第三章　肝脏的病理生理学

肝小叶由肝细胞、胆管细胞以及非实质细胞组成。形态与功能学分析表明，肝脏约80%由肝细胞组成，发挥着肝脏的主要功能。非实质性肝细胞，虽然仅占肝脏体积的6.5%，却占肝细胞总数的40%左右，主要位于器官的血窦部位。肝血窦壁至少由3种不同的细胞组成，包括肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC），库普弗细胞（Kupfer cell，KC）和肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC，以前被称为贮脂细胞、伊藤细胞、脂肪细胞、窦周细胞或富维生素A细胞）。另外，肝内淋巴细胞常常出现在窦腔内，包括所谓的隐窝细胞，即现在的肝脏特异性自然杀伤细胞。在正常以及病理生理条件下，肝细胞的很多功能受到周围非实质细胞分泌的因子的调节。由于篇幅有限，本章节中仅讨论正常或急慢性肝脏损伤情况下发挥功能的肝细胞群。有兴趣的读者可以参考更多详尽的专业文献。

实质性肝脏细胞（如肝细胞）为多边形/多面体的细胞，有时为双核，直径为20～30μm，占肝脏总重量的80%左右，通常具有3个主要的表面结合位点：

1.基底膜或肝窦上的结合位点，具有微绒毛，参与肝窦内的血液循环。

2.侧面的结合位点，以邻近肝细胞的联络复合物为特征。

3.胆小管结合位点。

肝细胞是关键的肝脏效应器细胞，不仅发挥主要的肝功能，同时也是肝脏特异性代谢对象如肝炎病毒及许多有毒复合物，包括乙醇的攻击对象，并最终导致急慢性肝损伤。肝细胞也可以由于自身免疫、代谢紊乱或基因突变而发生损伤。

本节内容中，除了简单回顾实质细胞的主要生理功能之外，我们将讨论2个主题：

1.作为急慢性肝损伤动力的肝细胞凋亡。

2.肝细胞是巨噬细胞穿过上皮-间质的细胞源动力。

1.通过糖原合成、糖原分解、糖异生作用调节血液中的葡萄糖水平；

2.脂质代谢，可以合成脂蛋白或通过线粒体的β氧化、过氧化物酶氧化分解细胞内的外源性或内源性脂类；

3.通过第一阶段（氧化还原）或第二阶段（结合、水解）反应来代谢/失活外源性（药物、乙醇、毒素、环境污染物、致癌物）和内源性（类固醇激素、胆红素）复合物；

4.合成血浆蛋白质，包括白蛋白、急性期蛋白，补体成分和凝血酶原，纤维蛋白原等；

5.通过尿素循环代谢氨；

6.代谢维生素A及其他的维生素；

7.维持体内铁、铜、锌水平；

8.分泌胆汁。

从新陈代谢角度来说，肝脏实质细胞分布位置不同，称为成带现象或分布异质性。举个例子，门静脉周围肝细胞（Rappaport腺泡1带肝细胞），富含氧气和基质，主导葡萄糖异生作用，而静脉周围的肝细胞（Rappaport腺泡2带肝细胞），其血液中葡萄糖、氧气和基质已经部分消耗掉，主导糖酵解作用。对氧化物、氨基酸、外源化学物与氨进行代谢的肝细胞也呈带状分布。

肝损伤以肝细胞坏死或凋亡或者更多情况下是两者同时存在为特征。实际上，相同的外界刺激常常能同时诱导这两种不可逆性细胞死亡的发生。Malhi和Gores曾指出，就细胞水平而言，坏死可能仅为过度凋亡或者凋亡失调的结果。举例来说，通过凋亡信号级联反应导致线粒体功能失调进一步恶化也是坏死的一种。由于检测血清中M30（由caspase 3水解肝细胞角蛋白18所产生的抗原表位）开始广泛应用于临床实践，当前研究证实任何一种肝损伤中都存在凋亡，并且凋亡常为主导地位。

多种细胞内外信号和刺激都能触发肝细胞凋亡。其中，线粒体功能失调在此过程中起非常重要的作用。实际上，许多情形都能触发凋亡的发生，如死亡受体激活的信号级联反应（TNF、TRAIL和FasL）、内质网应激、JNKs激活、溶酶体透化作用等。这些因素通过激活Bax和Bak或者通过改变线粒体通透性而使线粒体外膜的透化作用发生改变。在绝大多数急慢性肝病中都已经证实凋亡的存在，下面我们就举几个典型的例子。

对乙酰氨基酚过量是最常见的急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）模型。现已证实，JNK1和2亚型的激活和Bax向线粒体移位可触发凋亡的发生。同时，上述过程还伴随TNF、Fas和FasL的表达增加。不仅如此，NK细胞也参与了上述过程的发生发展。

在非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）患者中，凋亡与炎症和纤维化有关。脂肪变性的肝细胞对FasL和TRAIL介导的凋亡比较敏感。在此情况下，凋亡作用也可认为是游离脂肪酸诱导的和JNK介导的脂性凋亡以及内质网应激的结果。

在酒精性脂肪性肝炎（alcoholic steatohepatitis，ASH）前炎性细胞因子所形成的微环境中，凋亡又一次被证实起主要作用。激活的库普弗细胞释放能介导凋亡和炎症的TNF，同时血液中TNF、Fas、FasL和TNFR1水平也显著增加。ASH发生凋亡可能与ROS大量产生有关，同时与由ROS或乙醛（乙醇的主要代谢产物）诱发的内质网应激也存在一定关系。

由于丙肝病毒感染的肝细胞Fas表达增强以及表达FasL的T淋巴细胞活性增强，Fas介导的细胞凋亡与炎症反应的严重程度相关。人慢性病毒性肝炎以及非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）中，配体与 TRAIL1、2受体相结合，引发TRAIL介导的细胞凋亡。此外，丙型肝炎病毒核心或包膜蛋白可使肝细胞对TRAIL、TNF或FasL介导的细胞凋亡敏感。乙肝病毒感染引起的急慢性损伤几乎具备所有上述的肝细胞凋亡。

肝细胞凋亡是体内、外实验中胆汁淤积型肝损伤的一个突出特征。甘氨鹅脱氧胆酸（glycine chenodeoxycholic acid，GCDCA）可以通过依赖FasL或非依赖FasL机制诱发细胞凋亡；后者的作用机制即是在肝细胞质膜进行自发性低聚化和磷酸化。GCDCA也可以上调TRAIL-R2的表达，然后致敏肝细胞进行TRAIL诱发的细胞凋亡。

除此之外，以下几点必须引起重视。肝损害中的细胞凋亡，不论病原学如何（三酰甘油累积、甘氨鹅脱氧胆酸或病毒蛋白的活动等），可能主要发生在本身有损害的、“脆弱的”或受压的肝细胞，同时也认为该条件下可以致敏细胞对死亡配体如TNF、TRAIL、或者FasL等的结合。而且，肝细胞凋亡可以通过至少两种机制引起纤维化进展：

（1）库普弗细胞贪婪地吞噬了凋亡小体，导致库普弗细胞激活和致纤维、致炎细胞因子如趋化因子、ROS以及其他介质引起的炎症反应持续存在，并影响HSC的活动。

（2）凋亡小体可以被HSC吞噬，并导致HSC的激活，以α-SMA、前胶原蛋白Ⅰ、TGF-β1表达增加为标志。

目前的研究采用TRAIL受体抗体或总凋亡蛋白质酶抑制剂，提出将细胞凋亡阻断机制应用于急慢性肝病的治疗。此外，研究表明熊脱氧胆酸治疗胆汁淤积疾病方面的部分功能可能与抑制的肝细胞凋亡相关。

上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是一个细胞可塑性的整合过程，它使上皮细胞失去它们的极化性和特有的组织结构，进行细胞骨架重组，获得间充质细胞的形态和功能特征。最初在胚胎发育中提出EMT的概念。在胚胎发育中，细胞迁移和组织重塑在多细胞机体中对于调节细胞生物形态形成有重要作用。近来研究表明EMT是一种一般的生物过程，它在一些病理生理条件下包括癌症进展以及肾脏、肺纤维化中调节肌成纤维细胞样原始纤维细胞形成过程中均有作用。EMT在慢性肝病中起一定作用，体外典型的EMT首次报道于培养的大鼠新生肝细胞、培养的鼠原代肝细胞，以及暴露于若干生长因子和细胞因子下不同的非肿瘤细胞系肝细胞株中。特别是TGF-β1通过Smad2/3信号系统引起所有经典的EMT变化（激活SNAI1、下调E-cadherin和肝细胞转录因子HNF4，及上调间质化和侵入性标记因子）。其中一项研究中指出虽然少于10%的成纤维细胞特异性蛋白1（f i broblast special protein-1，FSP-1，EMT标志物）阳性细胞共同表达巨噬细胞标志物，但受损肝脏中具有侵入性表现的肝细胞表达FSP-1。 AlbCre.R26R、 toplacZ双转基因小鼠上的追踪实验表明，肝纤维化严重时有15%左右的肝细胞FSP-1阳性，另外大约5%的肝细胞同时表达FSP-1或白蛋白，提示EMT在其中也发挥一定的作用。此外，BMP-7显著抑制纤维化加重并催化TGF-β1信号系统通过EMT转化形成纤维细胞。利用肝细胞中过度表达的Smad7抑制CCl ₄诱导的纤维化转基因小鼠模型的研究也得出类似的结果。

然而，目前我们仍然缺乏设计完善的临床研究来确定EMT在人慢性肝病纤维化进展中的作用，但对于HSC/肌成纤维细胞（myof i broblasts，MFs）的作用已有深入研究。

库普弗细胞（Kupffer cell，KC）是根据病理学家Carl von Kupffer来命名的，他首先提出KC是常驻于肝脏的巨噬细胞。网状内皮系统中80%的组织巨噬细胞以及15%左右的肝细胞均为KC。KC主要集中于肝小叶的门静脉周围区域，可以沿着血窦壁游移。KC来源于循环中的单核细胞并具有自我更新能力。在肝移植后，捐赠者KC在1年内会被受体KC所取代。

KC是抵御肠道来源的细菌、内毒素（脂多糖）和抗原的第一道防线，并起着抗原呈递细胞的作用。KC连同NK细胞、树突状细胞、可溶性因子是自身免疫的关键组成部分。此外，它们参与清除衰老红细胞和血红蛋白-结合珠蛋白复合物。该活动与氧化损伤和微循环相关。亚铁血红素组中的血红蛋白被血红素加氧酶-1降解，进而产生抗氧化剂胆绿素、一氧化碳，以保护肝脏微循环。

我们可以分离KC并放在培养基中进行研究。激活KC的最有效因子是补体C3a和C5a，以及微生物的产品如LPS。一旦被激活，KC将分泌几种介质，在宿主防御和组织损伤中起重要作用。激活NADPH氧化酶将产生超氧阴离子，帮助摧毁被吞噬的生物体，但同时对周围细胞也造成一定危害。KC同时表达组织型和诱导型的环氧合酶，促进前列腺素、血栓素合成。前列腺素可调控KC中肿瘤坏死因子的合成，血栓素A ₂促使肝星状细胞收缩，从而促进门静脉高压。

与其他肝细胞一样，KC在生理和病理中的作用证据主要来自于动物模型的研究结果而非人体实验。KC在天然免疫中起重要的作用。它们有助于消除微生物、死亡细胞和LPS，并在一定程度上清除有毒物质包括乙醇等。特别要注意的是，动物实验表明，KC有助于减少肝损伤，能够抵抗CCl ₄、LPS、氨基半乳糖和对乙酰氨基酚；另外，KC能够产生促炎细胞因子（包括TNF和IL-6）和高水平的氧化应激产物、蛋白水解酶和类花生酸类物质。KC释放的ROS可以杀死细菌和其他微生物，同时可造成组织损伤。此外，KC可以产生一氧化氮（nitric oxide，NO），NO在肝脏病理生理学中的作用仍存在争议。在某些情况下，NO已被证明能保护肝脏不受损伤，如被四氯化碳麻醉的啮齿动物。然而，在动物受到肝缺血/再灌注损伤时，NO可能结合氧化应激产物形成有毒的过氧硝酸盐。在胆汁淤积模型中，KC中IL-6的表达已被证明会降低损伤和减少炎症的发生。更具体地说，KC在以下肝损伤中发挥重要作用：

内毒素介导的KC活化是导致肝损伤的一个主要机制。事实上，门静脉血流中内毒素浓度的增加是某些条件下包括酒精性肝病的一个共同特点。在CC1 ₄处理的大鼠中，使用内毒素将会加重肝损伤。在一些模型中，蛋白水解酶的产生是导致肝脏损伤的一种机制。

肝星状细胞（HSC）是肝纤维化过程中的重要组成部分。然而，KC在HSC活化和纤维化状态的维持中均有作用。尤其是KC表达的TGF-β1已经被证明有助于激活过程。此外，KC环境下的介质上调PDGF受体，这是激活过程中的一个标志物，增加PDGF介导的增生。激活的KC分泌促炎因子引起趋化因子的产生，如HSC分泌的单核细胞趋化因子，能够加重炎症过程。例如，KC同时产生明胶酶如MMP-2，能够降解细胞外基质，并活化HSC。

细菌的快速清除取决于KC和中性粒细胞的密切相互作用。KC与细菌结合，然后被中性粒细胞吞噬并杀死。KC同时参与清除中性粒细胞，是炎症发生的一个关键环节。KC在肝脏脓毒症中亦有作用，如果经LPS预处理后，血液中KC数量增加，预后改善。相比之下，KC功能受损人群更易于受到感染。在一个李斯特菌病模型中，KC的失活将引起抗感染能力的下降。KC的抗感染能力与促炎细胞因子、趋化因子以及炎症细胞相关。有趣的是，在扩散到肝脏其余部位之前，KC已经被巨细胞病毒和利什曼原虫所感染。与此相关，肝衰竭的患者之所以易受感染，在一定程度上可能与其体内缺失KC清除肠道移位的细菌相关。另外，与此机制相关的临床因素就是后期肝脏疾病患者内毒素的存在。最后，在病毒感染或者其他与肝损伤相关条件下，如移植排斥时，KC可以通过CD95直接参与肝细胞凋亡的过程。

酒精诱发的损害中，KC释放的细胞因子、促炎症介质、活性氧在疾病的发病机制中起一定作用。NF-κB介导表达的细胞因子包括TNF、IL-6以及炎症趋化因子，如IL-8，发挥主要作用。 TNFR1基因敲除的小鼠中酒精性肝损害减少也表明了疾病与TNF之间相关。KC有一个激活的表型，在慢性酒精摄入的人群中数量有增加。值得注意的是，内毒素受体CD14在酒精性肝损害时表达增加，增强因为消化酒精引起的慢性内毒素血症。此外，内毒素与乙醇协同作用来增加NF-κB的激活和细胞因子的表达。

非酒精性脂肪肝的模型中描述了KC活化，而KC活化至少部分是由促炎介质（如TNF）介导的。最近，Kodama等报道，在酒精性肝病嵌合小鼠模型中，KC中JNK1的激活是炎症和纤维化的关键因子。此外，NASH患者KC中壳多糖酶表达增加，与HSC的激活和纤维形成相关。KC同时也调节肝细胞内胰岛素抵抗与脂类代谢，说明KC与其他细胞之间存在相互作用。在模拟脂肪性肝炎实验中，由KC释放的内生大麻素类似物也被证明加重肝损害。

在酒精和非酒精性脂肪肝中，内毒素激活toll样受体，刺激促炎性细胞因子和ROS的产生，而先天性TLR-4失活有助于保护机体免受以上造成的损害。TLR-4下游途径包括激活MyD88和TRIF，但只有删除TRIF才有助于改善酒精带来的伤害。缺失p47 ^phox带来的保护作用和酒精诱发的损害表明NADPH氧化酶的激活是另一条途径，它有助于增加LPS刺激时引起的TNF的表达。另一个有趣的方面就是脂联素的作用，它是脂肪衍生的细胞因子，可以抑制酒精和非酒精性脂肪肝的形成。脂联素参与代谢和抗炎活动，包括抑制活化KC释放TNF。同样，细胞内产生的环腺苷酸能够降低炎性细胞因子的表达。

目前认为细胞内谷胱甘肽的消耗和反应性氧核素的产生是至关重要的。虽然一些数据表明，KC的失活可以降低对乙酰氨基酚毒性，但最近也有证据表明在此条件下KC可能是有利的。事实上，使用氯膦酸二钠脂质体清除KC后，使抗炎分子产生减少，反而可能加重肝损伤。在这个模型中，KC产生的NO和诱发肝细胞增殖的ELR-CXC趋化因子起一定程度的保护作用。此外，KC分泌的IL-10和IL-18，有助于减少对乙酰氨基酚引起的损伤。

对于肝切除和肝移植患者来说，缺血再灌注损伤是非常关键的，而其中KC的活化在介导损伤过程中起重要作用。NADPH氧化酶的激活产生反应性氧核素，导致NF-κB的激活，引起TNF、黏附分子和趋化因子表达增加。灌注谷胱甘肽的抗氧化剂有助于减少氧化应激损伤和促使KC产生ROS，达到减少肝脏损伤的目的。由此可见，KC或者其他细胞产生的NO可能具有保护作用，因为它可以导致少量过氧亚硝酸盐的形成。

KC可以作为抗原呈递细胞并且表达MHCII抗原，由此KC可能在肝移植后的胆道损伤具有重要作用。此外，KC产生的ROS和细胞因子与KC活化在缺血/再灌注损伤中可能引起并调节肝损害程度。KC也可能与免疫耐受的产生有关，它可以导致免疫反应性T细胞的凋亡。

7.肝细胞再生 肝脏手术或劈离式肝移植术后肝脏的再生能力是至关重要的。活化的KC释放能够促进肝细胞再生过程中NF-κB和STAT-3有丝分裂的TNF以及IL-6，对肝细胞再生来说是至关重要的。白细胞与补体的激活亦参与KC的激活。

8.门静脉高压 当受到促炎因子的刺激或内皮素-1灌注时，KC反应性地产生花生四烯酸，产生血管收缩代谢物，血栓素A2，并使门静脉高压加重。

9.肝癌 肝脏中充满肿瘤细胞之前，如果KC耗竭将会加快肿瘤发展。KC已被证实可吞噬肿瘤细胞，可能会通过产生IL-12诱导NK细胞介导的细胞毒性，进而影响癌症的发展。此外，KC产生的NO的产量可能会导致针对肿瘤细胞的细胞毒性，而受到IFN-γ的刺激，将增强KC对转移性肿瘤细胞的毒性。相比之下，一旦发生转移，KC分泌的蛋白酶和血管生成因子可能会导致肿瘤恶化。

Von Kupffer最早提到肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC），他观察到窦周间隙星形细胞，并认为属于周围血管神经网络来源。在20世纪70年代早期，Kenjiro Wake提出Kupffer。描述的星形巨噬细胞与Ito描述的贮脂细胞相同，而且其中主要由含有类视黄醇物质的脂滴组成。过去20多年，我们认识到HSC在肝纤维化与肝脏修复中的作用，才提出真正意义上的HSC的生理和病理生理特征。HSC被称为脂肪细胞、贮脂细胞，或窦周间隙星形细胞，直到1996年，国际研究小组建议命名其为肝星状细胞。

肝星状细胞位于与肝细胞、肝窦内皮细胞紧密接触的Disse间隙。虽然HSC总数仅占肝细胞总数的一小部分（5%～8%），但其立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。HSC具有在内皮下游走的功能，以确保其与窦周上皮精密结合，它的超微结构以及维生素A含量也可以因它们在肝小叶内分布的位置不同而发生变化。细胞质中富含维生素A的脂肪滴为成人正常肝脏HSC最主要的超微结构特征，与HSC的主要生理功能相关，也提示HSC是肝脏贮存类视黄醇物质的主要细胞。HSC具有丰富的微管和微丝，使其能够发挥树突状吞噬功能，同时也在脂质的合成、运输中起作用。HSC拥有肌动蛋白样细丝，表明它们可能有助于加强内皮细胞排列和/或窦周间隙毛细血管收缩。

从人类或啮齿动物肝脏中分离、培养HSC技术的发展是该领域的一个巨大进步，这是研究HSC生物学特征的合适模型。分离手段包括第一步获得非实质性肝细胞的混悬液，其次是由于这些细胞脂肪含量大，密度低，需对其进一步进行提纯。然而，脂肪滴的存在是肝小叶中部分HSC的关键特征。因此，各方研究旨在寻找HSC上的细胞骨架或表面标志物，能够将它与其他非实质性肝细胞分辨。在这方面，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）异形体是活化HSC的一个可靠的标志物，因为在HSC刚被分离出来时，它并不表达α-SMA，只有经过一段时间培养或在体内纤维化后才表达。因此，α-SMA通常被认为是HSC活化的一个标志物。

HSC的胚胎起源仍是争论的焦点，由于它们的形态与间质细胞相似，并且细胞中结蛋白、α-SMA、波形蛋白表达阳性，所以曾经一度被认为是间质细胞。然而，由于HSC含有神经标志物，因此推测HSC可能是神经外胚层来源。其他的研究已经表明，肝细胞和HSC可能来源于一个共同的内胚层前体。最近的人类和动物模型研究结果表明是来源于骨髓前体。

在哺乳动物中，正常情况下50%～80%的类视黄醇储存在肝脏，HSC在维生素A的储存和代谢中发挥关键作用。富于视黄酯的乳糜微粒被肝细胞摄取并与特异性视黄醇结合蛋白质相结合，之后将这些化合物转运到周边的HSC中。周边HSC细胞内视黄醇结合蛋白对维生素A的吸收、贮存和动员进行调节。视黄酯和三酰甘油是HSC的重要组成部分。生理情况下，如HSC细胞需要增加维生素A时，就会动员HSC中的此类化合物，同时也动员HSC中的视黄醇受体包括视黄酸受体（retinoic acid receptors，RARs），α、β和γ型，和类视黄醇X受体（retinol X receptors，RXRs），α和β两种，但没有γ类型。

在正常的肝组织中，ECM占肝脏总重量0.5%左右，由数量少的几个非胶原成分组成，如纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、肌腱蛋白、波动蛋白、蛋白多糖和透明质酸。HSC所在的Disse间隙，是由Ⅳ型胶原蛋白与非胶原成分组成的ECM网状系统，提供肝细胞和血液之的最佳扩散场所。肝纤维化过程中，HSC是生产ECM的主要细胞，生成大部分的胶原蛋白。正常ECM代谢也包含着合成与代谢降解，在正常肝脏中，HSC通过产生金属蛋白酶-2（明胶酶或Ⅳ型胶原蛋白）维持ECM的塑形和Disse间隙形成，在这个过程中，也有可能有其他窦周细胞的参与。

HSC之所以可能作为周细胞与其解剖位置、超微结构特点以及与自主神经系统之间的紧密联系相关。值得一提的是，培养中的HSC在受到外界几个血管收缩因子刺激时，它们激活的表型可能与过渡细胞或肌纤维样细胞而非静止的HSC相似，表明HSC的收缩是肝纤维化的一个特征。HSC在正常肝组织是否具有收缩性仍然是一个争论的焦点，有些学者提出HSC并不参与血窦血流的调节，有些研究通过活体显微镜技术评估肝脏微循环后指出HSC可能参与调节弹性。

肝纤维化是多细胞、综合的过程，需要肝细胞与非实质性细胞包括炎症浸润细胞（如KC、HSC、LSEC）间的相互作用形成。所有类型肝纤维化均来源于组织损伤，此时肝细胞和非实质性细胞发出刺激HSC和其他MF纤维化的信号，引起ECM积累。激活的HSC是损伤肝组织中MF的主要来源。除了HSC细胞，最近确认几种产生ECM的细胞，包括门管区的成纤维细胞和肌纤维细胞，血管壁的平滑肌细胞，位于小叶中心静脉的MF。越来越多的证据表明，不同类型的纤维化有不同类型细胞的参与。也有证据表明，来源于骨髓的间充质干细胞和表达CD45的纤维细胞对于纤维化形成均有作用。具体是由哪些细胞参与则与病因以及纤维化类型相关。

纤维化的病理生理学上一个非常重要的概念是“激活”，通过这样的途径，HSC获得MF样的表型并具备成纤维的能力。HSC活化需要周边细胞释放的氧应激产物以及可溶性因子刺激的基因转录。一旦HSC和/或其他细胞获得MF样表型，将会维持纤维化过程并通过一系列的生物学行为进行放大，以执行有效的伤口愈合功能。这是通过表达和分泌胶原类型Ⅰ和Ⅲ连同分泌其他基质成分如纤连蛋白与蛋白多糖来实现的。TGF-β1代表这一过程中关键性的细胞因子，通过激活Smad家族细胞内分子来进行。

激活HSC在受到某些因子，其中最有力的是血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）刺激时，其增殖活性，生存和迁移扩散能力增强。HSC的定向迁移也受趋化因子的调节。细胞迁移的过程是伴随着肌动蛋白细胞骨架的完全改变，当细胞暴露于PDGF时，这种改变特别明显。

ECM的累积量不仅与其沉积量增多、而且与降解减少有关，主要取决于MMPs的活性。活化的HSC高表达TIMP-1和TIMP-2，它们与失活的MMPs结合，从而导致网状结构纤维化。此外，TIMP-1已被证明是星状细胞的一种生存因子，在纤维化的肝脏中将会加重纤维化。因此，目前认为抑制TIMP是一种很有前景的抗纤维化途径。同样的，HSC也表达参与调控基质降解的血纤维蛋白溶酶的几种组成成分。

由血管活性因子如内皮素-1、血管紧张素Ⅱ或凝血酶诱发的收缩，与门静脉高压的发病机制有重要的关联，导致了“可逆性”成分的增加，流向肝脏内。值得留意的是，HSC收缩过程中可能由NO或一氧化碳进行反调节，引起HSC舒张，减少门静脉压力。

活化的HSC分泌放大炎症过程和募集炎症细胞的细胞因子和趋化因子。MCP-1和IL-8是这些细胞表达的主要趋化因子。受到促炎细胞因子包括IL-1或TNF刺激时，机体首要炎症转录因子NF-κB的激活是上调趋化因子的表达的主要分子机制。

纤维化与血管生成是紧密联系在一起的，血管生成即从既存的血管分支形成新生血管。在实验及人体慢性肝损伤中已证实存在血管生成现象，此外，活化的HSC可通过分泌血管内皮生长因子或血管生成素-1等参与血管生成过程。这些细胞因子在低氧反应以及受到PDGF或瘦素等因子刺激时表达。

最近研究表明HSC能够维持干细胞巢，其中具有双向潜能的肝脏祖细胞可以向肝细胞或胆管细胞转化。肝脏损伤情况下，HSC巢被破坏，引起干细胞的成熟与分化，最终导致HSC激活。

肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）是具有高度特异性的薄层细胞，沿肝血窦排列，隔开来源于门静脉与实质细胞的肝窦血流。在1972年，Eddie Wisse提出LSEC是一种特异性细胞类型，此后人类开始研究这些细胞的动态和多重性功能。在本章节中，我们将回顾LSEC的重要生理和病理生理作用。

LSEC窗孔，占细胞表面的5%～10%，为直径50～150nm的孔；若干种窗孔成特异性的簇集状分布（如肝筛板）；LSEC缺乏基底膜或隔膜。位于门静脉周围血窦的窗孔较大，而中心静脉周围的血窦则具备更大的窗孔，可以允许血浆和一系列相关的基质进入Disse间隙，只有细胞和大的脂蛋白，主要是较大的乳糜微粒，因为窗孔大小而被滞留。事实上，LSEC是一种非常有效的净化内皮细胞层，它利用网格蛋白介导的内吞作用来清除来源于血窦的内源性以及外源分子，包括病毒颗粒等。LSEC从全身循环中清除的废弃大分子包括：

（1）甘露糖或巨噬细胞受体介导内吞作用，对象为结缔组织代谢产生的大分子物质包括α-链，前胶原C或N-端肽（如PICP、PINP和PIIINP）、透明质酸、硫酸软骨素。

（2）巨噬细胞受体具有介导内吞氧化以及乙酰化的低密度脂蛋白，晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的作用。

（3）Fc-γ受体Ⅱb2具有介导清除免疫复合物以及微生物CpG序列形成的作用。

血窦内皮结构的任何显著变化与LSEC的损害将明显影响肝细胞与血窦血流的双向基质传送，也对LSEC的内吞功能产生影响。特别是，血窦的损害可能使LSEC通过一个称为肝窦毛细血管化的过程而失去多孔性与清除功能。

缺血/再灌注损伤，早期血窦堵塞综合征或早期对乙酰氨基酚中毒都可能使肝血窦内皮细胞受到损害，甚至导致细胞间的分离。此外，血窦可能在纤维化后引起堵塞，特别是在酒精性与非酒精脂肪肝（ASH与NASH）中发现的周围血窦纤维化后。有趣的是，在这些大多数微血管损伤中，血窦的改变可能是导致肝细胞缺氧、肝功能障碍与门静脉循环中断的主要事件。

在最近的15年里，越来越多的证据表明LSEC在急性或者慢性肝脏损害时被激活或受到损害，可能通过合成、释放生长因子、细胞因子、趋化因子及其他的调节因子来参与机体的病理生理过程。以下再次列出LSEC分析的生物活性调节因子来加深印象。

（1）多肽细胞因子如血小板源性生长因子BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGFBB）、转化生长因子 β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、碱性成纤维生长因子（basic fi broblast growth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子 1（insulin-like growth factor，IGF-1）参与伤口愈合与纤维化过程，并且都可能参与调节HSC的反应。

（2）促炎因子与相关的调节因子，主要包括IL-1等。

（3）血管活性肽与调节因子包括NO、内皮素、前列腺素，在一些病理条件下特别是慢性肝损伤中有相应作用。

（4）目前的研究表明LSEC有助于活性氧的生成，但作用程度较肝细胞与其他的非实质性细胞轻。

这几个病理条件下，组织缺氧非常普遍，将影响肝实质细胞功能，在肝移植的肝脏保存环节中，LSEC是缺血/再灌注损伤的主要作用对象。

虽然肝脏血窦（大约5%）正常氧分压比大气氧分压低，但是如果暴露缺氧条件或在可能导致缺氧的环境中（如血液中酒精水平高），机体将通过缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）引发基因重组。

LSEC在病理性血管生成中有重要作用，且缺氧的肝细胞与HSC分泌生长因子、趋化因子，主要是VEGF-A，它可刺激内皮细胞摆脱它们在血窦中原有稳定的位置，促进发芽、分叉及形成新的管腔网络工作，一个缺氧诱导的进程以恢复正常的血液和氧气供应，而其中内皮细胞之相互作用，特别是顶端与中间部分的EC，将通过缺口Notch途径扮演重要作用。

在所有实验以及临床慢性肝脏疾病中，已经有证据表明汇管区存在较多的内皮细胞以及特征性的新生微血管结构，而事实上不论病因如何，新生血管在肝硬化的血管变化进程中都具有重要作用。

LSEC、白细胞以及癌细胞之间的相互作用：目前已知白细胞或癌细胞与LSEC之间的相互作用与肝损伤的发病机制密切相关。在这些细胞-细胞相互作用中，大量的黏附分子扮演着重要角色，而它们的表达主要受炎性细胞因子如IL-1、TNF-α、IFN-γ的调控。在正常肝脏组织中的LSEC主要表达细胞黏附分子-1、细胞黏附分子-2、白细胞功能相关抗原-3、极晚期抗原-5与CD44。在急性或慢性肝病患者中，炎症肝脏组织中细胞黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的表达显著增强，正常情况下，机体不存在选择素，但是应用LPS诱导后可产生选择素。

在结直肠肿瘤的转移中，有文献提出单个肿瘤细胞进入肝血窦时，因其直径超过血窦的直径而被卡住；在管腔被堵塞后，它们的黏附分子与LSEC的表面分子相互作用，促使它们向外渗透并进入肝实质，这是肝转移早期阶段非常重要的一步。

LSEC可以通过Fc-γ受体与模式识别受体（如甘露糖与巨噬细胞受体），因此我们应该将其视为LSEC参加天然免疫反应。根据某些研究表明，LSEC可能通过MHCⅠ、Ⅱ抗原以及共刺激分子例如CD40、CD80和CD86的表达促进抗原呈递，但至今为止，对此学术上还是存在争议的。的确，不同于其他的传统上的抗原呈递细胞，LSEC不能诱导新生的CD4 ⁺ T细胞分化成为Thl亚型，一个与LESC中产生的负免疫调节细胞因子量相关的特征——致敏的T细胞的再激发有助于肝独特的免疫耐受功能。

肝脏是一个具有复杂结构的器官，组织中所有不同类型细胞在不同的生理条件下特别是疾病条件下发挥相应作用。更好地了解每种细胞类型的功能，以及它们之间的相互作用，尤其是在疾病的条件下的作用，能够为肝病的诊断和治疗提供新的方向。

2003年，人类基因组测序也称为人类基因组计划（human genome project，HGP）的完成，是全世界共同努力的结果。人类基因组计划的完成为我们提供许多新知识的同时，也使基因组学这一新兴学科不断发展。同时，基因组学也为基础研究和转化研究的发展奠定了基础，并且有利于更好地理解肝脏疾病的病因学以及改善疾病的治疗和预后。由于肝病专家精通于对肝脏相关表型和特征进行评估和分类，因此他们将会直接或间接影响肝脏疾病基因组学的发展以及应用。

在接下来的章节里，我们将讨论以下几个问题：

1.单基因遗传疾病和多因素疾病的区别；

2.人类基因组的结构和变异；

3.遗传变异对疾病表型的影响。

总的来说，家族遗传性疾病包括以下3种：染色体病、单基因遗传病（即符合孟德尔法则的疾病）以及复杂疾病（即多因子疾病）。染色体病是整个染色体或者染色体片段的缺失或增加。很多染色体病是由于异常染色体片段或者整个染色体的缺失或增加，这将会导致自然流产。在临床工作中，大多数肝病专家都没有遇到过染色体病的患者。单基因遗传病（即符合孟德尔法则的疾病）表现为家族遗传模式（即常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传以及X连锁遗传），疾病的表型是基于单基因的罕见突变。单基因遗传病在人群中并不常见，最常见的单基因遗传病为遗传性血色病，发病率大约为1/300。由于孟德尔病特定的基因型与特定的表型直接对应，因此其遗传基础十分简单。通常认为酒精性肝病、非酒精性脂肪肝炎以及原发性胆汁性肝硬化等复杂疾病是受多因素影响的。这些疾病是由多个基因的交互作用或者基因与环境的交互作用引起的，这可能会对疾病表型的遗传效应给予一定的解释，也可以解释复杂疾病为何存在病因的异质性以及表型的变异性（即疾病的临床表现、疾病进展以及对治疗的反应）。因此，单基因遗传病中一个基因型对应一个疾病表型的规则并不适用于复杂疾病。尽管复杂疾病表现为家族聚集性（即先证者亲属患病风险高于一般人群的），但这种遗传效应却不像单基因疾病那样能够预测。肝病专家在临床工作中遇到的大多数疾病都是复杂疾病，这类疾病与基因组研究密切相关。

基于人类基因组计划，我们现在已经知道：

1.人类基因组中基因的数目约为30 000个。

2.基因不均匀的分布在23对染色体上。

3.只有少于2%的基因组DNA编码蛋白质。

4.超过50%的基因组DNA由重复序列组成，但其功能尚不清楚。

5.大多数的人类基因都会进行选择性剪切——产生具有不同功能蛋白质异构体的分子机制。

6.自从人鼠分离开始，编码蛋白质基因组区域中少于50%的DNA已经存在7 000万年。这表明基因组的非编码区域受到了进化选择。

由于人类相对年轻（10万～12.5万年），遗传物质从我们的祖先传递下来只经过了约5 000代，因此人类的遗传多样性相对有限（例如变异或多态性）。遗传变异影响健康和疾病，因此，更好地了解遗传多态性以及基因的生物功能将会使我们获得对人类生物学的空前认识。除了同卵双生子（即完全一致的）之外，任何两个人都拥有99.9%的共同基因序列。然而，这0.1%的差异所导致大约300万个遗传变异，个体的环境暴露（即家庭因素、生活方式、生活习惯等）将与之共同决定健康（例如体重）或疾病（例如酒精性肝病、胆结石、原发性硬化性胆管炎）。人类基因组计划的目的之一是建立一个具有数以万计现存人类遗传变异的综合目录。最常见的遗传变异就是单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。事实上，人类基因组序列中每500～1 000个碱基对就存在一个候补基因可以出现的SNP。例如一个单核苷酸多态性如C/T（即胞嘧啶和胸腺嘧啶的缩写）是包含2个等位基因之一的核苷酸基因座（C或者T）。一个SNP中基因频率比较高的基因称为主要等位基因，而另一个就叫做次要等位基因。基因组中SNP的位置将会决定它们的功能。位于基因内或者邻近基因的SNP很可能对基因功能造成影响，特别是当它们插入终止密码子或者改变蛋白质的氨基酸基团的时候。通常认为，位于基因间隔区的SNP对基因的功能没有影响，但它们可以作为疾病映射研究以及群体遗传学的有用的遗传标志物。其他较少见的基因组变异包括微随体的插入或缺失。

SNP由于其高频率而成为人类基因组最重要的遗传变异。这些很容易通过自动化高通量的方法进行检测和评价。SNP主要是代表生物多样性的遗传标记。在某些情况下，它们可以成为健康或疾病特征的原因。作为可遗传的变异标记，SNP可能十分接近于能够引起疾病的遗传因子。当将染色体上的SNP与引起疾病的等位基因进行重新整合后，发现这样的SNP与真实的遗传因子出现了连锁不平衡并且形成一个单体型。国际合作已经确定了基于SNP的单体型（即在相同染色体片段的邻近基因位点上发现的SNP等位基因的组合，这些组合表现为共同代代相传）。这些染色体区域（称为单体域）在人类基因组中占据了25 000～35 000个碱基对。更重要的是，尽管很多SNP存在于单体域中，但是仅仅一些SNP（称为标记型SNP）对于定义这个单体域以及它的单体型是不可或缺的。SNP和基于SNP的单体型方法是确定复杂疾病的遗传基础的强有力的方法，这些复杂疾病包括肝脏疾病。

常见变异假说是建立在目前60亿的人口规模代表了相对较小数量的人群的全球扩张的基础上得到的。这些人位于撒哈拉以南的非洲，而这次扩张发生在约10万年前。因此，目前的人类共享了来自于这一群体的一些基因。这个假说认为，等位基因在全球扩张之前就已经存在，而人类变异对于常见复杂疾病易感个体（即易感基因）的出现作出了巨大的贡献。这些等位基因使常见疾病处于中度发病风险，而且目前人群中基因频率较高人群更易患病（≥1%）。等位基因的高频率表明在大样本人群队列中的关联研究将可能确定常见复杂疾病的易感基因。人类基因组中单体域的存在以及目前大部分常见的单体域的数量都是有限的，都表明代表性SNP的关联研究（即标记型SNP）将能够寻找到常见复杂疾病的常见单体型与易感人群的关系。这一假说的科学性对于全基因组人类单体型图谱的发展十分重要，全基因组人类单体型图谱描述了所有主要的单体型以及特定的SNP（标记型SNP）并且对它们进行定义。

持反对观点的人认为大多数的复杂疾病是由于罕见基因而不是常见基因引起的。该假说预言复杂疾病基因位点上的广泛的等位基因和基因位点异质性（即相同基因位点上的不同等位基因以及同一等位基因位于不同的基因位点都可能独立地导致相同的疾病表型）。另外，在全球扩张以及人口分散之后，超过99%的变异将会诱发复杂疾病。如果此假说成立，通过在存在异质性的人群中开展全基因组关联分析将对寻找常见复杂疾病的易感基因是徒劳的。类似的是，目前对于单体型图谱的构建也是基于常见等位基因的（即人类单体型图谱），因此其对于确定常见复杂疾病的变异也并非十分有利的。

由于连锁策略对于检测复杂疾病致病基因面临巨大挑战，一些替代方法如关联研究等，逐渐兴起。关联分析基于病例对照设计，寻找特定遗传变异与疾病或者疾病特征之间的关系。对于检测对疾病表型影响较小的基因，大型关联研究要比连锁方法具有更好的统计效能。遗传变异（SNP）可以位于基因（候选基因）内部或者分布在整个基因组范围内。

评价生物学中可能候选基因的遗传变异的关联研究需要遵循以下一般程序：

1.假定基因是疾病病因的一部分。

2.功能基因变异位于或者十分接近于编码区，57和37非翻译区以及候选基因的内含子/外显子交界处。

3.研究对象是确定的，包括对病例中疾病表型的定义，所有个体都必须是匹配良好且相互独立、不会互相影响。

4.病例和对照的基因型。

5.待检测遗传变异和疾病表型之间的关联需要经过统计学分析确定。

由于人群选择偏倚以及可重复性的存在，候选基因方法也有一定的局限性。结果无法重复的原因可能是之前的研究是基于小样本的（不多于200名患者），研究设计的不同或者疾病基因位点的异质性（涉及个体在不同的基因位点存在不同的变异）。

另一种基于关联策略的研究方法为全基因组关联。在这些研究中，将会分析所有患者（病例）和无关正常人（对照）的全基因组范围内成千上万的特定SNPs。连锁不平衡分析方法用于对识别易感基因或者变异的基因组区域进行绘制。这种方法由于考虑到特定的基因或者基因组区域而不存在偏倚。然而，可能由于人群选择的不同而存在偏倚。自从2005年起，全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）已经阐明了肝脏疾病（例如脂肪肝、原发性胆汁性肝硬化）和临床特征（例如慢性丙型肝炎对治疗的反应性）与候选致病SNPs之间的关系。已经出版的GWAS目录可以在国家人类基因组研究所的网站上获得。这些发现为检测疾病病因提供依据，可以预测个体易感性并制订疾病个性化的治疗措施。然而，这些基因组方面的发现由于某些问题的存在无法很好地应用于临床。例如，对于携带危险等位基因的个体，每个与疾病相关的基因位点的变异对疾病的贡献是很小的（比值为1.5或者更小）。另外，即使强关联也不能保证疾病和健康之间能够完全区分。此外，已报道的GWAS研究中与疾病关联的基因也可能不是致病基因。也许GWAS最主要的贡献就在于识别全基因组的区域和/或导致人类疾病的通路。GWAS不能发现能够引起疾病的罕见变异。要发现这些不常见的多态性，需要对人类基因组进行重新测序。最终，医疗服务的提供者由于其有限的知识不能对这些测试结果进行很好地解释，不能对他们的患者的利益和健康教育提供帮助。

人类单体型图谱阐明了人类基因组的所有序列。尽管这是一个里程碑，但是巨大的挑战仍然摆在我们面前。如何将这些序列数据转化为能够鉴别健康和疾病的基因或者遗传变异呢？无论对于科学家、医生还是其他卫生工作者来说，在未来的几年中这都还是一个巨大的挑战。

遗传变异，例如SNPs，会导致一个人的表型变化以及使某人易患某种疾病。位于同一染色体上的一组SNPs会成组遗传。人类基因组中约存在20万～40万个区域。尽管每一区域都有几千个SNPs，但只有一小部分的标记型SNPs能够用于区分基因组中的区域以及辨别区域内的单体型。目前，HapMap中都包含有这些数据。HapMap是单体域的先锋，其特定的SNPs将会识别每个区域内的不同单体型。在进行全基因组关联分析的过程中，这种方法限制了SNPs的数量。由于单体型在不同人群间存在差异，HapMap数据包含了4个种族的常见SNPs及单体型，这4个种族人数比较多（200～400人）且地理位置不同，他们分别是日本人、中国汉族人群、尼日利亚以及来自于北欧和西欧的美国居民。

医生有责任保护患者的医疗记录并且有责任在医疗过程中给予安全的给药方式：首要原则为不伤害。然而，遗传信息与其他信息（人口统计学信息、社会信息、医疗信息）不同，因为它包含某人以及他（她）的亲属的患病风险。因此，在基因检测之前，需要对相关的生物伦理价值进行审核，包括行善原则、尊重自主、隐私权、保密性以及公平性。这些原则决定了医生与患者以及他们的亲属应该怎样管理和处理这些遗传信息。遗传倾向性测试的法律和社会影响是多方面，并且是相互影响的。遗传信息应该被视为机密。遗传检测的结果只能发送给患者，医疗专业人员必须采取一切预防措施保证信息不会被泄露给第三方。通常情况下，要求医生告知患者基因检测的好处和风险，并且保持遗传信息的保密性并告知患者其本人以及家人所存在的遗传风险。

发现人类遗传易感性所面临的伦理、法律和社会问题是社会多方面的共同任务。医生和医疗服务提供者必须接受相应的培训，以知晓如何与患者及其家属解释和交流遗传信息，如何帮助他们对自己的健康作出更明智的决定。公共卫生机构则需侧重于如何确定遗传信息和遗传测试在常规临床应用中的价值。社会应该制定相应的法律并且对医务工作者的行为进行监督，以防止对遗传信息的不合理利用。

在接下来的几年里，基因可能会影响医疗工作。最终的目的似乎能够预测一个人罹患复杂疾病的风险，进而采取预防措施，如果需要的话也可以进行相应治疗。为了达到这个目标，以下3个步骤是必不可少的。首先，我们必须更好地理解人类基因组的结构（变异）和功能。其次，需要开展遗传流行病学研究来确定遗传易感性变异以及环境因素在疾病发生过程中所起的作用。最后，为了将这些科学发现转化为临床检测方法并且为有效治疗疾病药理指标的发展提供帮助，需要确定相关变异的功能。