基因序列分析与基因分型是分子流行病学研究中十分重要的手段，在进行基因分型与分析之前，首先要进行核酸的提取。不同的病原体具有其独特的核酸结构，有些是RNA分子，有些则是DNA分子，其分子量大小相差较大。目前能满足不同层次分析要求的较为成熟的提取方法有许多，但对于分子流行病研究而言，理想的提取方法应是可获得的核酸必须是纯度高，不被其他物质污染，分子结构基本完整，产量较高。在使用临床标本时，由于其标本量较少且来源有限，提取方法应先行优化，以获得较多量的高质量核酸。在应用培养的细胞时，可采用一些较为简单的方法，并通过加大培养细胞的量来增加核酸的提取量。总之，提取核酸的方法很多，其繁简和所制备核酸的质量差别较大，操作者应根据自己的实验条件和目的选用适当的方法。人的双倍体细胞含有7pg的基因组DNA和不等量的线粒体DNA分子，如果提取整个DNA，则其所获终产品为两种DNA的混合物。若要获得纯的基因组DNA，则必须先从细胞中分离出细胞核，然后再提DNA。但是，在一般情况下，大多都应用全部DNA进行实验，少量存在的线粒体DNA不会影响实验结果。一个哺乳细胞中含有的RNA量约为15pg，绝大多数（80%～85%）为核糖体RNA，仅有1%～5%的RNA分子为具有信息作用的mRNA分子，不同基因转录生成的mRNA分子大小和组成差异较大，但在真核细胞中mRNA的3′端都有一个聚腺苷酸尾巴，可与寡聚胸腺嘧啶核苷酸退火，故可用oligo（dT）纤维柱亲和层析法纯化mRNA分子。

基因组DNA的分离通常是在破坏细胞质和细胞核膜后再去除细胞蛋白而获得，除去蛋白的方法有两种：在EDTA和变性剂（枸橼酸钠）存在下加入蛋白酶（蛋白酶K）进行消化；使用有机溶剂（酚和氯仿）变性和抽提。乙醇和异丙醇能把DNA自水溶液中沉淀出来。所制备的DNA片段分子大小多在100～200kb间，适合于进行Southern分析和克隆入噬菌体载体中。影响DNA最终分子大小的主要因素有两个：细胞核酸酶和抽提中的机械损伤。内源性核酸酶在细胞裂解时极易被激活，需要将裂解物和核酸酶抑制剂充分混合，但过分剧烈的混合动作可造成核酸分子的断裂，故在操作时应轻轻混合。

RNA的提取过程主要有三个步骤，即为裂解细胞，除蛋白和将RNA从DNA中分离。但由于RNA分子比DNA分子不稳定且易被核酸酶降解。此外，RNA酶比DNA酶抗蛋白变性剂，所以制备未降解的RNA分子非常困难。在提取RNA时，裂解细胞和灭活RNA酶要同时进行。还应采取适当方法避免带入外源性RNA酶，由于皮肤上该酶较多，操作时需戴一次性手套。下列规则需遵守：所有使用水应当是含0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）经37℃中过夜并高压消毒处理的水，实验中应用的所有物品（玻璃和塑料器皿，尖头，电泳槽，凝胶盘等）均需用含DEPC水37℃处理2h。所有溶液需用含DEPC水配制（注意：DEPC可和氨迅速反应，故不可用于处理含Tris的溶液）；若经济情况允许，购买商品化的RNA酶抑制剂（vanadyl-ribonucleoside复合物，RNasin等）。

在DNA和RNA被提取出来后首先要对其进行纯度和产量分析。不纯的核酸分子能抑制后续的酶反应，尤其是DNA的限制性酶切反应，处理方法通常是用蛋白酶K和酚/氯仿反复抽提，如RNA分子仅被用于Northern分析，则无需用酶处理。总的原则是保证DNA长度符合大小，RNA不被降解。核酸定量是非常重要的工作，较多采用紫外分析（spectrophotometric method）和EB染色法（ethidium bromide staining）定量。紫外法中用在260nm时核酸的OD值（optical density）来表示核酸的浓度，1OD相当于50μg/ml的双链DNA，33μg/ml的单链DNA，40μg/ml RNA分子。260nm/280nm的比值可用于判断核酸的纯度，DNA和RNA的OD ₂₆₀/OD ₂₈₀比值分别应接近1.8和2.0。

质粒是分子生物学中常用的载体，质粒的提取也是分子流行病学研究中最常用的分子生物学实验方法。细菌质粒是一种环状双链DNA分子，其大小在1～200kb不等。它们在细菌内应用细菌的复制和转录系统但并不依赖于细菌染色体而进行复制。在自然情况下，质粒通过细菌之间的联结作用进入新的宿主细胞中。在实验室，质粒DNA可通过人工方法导入到细菌内，在这种情况下，所使用的二价阳离子可暂时增加细菌对小分子DNA的通透性。质粒中大都有编码选择标志的基因，常用的为能提供抗氨苄青霉素或四环素的抗性基因。近年来质粒载体发展较快，质粒中的序列已被减少到最低限度，但其接受各种酶切片段的外源基因的能力却大大增加。现在的大多数载体都含有合成的多克隆位点，如在pUC19中就有14个酶切位点。此外，具有多种用途辅助序列的质粒载体也不断涌现。常见的有：①用于组织化学方法鉴定重组克隆的质粒载体，最著名的是Messing等构建的pUC系列载体。这些载体带有一个来自大肠埃希氏菌的 LacZ操纵子的DNA区段，这一区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片段。异丙基β- D-硫代半乳糖苷（IPTG）可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因互补（α互补）。暴露于安慰性诱导物异丙基β- D-硫代半乳糖苷的细菌，可同时合成该酶的两种片段，铺在含有生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）的培养基上，将形成蓝色菌落。外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使β-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，破坏了α互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。②带有单链嗜菌体复制起点的质粒载体，如M13等，因能大量得到质粒DNA两条链中的一条链而常被用于测序和制备放射性单链探针。③带有噬菌体启动子的质粒载体，可用于体外转录。④质粒表达载体，目前已构建了许多这类含有大量强启动子的质粒载体，可使插入的外源DNA在原核或真核细胞中表达成蛋白质。载体种类较多，可根据需要选用：制备测序用单链DNA模板可使用pBluescript和M13等；体外转录外源性DNA可选用pSP64/65及其衍生载体pBluescript/pBluescribe，表达外源蛋白质可选用pBV220等载体；克隆PCR产物可选用T载体质粒等。

细菌在经冰冷CaCl ₂溶液处理后的细胞再经短暂加热，细胞即处于“感受态”（competence），此时它很容易摄取各种外源性DNA分子。常用的感受态细胞制备方法可转化产生10 ⁷/μg超螺旋DNA，常用的细胞株有JM109，HB101，TG1和TG2等。几乎任何大肠埃希氏菌菌株都可用于环状DNA质粒的转化。一般情况下，它们所产生的转化效率是能满足要求的，但如果有特殊的需要，如构建丰度较低mRNA分子的DNA文库，则需要改进方法。有些改良法在使用DH1，DH5和MM294等大肠埃希氏菌菌株后，其转化效率可达7.5×10 ⁸/μg超螺旋DNA，若使用电转移方法，则其转化率可达10 ⁹～10 ¹⁰/μg DNA。在此整个操作过程中应注意两点：细胞在收获时的密度要合适；操作过程尽可能处于4℃环境中。

当含质粒的大肠埃希氏菌培养繁殖达到一定量后，即可提取质粒。质粒的提取方法较多，但有其共性。首先采用EDTA或溶菌酶裂解细菌，也可使用有机溶剂，加热或非离子变性剂等方法破坏细胞，再用离心方法去除细菌残壁和染色体DNA。碱裂解法是较为常用的方法之一，其主要点是其中的碱性环境（pH 12）可使染色体DNA变性但并不变性质粒DNA分子，当用高盐溶液进行中和时，已变性的长单链染色体DNA在复性时会形成不溶性团块，离心时沉淀出来。由于在操作中使用了变性剂SDS，细胞RNA也可被沉淀，但有时并不完全。可采用酚/氯仿处理上清液以进一步除蛋白，用RNA酶消化残留的RNA。如对质粒的纯度要求高，还可采用密度梯度离心或过纯化柱的方法对质粒进行纯化处理。

质粒不仅可以作为一种载体用于分子生物学实验，而且由于同一种菌株可能会含有不同大小的质粒，提取后在电场中呈现不同的迁移，借此可鉴定不同的菌株，直接应用于细菌性疾病的分子流行病学研究中，以判断传播途径，追踪传染源。同一种质粒在电泳分析时，其构型有超螺旋环型（Ⅰ型）、带切口环型（Ⅱ型）和线型（Ⅲ型）三类，它们在通过凝胶时的迁移率不同，电泳时呈现三条区带。凝胶系统可根据需要和条件选用琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳。在进行电泳前先对质粒进行线性化处理，然后与分子量标准物一起上样，紫外线灯下观察结果并作出判断。同一种细菌的不同菌株，可含有不同类型的质粒，不同的质粒由于其大小不同，会表现出不同的电泳迁移率，借此可以鉴定不同的菌株。Threlfall等采用质粒图谱分析方法对来自人、家禽和鸡蛋中分离的S.肠炎PT4噬菌体进行了质粒图谱分析。在1988—1992年间分离的1 089株药物敏感株中，1 022株（94%）发现了质粒，其中38Mda的质粒最具有特征，在90%人的样本、70%的家禽和92%的鸡样本中均可见到它，其带型可归纳为25种。人菌株共有11种带型，鸡和鸡蛋的带型分别为21和3种。人带型中的8种可见于鸡，2种可见于鸡蛋，鸡中的15种带型在自人分离的菌株中未观察到。在1981—1988年菌株中共有的第二带型在1988—1992年的菌株中不存在。这说明该方法可用于快速有效地区别肠炎PT4噬菌体。

生物染色体的数目及大小称为该生物的染色体组型，又称核型。不同生物体的核型不同，同种生物体的不同型别之间具有染色体长度多态性，核型也不相同。因此，利用核型鉴定技术可以确定致病微生物的种类及其菌株的型别，以了解其在人群中的传染源和传播途径等情况，在分子流行病学研究中也较常用。核型多数情况下非常稳定，因而可以应用电泳核型技术对不同的菌株进行比较。由于染色体的分子量较大，故采用脉冲电流来完成。1984年Cantor和Olson两家实验室分别报告用脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）分离酵母染色体获得成功。电泳核型技术现有许多种类出现，如正交变电场凝胶电泳（orthogonal-field-alternation gelelectrophoresis, OFAGE）和外周弧电场凝胶电泳技术（clamped homogeneous electrical field, CHEF）等。此技术的分辨率易受缓冲液的温度，每个胶块的细胞量，原生质体形成和/或细胞溶解的程度等因素的影响。

新生隐球菌是一种具有荚膜的酵母样真菌，多感染长期应用激素的病人、器官移植者和AIDS患者，引发中枢神经系统疾病并成为致死因素之一。Perfect等采用外周弧电场凝胶电泳技术对包含四种血清型的7株新生隐球菌进行了染色体脉冲电泳分析，得到9～12条染色体，用于研究的每个菌株均具独特和重复的染色体带型，表现出明显的株特异性。他们还收集了临床和环境中的40株新生隐球菌并进行了电泳核型分析。结果显示：90%的菌株具有独特的染色体带型，相同来源的菌株间无带型的相关性，2例怀疑有院内传染可能的隐球菌脑炎患者，其各自新生隐球菌分离株的电泳核型明显不同，说明菌株间无关联，因而不可能是院内感染。在隐球菌脑炎复发病例中，其各自初始分离株和复发分离株的核型是相同的，提示复发是最初感染菌的复燃而不是新菌株的再次感染所引起。

酶切反应是分子生物学中的基本方法之一。不同的质粒由于其碱基顺序不同，其所具有的限制性酶切位点的种类和数目不同，因而在用相同的限制性酶切时不可能产生相同大小和数目的酶切片段，借此可区分不同的DNA或质粒。

限制性核酸内切酶是指能识别特异序列并从DNA内部切断双链DNA的酶类。目前发现的共有三类：Ⅰ类限制性核酸内切酶能结合于识别部位，但却随机切割回转到被结合酶处的DNA，Ⅲ类限制性核酸内切酶类可在识别部位切割DNA。由于Ⅰ和Ⅲ类酶分子同时兼有甲基化和切割活性，故不能用于基因操作。Ⅱ类限制性内切酶的修饰和切割活性分别由两种酶来完成，且结合位点和识别位点一致，是使用的主要酶类。Ⅱ类限制性核酸内切酶识别长度为4或6个核苷酸且呈二重对称的特异DNA序列。若限制性内切酶的切割DNA的部位不在识别序列的中心轴，则可在断端产生一个短的单股凸伸出来的不齐末端，称为黏性末端（sticky ends），反之，若切割部位在识别序列的中心轴处，即产生平齐的末端，称为钝性末端（blunt ends）。限制性核酸内切酶的命名原则是：第一个字母来自获得该酶的细菌属名的第一个字母，用大写；第二、三个字母是该菌种名的头两个字母，用小写；若该菌种还有不同的株系，则另加第四个字母或数字代表株系；最后用罗马字大写的数字代表同一菌株中不同限制性核酸内切酶的编号。其书写方式有两种：如 HindⅢ或 Hind Ⅲ。有些不同来源的限制酶能识别和切割某段相同的DNA序列，这些酶称为同裂酶，如 Mbo Ⅰ和 BamHⅠ可裂解相同的DNA序列。有些经限制性内切酶切割的黏端能通过连接酶使黏端相连，谓之有匹配末端，如分别经由 Pst Ⅰ和 Ava Ⅲ酶切处理的片段，可在连接酶的作用下相互连接。

限制性片段长度多态性是指如果DNA顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部位的DNA序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA时，便会产生与正常不同的限制性片段，即在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）。目前其实验流程基本为：提取染色体DNA、PCR扩增特定片段、限制性酶切反应和凝胶电泳分析。

传统方法将分枝杆菌鉴定到种的水平需要复杂的实验程序和比较长的时间，而分子生物学方法提供了一种更好的选择。Amalio等应用PCR法扩增各种分枝杆菌所共有编码65kd热休克蛋白的基因，扩增获得的产物再经限制性酶切作图形分析，意在建立简便的种鉴定方法。作者共检验了40株分枝杆菌标准菌株和330株临床分离菌株。应用生长在固体或液体培养基的菌株，经灭活后机械裂解。取裂解物行PCR经45循环，72℃延伸10min，引物Tb11（5′ACCAACGATGGTTGTGTCCAT）和引物Tb12（5′CTTGTCGAACCGCATACCCT）可扩增位于第398碱基和第836碱基间的一段长为439bp的片段。分别加入 BstE Ⅱ和 Hae Ⅲ酶，在适宜条件下酶切扩增产物。琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，并在溴化乙锭染色后紫外光下观察结果。为精确分辨不同的图形，以参照标准菌株呈现的片段间距和分子量之间的关系，绘制出标准图形并编制成计算机软件。将实验中的每份菌株的图形与标准进行对比分析和计算，结果显示实验中的不同菌株均有不同的特征性酶切片段。此结果同时被生化试验检测法、基因探针检测法16S rRNA基因序列分析等方法所证实。这说明应用 BstE Ⅱ和 Hae Ⅲ两个限制内切酶酶切处理PCR片段，可将分枝杆菌鉴定到种和亚种。与传统方法比较，此法还具有一些其他优点，如实验菌株无需超声破碎，无需在PCR后用特异的基因探针进行鉴定，全部工作可在一日内完成。这确为将分枝杆菌鉴定到种的快速方法，是分析分枝杆菌感染性疾病的流行病学研究的精确与简捷工具。