实验七　细菌的人工培养法

一、细菌接种技术

【接种意义】

不同的细菌具有不同的生物学特性，利用各种培养基分别研究它们的生物学特性，鉴别细菌的种类，有助于细菌感染性疾病的诊断，或进行其他实验。但是，由于正常菌群的存在，一般的被检标本（例如脓汁、尿、痰、大便）中常含有多种细菌，因此首先必须把它们各自分离开来，获得纯种细菌，然后才能做进一步鉴定。

【接种器具】

接种环和接种针是最常用的接种细菌的工具，它们的使用方法是微生物学实验的最基本技能之一。

1. 结构：接种环和接种针均由三部分组成，其环及针多用易于传热又不易生锈且经久耐用的白金或镍制成，环的直径一般为3～4mm，环和针的长度一般为40～50mm，其一端固定于铝制的金属杆上，金属杆的另一端为手持的绝缘柄（图1-8）。

2. 使用方法：手持绝缘柄，将接种环或接种针按15°角放在酒精灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧红，然后将铝制的金属杆部也通过火焰略加烧灼，待冷却后即可取标本。用毕，斜持接种环或接种针，先将金属丝染菌部位稍上部分置于酒精灯外焰中，使染菌部位的水分蒸发后，再将接种环或接种针置于酒精灯外焰中烧红，然后使金属杆部分通过外焰3次，灭菌后搁于架上，切勿随手乱放，以免灼焦实验台面或其他物品。

3. 用途：接种环主要用于划线分离、纯种移种及涂片制备等，接种针主要用于穿刺接种及菌落的挑选。

二、分离培养法──平板分区划线法

临床的痰、大便、脓汁等标本，常混杂有多种细菌，要从中找出病原菌，就必须通过平板划线法，使其中的细菌在琼脂平板表面逐步稀释，充分地分散开来，使单个活的细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，根据菌落的特征，挑取单个可疑病原菌的菌落扩大培养，便可达到分离纯种细菌的目的。有了纯种的细菌，就可以进一步鉴别或用作其他用途。划线的方法有多种，现以平板分区划线法为例。

【实验目的】

掌握平板分区划方法。

【实验材料】

金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌混合菌液、普通琼脂平板等。

【实验方法】

1. 取琼脂平板1个，用标签纸做好标记（包括接种物、日期、班组、接种者）贴在琼脂平板底的玻璃上。

2. 右手持接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，待冷（5秒左右），以无菌操作取混合菌液一环。

3. 左手持琼脂平板（让皿盖留在桌上），使有培养基的一面与酒精灯火焰尽量垂直，以减少空气中杂菌的落入。右手握持沾有混合菌液的接种环，将细菌涂布于琼脂平板的边缘上，约占平板总面积的1/10为1区（图1-9）。划线时，使接种环与平板表面成30°～40°，轻轻接触，以腕力或指力在平板培养基的表面做轻快的滑动，不可用力太大，以免划破琼脂培养基。划线要连续、密集、平行，要充分利用平板的表面。

4. 划完1区后，烧灼接种环，以杀灭环上多余的细菌，待冷（环是否冷却，可先在平板边缘处轻触表面，若接触处琼脂熔化，表示尚未冷却，稍后再复试），将接种环通过1区做连续划线，约占平板面积的1/5为2区，再依次划3区、4区或5区。划完2区后，在划3区、4区或5区前是否烧灼接种环和划线时每区要交叉多少条线，应根据估计接种材料中所含细菌数量的多少而定。

5. 划线接种完毕，应立即将有培养基的皿底倒置于皿盖内（即皿底朝上，皿盖在下，这样可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下，冲散菌落）。同时，将接种环灭菌后放回原处。将平板放入37℃温箱中培养。

6. 37℃培养18～24小时后取出，观察平板表面生长的不同菌落（图1-10）。注意其大小、形状、边缘、表面、透明度和颜色等性状。由于不同细菌其菌落的特征有所不同，可用于初步鉴别细菌。从平板上挑选可疑的单个细菌菌落接种于琼脂斜面上，经37℃温箱中培养18～24小时后，即可获得某一种细菌的纯种。不在划线上的菌落多是从空气中落入的杂菌。

【实验结果】

菌落形态观察：首先先观察整个平板培养基上的菌落形态及种类，然后再选有代表性的各种孤立菌落做如下的详细观察（图1-11）。

1. 大小：一般可描述为针尖大、粟粒大等，也可按实测毫米数表示。大菌落（直径在5mm以上），中等大菌落（直径在3mm左右），小菌落（直径在1mm左右）。

2. 形状：点状、圆形、卵圆形、叶状等。

3. 边缘：整齐、锯齿状、毛发状等。

4. 表面：光滑、皱纹、湿润、干燥等。

5. 高度：凸起、扁平、中心凹陷等。

6. 结构：均质性、颗粒状等。

7. 颜色：无色、白色、黄色、褐色等。

8. 透明度：透明、半透明、不透明等。

观察菌落时，不要将空气中落入培养基而生长的杂菌误认为是目的细菌。杂菌一般生长于划线痕迹外，或为个别的形状异常的孤立菌落。另外观察时，也要注意保护好平板培养基，勿使再落入杂菌。

三、斜面培养基接种法

【实验目的】

了解斜面培养基的用途及接种方法。

【实验材料】

大肠埃希菌、斜面培养基。

【实验方法】

斜面培养基不易被污染，常用于培养纯种细菌。斜面培养基通常也采用划线接种法。接种时，右手持接种环，先将接种环灭菌，待冷却后挑取平板培养基上孤立菌落的细菌。用左手取斜面培养基，用右手小指和手掌拔去试管棉塞，将试管口通过火焰略微加热灭菌，再将接种环插入试管（勿触碰管壁），由斜面底部向上划一直线，然后再从斜面底部向上连续蛇行划线（图1-12）。划线完毕，再将试管口过一下火焰，棉塞灭菌后，塞好棉塞，最后将接种环上的残留细菌烧灼灭菌。接种好的斜面培养基放37℃温箱中培养18～24小时，所接种的细菌则生长为均质的菌苔。此培养物来自孤立菌落，为纯种，可用于该菌的各种生物学性状检查。

【实验结果】

细菌在斜面培养基上经培养后呈菌苔生长。

四、液体培养基接种法

【实验目的】

了解液体培养基的用途及接种方法。

【实验材料】

大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和链球菌培养物，肉汤或肉膏汤培养基、血清肉汤培养基。

【实验方法】

可采用“双管移植法”（图1-13），将琼脂斜面上生长的细菌移植于肉汤培养基中，即左手持细菌培养物和肉汤培养基两支试管，右手持接种环，按无菌操作法取少量细菌，在肉汤表面稍上的管壁上轻轻研磨，使细菌混入培养基内（图1-14）。在微量生化管接种时，用接种针取细菌标本直接接种于液体培养基中，接种后放37℃温箱中培养18～24小时。肉眼观察，若培养基出现混浊或形成菌膜、沉淀等，则表示有细菌增殖，观察其增殖状态，有助于鉴别细菌。

【实验结果】

大肠埃希菌为均匀混浊生长，枯草芽孢杆菌为表面生长形成菌膜，链球菌为沉淀生长。

五、半固体培养基接种法

【实验目的】

掌握半固体培养基的用途和接种方法。

【实验材料】

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌斜面培养物，半固体培养基。

【实验方法】

细菌实验室为保存菌种或测定细菌有无动力，常制成固体或半固体的高层培养基，某些生化性状检查也使用高层培养基（如醋酸铅培养基）。高层培养应采用穿刺接种法，用接种针取菌落或斜面培养基上的纯种细菌，穿刺于培养基的中心，但不可直刺至试管底，一般刺入高层培养基2/3的高度即可（图1-15）。

【实验结果】

大肠埃希菌等有鞭毛的细菌因能运动，除在穿刺线生长外，还可向四周弥散生长，使整个培养基变混浊；金黄色葡萄球菌等无鞭毛的细菌无动力，因而只能沿穿刺线生长，使原穿刺线更为明显，穿刺线以外的培养基则仍澄清透明。

六、倾注培养法

常用于活菌计数。根据一个活菌能在培养基中形成一个菌落的原理，可用倾注培养的方法，计算出标本中的活菌数。临床上常用于泌尿系感染的细菌学检查，一般认为每毫升尿中革兰阴性杆菌的活菌数在105以上者为感染。也可用于水和饮料的细菌总数检测。

【实验目的】

了解倾注培养法的用途和接种方法。

【实验材料】

中段尿标本、无菌生理盐水、无菌1ml吸管、直径9cm无菌平皿，加热溶化并保存于50～60℃水浴的高层琼脂。

【实验方法】

1. 无菌操作吸取尿标本0.5ml至一支无菌试管中，再加入4.5ml无菌生理盐水，混匀，即为1:10稀释的尿液，再从中取0.5ml加入4.5ml生理盐水中即为1:100稀释的尿液。

2. 用1ml无菌吸管吸取1:10稀释的尿液1ml注入一只无菌平皿中。同样用另一支1ml无菌吸管吸取1:100稀释的尿液1ml注入另一无菌平皿中。

3. 将两支50～60℃的高层琼脂倾入稀释的尿液中，并立即在桌面上轻轻摇匀，待琼脂凝固后，做好标记，置37℃温箱中培养18～24小时。

【实验结果】

计数菌落数乘以稀释倍数，即等于尿液中的活细菌数。

七、细菌的培养技术

（一）一般培养法

一般培养法又称需氧培养法：将已接种好标本的各种培养基，置37℃温箱中培养18～24小时，一般细菌即可在培养基上生长。但菌量很少或生长缓慢的细菌需培养3～7天直至1个月才能生长。

（二）二氧化碳培养法

二氧化碳培养法是将某些细菌，如脑膜炎奈瑟菌、布氏菌等，放入较高浓度CO2的环境中进行培养。常用产生CO2的方法有烛缸法、化学法和CO2培养箱法。

1. 烛缸法：将已接种标本的平板培养基置于容量为2000ml的干燥器内（为了隔绝空气，缸盖及缸口涂以凡士林），放入小段点燃的蜡烛（勿靠近缸壁，以免烤热缸壁而炸裂）和一小杯水（保持缸内湿度）于缸内，盖密缸盖。缸内燃烛于0.5～1分钟会因缺氧自行熄灭，此时容器内二氧化碳含量为5%～10%（图1-16）。连同容器一并置于37℃温箱中培养。

2. 化学法（碳酸氢钠盐酸法）：按每升容积加入碳酸氢钠0.4g与浓盐酸0.35ml的比例，分别将两者置于容器（平皿）内，连同容器置于标本缸或干燥器内，盖紧缸盖后倾斜容器，使盐酸与碳酸氢钠接触生成CO2。

3. CO2培养箱法：CO2培养箱（图1-17）种类繁多，其核心部分是CO2调节器、温度调节器及湿度调节装置，一般温度调节范围为室温至50℃，湿度在95%以上，CO2控制范围为0～20%。当空气进入箱内后，通过能产生潮湿的含水托盘，用CO2调节装置调节CO2的张力，或者将空气和CO2按比例混合来调节CO2的张力，CO2调节装置可以减少CO2的消耗并且在打开培养箱门后能很好地控制和恢复CO2的含量，能让气体由培养箱灌到样品小室内，空气在培养箱内循环流动，这样既能保持CO2水平，又能使空气分布均匀。由于CO2培养箱内湿度较高，必须经常处理以避免霉菌生长。CO2培养箱主要用于组织细胞培养以及奈瑟菌、布氏菌等的初次分离培养。

（三）庖肉培养基培养法

庖肉培养基培养法是厌氧培养法的一种，厌氧培养法有很多，主要利用气体交换、还原剂、催化剂等方法使培养基保持无氧的环境和还原的状态。培养厌氧菌时，须将培养环境或培养基中的O2去除，或将氧化型物质还原，以降低其氧化还原电势，厌氧菌才能生长。

【实验原理】

庖肉培养基内含肉渣、不饱和脂肪酸、谷胱甘肽等物质，表面由凡士林隔绝空气。其中，不饱和脂肪酸在氧化时可以消耗试管内的氧气，谷胱甘肽作为一种还原剂可以使培养基中的氧化还原电势降低，有利于厌氧菌的生长。

【实验方法】

取制备好的庖肉培养基在火焰上微加热，使凡士林熔化。在无菌条件下将厌氧菌接种，完毕后再微加热，最后将培养基直立于试管架上，使凡士林密封后，在37℃温箱中培养。

（四）焦性没食子酸法

【实验原理】

焦性没食子酸法为厌氧培养法。焦性没食子酸与碱性溶液能迅速大量地吸收氧气，生成棕色的焦性没食子，它可以在任何密闭容器中快速造成无氧的环境（100ml容器中：1g焦性没食子酸+0.5g/ml碳酸氢钠2ml）。

【实验方法】

1. 平皿法：在血平板上接种好厌氧菌，在皿盖上铺好薄纱布，将焦性没食子酸0.5g置于纱布上，滴碳酸氢钠1ml，立刻将接种好的血平板扣在上面，并用熔化的石蜡密封四周，置37℃温箱中培养。

2. 试管法：将厌氧菌接种于小试管内，并在一大试管内放入有焦性没食子酸的玻璃珠，滴入碳酸氢钠，迅速把小试管放入大试管中，并用橡胶塞塞紧，石蜡封口，置37℃温箱中培养。

（五）厌氧罐法

【实验原理】

厌氧罐是由塑料、有机玻璃或金属构成的圆形容器，安装有压力表和通气阀，可以抽换气体。适合于厌氧菌的培养（图1-18）。

【实验方法】

1. 抽气换气法：适合实验室使用。将接种好细菌的平板或试管放入厌氧罐中，同时放入催化剂（钯）和指示剂（亚甲蓝）。拧紧盖子，用真空泵抽气，当指针到零时，灌入高纯度氮气，如此反复2～3次，最后一次加入氢气和二氧化碳的混合气体。封闭，37℃温箱中培养。

2. 气袋发生袋法：适合于床边接种和野外厌氧菌培养。除不需真空泵和气体瓶外，其他设备与抽气法相同。利用两种药片：一种是枸橼酸和小苏打，另一种是硼氢化钠。前者遇水释放二氧化碳，后者遇水释放氢气。

3. 厌氧袋法：将接种好的平板放入装有发生管和亚甲蓝指示剂管的透明不透气塑料袋内，挤出袋内空气，将袋口扎紧，然后折断发生管，产生的二氧化碳和氢气使气袋膨胀，出现水滴。半小时后，袋内化学反应完成，袋内已无游离氧，此时折断亚甲蓝指示剂管，亚甲蓝仍为无色，表明厌氧环境形成，可以进行人工培养厌氧菌。

（何玉林 周亚莉 蒋莲秀）