，而且可以利用随机六聚体引物（hexamers）对全基因组序列进行扩增。这既解决了非特异性扩增的问题，又解决了通过DNA 片段大小进行确定的问题。
基因芯片（microarray）分析作为一种新兴的技术，在过去的10 年中，已经有37 种微生物的基因组序列被获得，还有128 种微生物的序列正在测序中。随之而来的是快速筛选技术，如DNA 基因芯片技术，这种技术利用从细菌中扩增到的序列标记荧光作为探针，与固定在玻片上成千上万的DNA序列进行杂交，结果可以通过直接的荧光扫描或酶学方法进行测定。基因芯片技术可以利用相关细菌的特异性基因（如毒力基因、抗生素耐受基因）和基因库中的rDNA序列设计玻片上的片段。这种方法可以快速、准确地检测和鉴定呼吸道疾病的病原菌。通过复合PCR 扩增产物和芯片进行杂交，明显地增强了反应的特异性和敏感度。如利用细菌的16S rDNA 序列设计芯片对细菌进行检测，以及利用细菌基因组的随机片段设计芯片进行杂交对细菌进行鉴定，可以同时鉴定多种细菌，并且可以形成杂交图谱进行交流和为以后的研究打下基础。
与传统方法相比，生物芯片在疾病检测诊断方面具有独特的优势，它可以在一张芯片同时对多个患者进行多种疾病的检测。仅用极小量的样品，在短时间内，即可为医务人员提供大量的疾病诊断信息。这些信息有助于医生在短时间内采取正确的治疗措施。例如对肿瘤、糖尿病和传染疾病等常见病和多发病的临床检验及健康人群检查，均可以应用生物芯片技术。
有些实验室难题在高通量的检测中可以得到解决，如呼吸道、消化道致病菌检测，结核的培养困难，耐药很难检测（可以测耐药基因）等，国内也有人在研究致病菌分析用芯片。在临床基因诊断中，基因芯片也逐渐得以应用。可以预见，基因技术在细菌病原学的检测中将会发挥越来越重要的作用。
（四）流式细胞术
流式细胞术（flow cytometry，FCM）是用流式细胞仪对单细胞悬液进行自动快速定量分析和分选的新技术，它综合了荧光标记、激光、单抗和计算机技术，具有速度快、精确度高、计数细胞量大及多参数分析等特点。FCM因能快速、多参数分析细胞特征，显示细胞的DNA、RNA水平和体积大小，近年来在临床上已逐步用于多种细菌的检测、计数及鉴定。
（五）检查某些细菌的专有酶及代谢产物进行快速鉴定
快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将它们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机地结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要方向。Rosa等将样本直接接种于Granda培养基，经18小时培养后，B群链球菌呈红色菌落且可抑制其他菌的生长。Deliae等新合成一种羟基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的蓝色物质。将一定量的IBDG加入到麦康基（MAC）琼脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培养18小时，出现深蓝色菌落者为大肠埃希阳性菌株。其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易与其他菌株区别。
已发现某些具有特征性的酶，应用适当的底物可迅速完成细菌鉴定。如沙门氏菌具有辛酸醋酶，以4MU-辛酸酯酶为底物经沙门氏菌酶解，在紫外线下观察游离4MU的荧光，国内已有应用。β-萘酚辛酯酶为底物，经沙门氏菌酶解，释出β-萘酚与固蓝作用出现紫色，反应在纸片上进行，只需5分钟即可完成沙门氏菌的鉴定。卡他莫拉菌具有丁酸醋酶，可用丁酸酯色原底物快速鉴定。大肠埃希菌具β-葡萄糖醛酸酶，故β-葡萄糖醛酸酶已成为初步筛查大肠埃希菌的重要特征。白色念珠菌具脯氨酸肽酶及N-乙酰β-D半乳糖苷酶，分别以适当物检测，试验只需20分钟，两酶均阳性即为白色念珠菌。难辨梭菌是医院内感染的重要厌氧菌，细菌培养需3～7日，且该菌培养困难，诊断主要检测其产生的A或B毒素。近来发现该菌具谷氨酸脱氢酶（GDH），如应用此酶的IgG抗体包被固相检测卡，应用双抗体夹心法检查粪便中的GDH。试验只需5分钟，已有商品的检测卡供应。
（六）细菌毒素的快速检测
自临床标本中直接检出细菌的毒素，常比细菌培养更可靠。如难辨梭菌在正常肠道中也可出现，故对抗生素相关肠炎的诊断，检出其毒素比细菌培养更有意义。已应用此类毒素的单抗以快速凝集或EIA法自粪便标本中直接检出毒素A或B进行诊断。产毒素埃希菌（ETEC）感染的诊断主要依靠检查细菌的LT（热敏毒素）与ST（耐热毒素），可应用其单抗以多种免疫学手段检出。肠出血性大肠埃希菌（EHEC）的重要特征是产生Vero细胞毒素（VT）或称志贺样毒素（SLT）。由于EHEC的血清型繁多，生化反应也可不典型，故检查该菌的毒素极具诊断价值。英国Unipaih公司已研制出VTEC的PRLA乳胶凝集试剂分别检查VT-1与VT-2，试验时以多黏菌素裂解菌体，释出VT，与乳胶试剂在U形板中温育24小时，肉眼判定有无凝集。金黄色葡萄球菌产生的多种肠毒素也用单抗的协同凝集试验迅速检出，是诊断该菌致病的可靠手段。
（七）细菌对抗菌药物的敏感性试验的快速检测
目前，检测细菌对抗菌药物的敏感性试验需用CLSI推荐的方法与标准。新的检测手段，如分子生物学手段检测细菌的耐药基因，自动化的药敏试验仪器，E-test法等可提高准确性与效率，但也难以实现快速。快速纸片法检查β内酰胺酶，对革兰氏阳性球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌有重要意义。快速鉴定MRSA和MRCNS的快速乳胶凝集试验可检出变异的青霉素结合蛋白（PBP2a），经与mecA基因检测比较，其敏感性为98.5%，特异性达100%。快速结核分枝杆菌药敏试验：BBL公司的MGIT（Mcobacterium growth inhibitor tube）于结核分枝杆菌TH9培养基中加入异烟肼、利福平等药物及荧光指示剂，荧光在有氧时淬灭，如细菌存活进行代谢而耗氧又复发荧光，在365nm的紫外线灯下观察有无荧光而判定敏感或耐药，试验仅需4～5小时。Jacobs等将萤虫素酶的基因导入结核分枝杆菌的噬菌体。噬菌体只侵入活的结核分枝杆菌而发出荧光。菌体与一定浓度药物作用后，如菌体存活则感染噬菌体，可在荧光显微镜下观察到荧光，即为耐药；无荧光者为敏感菌。
另外，应用氧化还原指示剂，可指示存活细菌的代谢活动，其颜色的改变可由敏感的光度计测定，使检测时间明显缩短。最新的敏感指示剂是Alamar blue，现已应用于革兰氏阴性杆菌、阳性球菌、酵母样菌、丝状真菌以及结核分枝杆菌的MIC测定，对多数细菌4～6小时即可判读结果。细菌对抗菌药物的敏感性反映一定的耐药机制，对正确鉴定细菌也有重要价值。
（八）病原微生物的自动化系统
近年来，随着计算机技术的不断发展，对病原微生物的鉴定技术朝着微量化、系列化、自动化的方向发展，开辟了微生物检测与鉴定的新领域。最有代表性的是AMS微生物自动分析系统。AMS为美国VITEK厂产品，属于自动化程度高的仪器，由7个部件组成，应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质，可用于不同的用途，卡片用后可弃去。操作时，先制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。该套系统检测卡片为14种，每一种鉴定卡片要含有25种以上的生化反应指标，基本同常规检测鉴定，检测所需时间4～8小时，最长不超过20小时。用自动化/半自动化系统进行的鉴定和敏感性检测可以在92%～99%的败血症病例中鉴定革兰氏阴性病原体，而在43%～75%的病例中鉴定出革兰氏阳性。这些系统的优点是常规微生物中最常见的病原体可以在4～16小时内鉴定。敏感性结果显示与常规方法95%的相关性。
MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法）：大多数实验室可以使用MALDITOF MS来鉴定培养的细菌和真菌。由于该方法基于保守的微生物核糖体和其他蛋白质的质谱测量，结果是精确的，大部分等同于DNA测序。由于可以从非常小的样品量（104～106CFU/ml）进行测试，因此通常可以在短时间内进行几乎不可见的分离菌落的测试，并将物种鉴定结果及时传达给医生。应该强调的是，MALDI-TOF MS可用于直接从血液培养瓶中鉴定病原体［9］。可以鉴定到物种水平，鉴别致病菌和污染菌［10］。不同的分离和裂解方案可用于从培养基中除去人源蛋白质，并将样品中的细菌浓缩至合适的量，得到80%～96%的正确鉴定结果（与常规培养和鉴定方法相比）。然而，该方法并不适用所有的标本（例如含有活性炭的BC培养基，多微生物感染）。
（杨永弘 沈叙庄）
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