第一篇 临床篇
01 细菌耐药基因在人体、动物及环境中的传播和进化
近年来，随着多重耐药细菌和新型耐药细菌的不断出现，细菌耐药问题日益严峻。细菌耐药已不仅是医学领域关注的热点，同样是畜牧养殖、生态环境等领域共同面临的挑战。人类对抗菌药物的大量使用（包括临床及畜牧养殖），使得耐药细菌及耐药基因普遍存在于涉及人类、动物及整个生态环境的微生物群体当中。在所谓的“one-health”框架下，人类、动物及环境形成紧密关联的整体，而耐药细菌及基因得以在此整体环境中不断转移、进化和传播，形成一个错综复杂的网络。
细菌的耐药性主要由耐药基因编码。尽管耐药基因被认为是古老的，并且是细菌本身所固有的，但是抗菌药物的选择性压力无疑加速了耐药细菌的富集、耐药基因的传播和进化。耐药基因可大体分为两个类别，即固有耐药基因和获得性耐药基因。前者存在于某一特定种属内所有细菌基因组当中，是细菌天然耐药的主要原因。后者仅存在于部分细菌基因组当中，由可移动遗传元件（如质粒、噬菌体、转座元件等）所携带，能够在细菌间进行转移和扩散。此外，基因组的突变形成的耐药基因也可以被认为是获得性耐药基因的一部分。过往研究更多关注于某一个或某一类特定细菌中耐药基因（更多的是获得性耐药基因），而从更宏观的生态学角度揭示细菌群体中所有耐药基因的多样性及进化关系等的研究较为匮乏。随着测序和分析手段的不断进步，菌群层面耐药基因的研究日益增多，使人们对细菌耐药基因在群体中的进化、生态分布和传播网络有了更为深入的认识。
肠道是人体细菌群体最为密集的环境之一，也是人体中最大的细菌生态系统。肠道菌群中细菌细胞的数目是人体自身细胞数目的10倍以上，其编码的基因数量是人体自身基因数目的几百倍之多。这些肠道菌群基因蕴含了大量的关乎人体健康的遗传信息，其中就包括细菌耐药基因。通过对来自3个不同国家的162个健康个体肠道菌群耐药基因的分析，我们发现人体肠道菌群耐药基因的多样性和丰富度高于我们的预期。相比其他环境，如海洋、土壤、湖泊等，细菌耐药基因在人体肠道菌群中显著富集。我国人群肠道菌群中的耐药基因种类和数量明显高于其他两个欧洲国家（丹麦和西班牙），而且耐药基因的序列也有别于欧洲国家。我国是抗菌药物生产和使用的大国；大量使用的抗菌药物是否是导致我国人群肠道耐药基因丰富度升高的原因，以及哪些途径导致了耐药基因的富集目前并不十分清楚，然而潜在的关联性一定是存在的。例如，我们对不同年龄段人群肠道耐药基因的研究发现，这些基因的种类和数量随着年龄增长逐渐增加，从侧面说明了抗菌药物的使用与人体肠道菌群耐药基因的关系，即随着年龄的增长，直接或间接接触到的抗菌药物种类和数量在增多，而耐药基因也恰好在肠道细菌中不断富集。
畜牧养殖业的抗菌药物使用对人体健康的影响并没有直接和准确的证据，或者说还无法判断其对人体健康的影响程度。然而，我们发现四环素类耐药基因在人体肠道菌群中丰度最高，占所有耐药基因50%以上。统计近10年的抗菌药物使用数据发现，四环素类抗菌药物在临床治疗中使用量很小，而在养殖业中是使用量最大的抗菌药物。因此，有理由推测养殖业使用的抗菌药物对人体耐药基因的富集具有潜在的影响。哪些途径导致了耐药细菌和基因从养殖动物传播到人体？直接接触、抗菌药物残留导致大环境耐药细菌增多、食物链等可能都参与其中。食物链当属最重要的途径之一。人类作为食物链的终端，消耗大量的动物源食品，这些食品在生产、加工、交易等多个环节具有潜在的将耐药细菌传递给人体的风险。而肠道菌群首当其冲受到食物链的影响；很多过路细菌能够通过可移动遗传元件将其携带的耐药基因传递给肠道菌群中的土著细菌，在肠道密集的菌体环境当中，这些土著细菌又能够相互转移耐药基因。
2016年底，我国首次在零售肉类、养殖动物及其环境中发现了新型多黏菌素耐药基因mcr-1。该基因是第一个被发现的可转移的多黏菌素耐药基因，引起全球广泛关注。多黏菌素由于肾毒性的原因，在临床上极少使用；临床分离的菌株一直以来保持较低的耐药水平。然而，我们却在368个健康中国人的肠道菌群中发现27人（7.3%）含有mcr-1基因！这些人体肠道测序样品采集于2011年之前，说明早在mcr-1发现5年之前，该基因已经传播到人体肠道菌群当中。此外，在899个来自其他国家的人体肠道菌群中并没有发现mcr-1基因的痕迹。这些结果进一步说明了我国的细菌耐药情况不容乐观，而人体肠道菌群是一个巨大的耐药基因储存库，动物及环境中潜在的耐药基因很可能通过食物链等途径传播至人体。
耐药细菌及基因在人体、动物和环境中的传播可被看作是宏观层面上耐药性的适应性进化方式和途径，而耐药基因通过水平基因转移在细菌间的传播是耐药性物种间扩散的重要渠道。能够在物种间通过可移动遗传元件进行传播的耐药基因代表了更高的风险等级，我们把这类耐药基因称作可移动耐药基因，区别于不能够传播的固有耐药基因。可移动耐药基因在已知细菌中的分布并不均一，主要存在于4个细菌门当中：变形菌门、硬壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。通过对所有已知细菌基因组进行分析，我们发现绝大多数（77.5%）可移动耐药基因存在于变形菌门当中。而且，在变形菌门的肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌中，可移动耐药基因的多样性仍然在持续升高。此外，耐药基因不仅在变形菌门中丰度最高，它们的转移频率在该门当中同样处于最高水平。目前已知的很多人类病原菌都来自于变形菌门，而病原菌在人类对抗感染性疾病的过程中相比其他细菌受到了更多的抗菌药物选择性压力。因此，耐药基因在变形菌门中的富集也反映了抗菌药物使用与耐药基因丰度之间的正相关性。大肠埃希菌、沙门菌和肺炎克雷伯菌之间存在数量最多的基因序列完全一致（>99%核酸一致性）的耐药基因，说明这些耐药基因在这三类细菌当中频繁的交换和转移。这提出一个重要的问题，一旦这三种细菌中的任一种获得了一个可移动的耐药基因，该基因便很容易传播至其他两种细菌中。
值得关注的是，无论在哪个细菌门中，细菌的种属进化关系越近，细菌间的耐药基因转移频率越高；即使细菌处于不同的生态系统当中，依然如此。上述说明种属进化关系决定了耐药基因在细菌间的转移范围，而生态系统的差异仅起到了屏障作用。我们同时也发现，来自动物的细菌中可移动耐药基因的数量高于来自人体、水生环境、陆生环境的细菌中可移动耐药基因数量。而且，人体、水生环境、陆生环境细菌都分别与动物细菌共享更多的耐药基因。比较有趣的是，无论哪个国家人群肠道菌群都与鸡肠道菌群共享最多数量的可移动耐药基因，而且这些共享的耐药基因在已知的人类病原中广泛存在。当然，这些结果是否说明人体肠道细菌及人类病原菌从鸡的相关菌群中获得了大量的耐药基因，有待深入探讨。
总之，耐药细菌及基因在人体、动物及环境微生物组中广泛分布；耐药基因的流动使得细菌耐药性的扩散跨越了生态系统的界限。从宏观生态学角度来看，任何一个大的微生物群体受到了扰动都会波及（包括通过物理或生物学的驱动力等）其他生态系统中的微生物。抗菌药物的大量使用不仅导致了微生物群体结构的失调，而且造成了耐药基因的富集和“流动”。而随着耐药“基因池”的不断增大，将导致更多耐药细菌的出现。由于人类对新型抗菌药物的研究和应用严重滞后于细菌耐药性的进化速度，长此以往，人类未来如何赢得与细菌感染性疾病之间的“战役”值得深入思考。
参考文献
1.HU Y，GAO G F，ZHU B.The antibiotic resistome：gene flow in environments，animals and human beings［J］.Front Med，2017，11（2）：161-168.
2.WRIGHT G D.The antibiotic resistome：the nexus of chemical and genetic diversity［J］.Nat Rev Microbiol，2007，5（3）：175-186.
3.ALLEN H K，DONATO J，WANG H H，et al.Call of the wild：antibiotic resistance genes in natural environments［J］.Nat Rev Microbiol，2010，8（4）：251-259.
4 HU Y，ZHU B.The human gut antibiotic resistome in the metagenomic era：progress and perspectives［J］.Infect Dis Transl Med，2016，2（1）：41-47.
5.D’COSTA V M，MCGRANN K M，HUGHES D W，et al.Sampling the antibiotic resistome［J］.Science，2006，311（5759）：374-377.
6.SALYERS A A，GUPTA A，WANG Y.Human intestinal bacteria as reservoirs for antibiotic resistance genes［J］.Trends Microbiol，2004，12（9）：412-416.
7.CHENG G，HU Y，YIN Y，et al.Functional screening of antibiotic resistance genes from human gut microbiota reveals a novel gene fusion［J］.FEMS Microbiol Lett，2012，336（1）：11-16.
8.MOORE A M，AHMADI S，PATEL S，et al.Gut resistome development in healthy twin pairs in the first year of life［J］.Microbiome，2015，3 ：27.
9.HU Y，YANG X，QIN J，et al.Metagenome-wide analysis of antibiotic resistance genes in a large cohort of human gut microbiota［J］.Nat Commun，2013，4 ：2151.
10.LU N，HU Y，ZHU L，et al.DNA microarray analysis reveals that antibiotic resistance-gene diversity in human gut microbiota is age related［J］.Sci Rep，2014，4 ：4302.
11.HU Y，YANG X，LU N，et al.The abundance of antibiotic resistance genes in human guts has correlation to the consumption of antibiotics in animal［J］.Gut Microbes，2014，5（2）：1-5.
12.HU Y，LIU F，LIN IY，et al.Dissemination of the mcr-1 colistin resistance gene［J］.Lancet Infect Dis，2016，16（2）：146-147.
13.MARTINEZ J L，COQUE T M，BAQUERO F.What is a resistance gene?Ranking risk in resistomes［J］.Nat Rev Microbiol，2015，13（2）：116-123.
14.HU Y，YANG X，LI J，et al.The transfer network of bacterial mobile resistome connecting animal and human microbiome［J］.Appl Environ Microbiol，2016，82（22）：6672-6681.
15.ZHU Y G，JOHNSON T A，SU J Q，et al.Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（9）：3435-3440.
16.DANTAS G，SOMMER M O，OLUWASEGUN R D，et al.Bacteria subsisting on antibiotics［J］.Science，2008，320（5872）：100-103.
17.XIAO L，ESTELLE J，KIILERICH P，et al.A reference gene catalogue of the pig gut microbiome［J］.Nat Microbiol，2016，1 ：16161.
18.YAP MN.The double life of antibiotics［J］.Mo Med，2013，110（4）：320-324.