第二节 性病病原体实验室检测

一、梅毒螺旋体及血清抗体检测

梅毒（syphilis）是由梅毒螺旋体（treponema pallidum）引起的一种慢性经典性病。梅毒螺旋体是一种小而纤细的螺旋体状微生物，长度为5～20μm，平均8～10μm，直径＜0.2μm，有6～12个螺旋，因其透明不易染色，故称为苍白螺旋体。

梅毒的实验室方法主要有病原体检查和梅毒血清学检查。

（一）病原体检查

目前常用的有暗视野显微镜检查、镀银染色显微镜检查、浓盐酸蒸汽显示法和免疫荧光染色检查。其中暗视野显微镜检查是对早期现症梅毒检测的最好方法。诊断一期梅毒、二期梅毒，可取病人损害的渗出物或淋巴结穿刺术得到组织液，在暗视野显微镜下观察螺旋体的特征性形态和运动方式；孕妇羊水作暗视野显微镜检查对先天梅毒具有诊断价值。

1．暗视野显微镜检查

（1）取材

1）皮肤黏膜损害的取材：首先准备好一张干净的载玻片加1滴等渗盐水，用生理盐水棉签（不能用消毒液）清洁病损，如有结痂可用消毒的钝刀片刮去，要避免出血，轻轻挤压至出现渗液，用盖玻片蘸取少许渗出液，盖于先准备好的载玻片上，暗视野镜检。

2）淋巴结取材：先消毒淋巴结表面，再用1ml无菌注射器配12号针头，吸取0.2ml的生理盐水，注入消毒后淋巴结，反复抽吸数次后，吸出少量淋巴液直接滴加在载玻片上，加上盖玻片，暗视野镜检。

3）羊膜穿刺术：梅毒孕妇的羊膜穿刺术应由专业人员操作，将获得的羊水直接滴于载玻片上，暗视野。

（2）结果判定：根据其典型形态、大小和运动方式加以鉴别，镜下可见到折光性较强，有特征性运动方式的梅毒螺旋体即为阳性。一次阴性结果应重复检验。此方法由于取材不当或用药等都可出现阴性结果，所以如果是阴性，也不能完全排除梅毒。

2．冯泰纳（Fontana）螺旋体镀银染色法

（1）染液的配制

1）罗吉（Ruge）固定液：冰醋酸1.0ml，甲醛溶液2.0ml，蒸馏水100ml。

2）鞣酸媒染剂：鞣酸5g，苯酚（石炭酸）1g，蒸馏水100ml。

3）冯泰纳银溶液：硝酸银5g，蒸馏水100ml。

将硝酸银溶液20ml逐滴加到10%氨溶液中，产生的棕色沉淀物经摇动后可再被溶解。如溶液很澄清，可再加入硝酸银数滴，直到溶液摇匀后有轻度浑浊为止。此液应在临用前配制，不可预制。

（2）染色法

1）将标本制成徐片，宜稍薄。空气中干燥，不可用火焰固定。

2）滴加罗吉固定液，固定2～3min。

3）用无水乙醇洗涤。

4）加媒染剂2～3滴，用酒精灯火焰加热至产生蒸气，染30s，水洗。

5）滴加已经过氨液处理的银溶液，并加热使产生蒸气。染30s，水洗，空气中干燥。加盖玻片以加拿大胶封闭固定（如直接加油镜易使标本脱色），油镜检查。

（3）结果判定：螺旋体染成棕黑色，背景为淡棕色。

3．免疫荧光染色检查

（1）直接法：①将受检标本涂于载玻片上，直径不超过1cm，自然干燥，用丙酮固定10min。②已知抗梅毒螺旋体血清（人或免），用非致病性螺旋体（如Reiter株）培养物进行吸收，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记，然后涂在有标本的载玻片上，孵育30min。③彻底清洗，用缓冲甘油封固、待检。

（2）间接法：①取材固定同上。②加经吸收的已知抗梅毒血清，孵育30min，彻底清洗。③加FITC标记的抗人（或免）血清，孵育30min，彻底清洗，用缓冲甘油封固，待检。

（3）结果：在荧光显微镜下见到亮绿色螺旋体，荧光强度判为++～++++，以完整的螺旋体为阳性。

4．临床意义

（1）暗视野显微镜检查法、镀银染色法，直接镜检到梅毒螺旋体，在临床上可确诊梅毒，且具有快速、方便、易操作等特点。暗视野显微镜检查法已被WHO指定为性病实验室必备项目之一。

（2）螺旋体检查是检测最早期现症梅毒的最好方法，对病人早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源具有十分重要的意义。对梅毒感染者，能在血清抗体出现前进行抗梅毒治疗，是最好的治疗时机。

5．注意事项

（1）取材前，应用无菌等渗盐水清洁皮损表面。

（2）钝刀要消毒，取材时应取到组织渗出液，以提高阳性率，并尽量避免出血。

（3）取材后应立即置暗视野显微镜下观察。

（4）暗视野检查要观察梅毒螺旋体的特征性形态和运动方式，对口腔溃疡标本，应与其他螺旋体相区别。镀银染色法和浓盐酸蒸汽显示法要观察到梅毒螺旋体的典型形态。

（5）如未观察到梅毒螺旋体，并不能排除梅毒的可能性，这可能是由于取材不当或皮损处螺旋体数量不足，病人近期用过抗生素，损害已接近自然消退等原因引起。可让病人复查及进行血清学追踪观察。

（二）梅毒的血清学检查

梅毒血清学检查分两大类：非梅毒螺旋体抗原试验和梅毒螺旋体抗原试验。

1．非梅毒螺旋体抗原实验 目前常用的有性病研究实验室试验，快速血浆反应素环状卡片实验和血清不需加热的反应素试验。这些试验一般用来做初筛试验，由于这些试验设备简单，操作比较方便，报告快速，易于推广，所以主要用于作为常规试验及适用于大量人群中进行筛查；可作定量（滴度）试验，用于观察疗效、复发及再感染；鉴别早期与晚期潜伏梅毒（早期治疗后滴度下降快，晚期下降慢或不变）。

（1）性病研究实验室试验（简称VDRL）：VDRL实验所用的抗原是从牛心中提取出来的有效成分：心磷脂、卵磷脂及胆固醇。梅毒螺旋体在破坏组织的过程中，体内放出一种抗原性心磷脂，它能刺激机体产生反应素。这种反应素与从牛心提取的心磷脂在体外有抗原-抗体反应。可作定量及定性试验。由于VDRL抗原的配制时混悬的技术较高，只可使用1日，而且待测血清需在试验前灭活，给实验室带来许多不便，所以主要用于梅毒病人的脑脊液检查。

（2）快速血浆反应素环状卡片实验（简称RPR）：RPR试验所用的抗原为改良的VDRL加胶体炭为指示物，试验在特制的白色纸卡上进行，在白色底板上出现黑色凝集颗粒或絮片为阳性反应。该试验结果容易判断，肉眼即可观察，血清不需灭活，也可用血浆进行检测。方法如下。

1）RPR定性试验：在卡片圆圈中加人50μl待检血清，并扩大到整个圆圈。用滴管和专用针头，加1滴RPR抗原悬液。在手或机械转动器（180r/min）转动卡片8min。

2）RPR定量试验：待测血清用等渗盐水在卡片上作数个稀释度：原血清、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等。按定性试验步骤操作，以出现阳性反应的最高稀释度报告结果。

3）结果判定：试验结束立即按下述标准判断结果。

阳性反应：在圆圈中可见不规则大小黑色凝集颗粒或絮片。

阴性反应：在圆圈中无黑色凝集颗粒，仅见均匀的不凝集现象（呈亮灰色）。

该试验仅报告“阳性”或“阴性”，任何程度的阳性反应都需作定量试验。

（3）注意事项：前带现象：RPR试验有时出现弱阳性或阴性结果，而临床上又像二期梅毒，此时应将此血清稀释后做定量试验，如出现阳性结果，此现象称为前带现象。其原因是血清中抗心磷脂抗体量过多，或因封闭抗体，或有非特异性抑制物所致。1%～2%二期梅毒病人可出现此现象而发生梅毒血清假阴性反应。

1）血清固定性反应（也叫耐血清性）：是指梅毒病人经过抗梅治疗后，非螺旋体抗原血清试验（RPR等）大多数可转为阴性，但有少数病人，血清反应滴度逐渐降低到一定程度即不在下降，而长期维持在低滴度，此种现象称为血清固定性反应。血清固定性反应的标准：一般认为早期梅毒治疗后2年，晚期梅毒治疗后2年以上血清反应仍保持低滴度阳性者。

2）梅毒血清反应的假阳性反应：就是指非梅毒病人的梅毒血清反应呈阳性。可分两大类：①非生物学假阳性反应，由于标本的保存（如细菌污染或溶血）、试剂的质量差或过期、实验室操作的技术所造成。②生物学假阳性反应，又分急性和慢性，引起急性生物学假阳性反应的疾病很多像麻疹、病毒性肝炎、疟疾等，但这些疾病梅毒血清反应滴度都很低，一般不超过1∶8，多在6个月内转为阴性，但TPHA试验阴性。另一个是慢性生物学梅毒假阳性反应，多见于结缔组织病、自身免疫系统疾病（红斑狼疮等）、麻醉剂止痛、孕妇等滴度也有1∶8以上，甚至1∶64，这种情况就要参考临床来诊断或确认试验。

如果病人为HIV感染者，其梅毒血清反应有时会出现难于解释的现象，艾滋病病人合并感染梅毒者，其梅毒血清试验均呈阴性。可能是由于HIV感染导致免疫功能低下，导致的无免疫应答，因此对于怀疑梅毒者，建议同时进行HIV抗体检查。

（4）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）：甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）的检测原理和RPR相同，只是用甲苯胺红代替了炭颗粒，其检测方法、结果判读及临床意义等均同RPR试验。

2．梅毒螺旋体抗原试验 这些实验所用的抗原是梅毒螺旋体，检测血清中的抗梅毒螺旋体抗体，其敏感性与特异性均高。目前常用的有荧光螺旋体抗体吸收试验、梅毒螺旋体血球凝集试验及梅毒螺旋体明胶凝集试验等。这些试验一般用来作证实试验。这类试验检测的是抗梅毒螺旋体IgG抗体，即使病人经足量的抗梅治疗，血清反应仍长期保持阳性，因此不用于观察疗效、判定复发及再感染。有报道在一期梅毒阶段接受正规治疗者，15%～25%在2～3年后可转为阴性。

（1）梅毒螺旋体血球凝集试验（简称TPHA）：TPHA试验是用超声裂解的梅毒螺旋体为抗原，致敏经醛化、鞣化的羊或禽类红细胞，这种致敏的红细胞一旦与抗梅毒抗体或免疫血清相遇时，在适宜的条件下，产生肉眼可见的凝集。最早进入我国的TPHA试剂盒是日本生产的，由羊红细胞配成，致敏细胞和非致敏细胞为冻干品，配成细胞应用液，有效期短，反应时间长，目前已被TPPA等代替。

一般认为，TPHA试验阳性病人，由于记忆细胞抗体复制能力强，特异性试验敏感性高，即使经过抗梅毒治疗也终身阳性，因此不能作为治疗效果观察的指标。但根据临床观察，早期梅毒病人血清如TPHA试验为弱阳性反应，有可能阴转。

特异性试验对一期梅毒可比非特异性试验早1周出现。梅毒过程中最初出现的是IgM抗体，梅毒感染后第2周即可从血清测出，而IgG抗体则需在感染后第4周方可测出。因此检测195-IgM抗体可作为梅毒早期诊断或胎传梅毒的确诊。19SIgM治疗后阴转较快，在梅毒螺旋体抗原消失后不久，此抗体也随之消失。据文献报道经有效治疗后，一期梅毒3个月，二期梅毒9个月IgM抗体达到100%阴转。

梅毒确证试验，一般定性试验阳性，则可作梅毒诊断依据，必要时做定量试验。经有效治疗后特异性抗体滴度也可不同程度下降，可降至1∶160或1∶80。

此类试验特异性强，很少出现假阳性。据统计，也可有1%生物学假阳性存在如红斑狼疮（SLE）可使FTA-ABS呈假阳性；而传染性单核细胞增多症，可能由于嗜异性抗体所致，可使TPHA呈假阳性；麻风病病人的非特异性试验假阳性可高达40%，特异性试验有的也可呈阳性。

（2）梅毒螺旋体明胶凝集试验（简称TPPA）：TPPA试验与TPHA基本相同。TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒代替TPHA试验中致敏的红细胞，此致敏颗粒与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生可见凝集反应，具有较高的敏感性。明胶粒子为洋红色，在操作步骤上也较为方便，出结果较快。

（3）荧光螺旋体抗体吸收试验（简称FTA-ABS）：FTA-ABS试验是指将完整的梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂（用Reiter株螺旋体制备而成）吸收过的梅毒血清或免疫血清，形成抗原抗体复合物，再加入荧光素（FITC）标记的抗人免疫球蛋白（IgM、IgG）与抗梅毒螺旋体抗体结合，形成发光的抗原抗体复合物。在荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色的荧光即为阳性反应。

荧光梅毒螺旋体吸收试验被认为是“金标准”试验，具有特异性高、敏感性强的特点。对一期、二期、潜伏期梅毒的敏感性分别是84%（70～100%）、100%和100%。特异性为97%（94%～100%）。但试验需有质量优良的荧光显微镜和技术熟练的操作人员，才能得到较为准确的试验报告。

（4）先天梅毒的实验室诊断：19S-IgM-FTA-ABS试验系检测抗梅毒螺旋体IgM型抗体。为避免血清受7S（IgG）的抑制而出现假阴性结果，故待检血清首先用IgM/IgG分离系统进行分离，采用间接免疫荧光法，其步骤与FTA-ABS试验大体相似，但应用荧光标记μ链抗人IgM抗体滴加于载玻片的抗原抗体复合物上，用落射式荧光显微镜观察。另外，19S-IgM还可作TPHA和ELISA。此试验可作为梅毒早期诊断、判定治愈及再感染的检测，并可与来自母体的抗梅毒螺旋体IgG型抗体区别，有助于诊断先天梅毒。

对于先天梅毒，不推荐用脐带血作梅毒检查，因为母亲血液中的反应素及螺旋体IgG抗体可经胎盘及脐静脉传递给胎儿，而出现假阳性反应；也不能用婴儿血清作梅毒螺旋体抗原试验（如TPHA、TPPA、FTA-ABS试验）。据研究，由母亲传递给胎儿的梅毒螺旋体IgG抗体，可在婴儿体内存留至生后15个月。有条件地区，可进行19S-IgM-FTA-ABS试验，对诊断先天梅毒有价值。

先天梅毒诊断的确证根据下列4个指标之一：暗视野查出梅毒螺旋体，患儿非梅毒螺旋体抗体滴度持续上升，非梅毒螺旋体抗体滴度高于其母亲，患儿检出抗梅毒19S-IgM抗体。

19S-Igm试验方法，是指通过检测沉降系数195的梅毒螺旋体单一成分的特异性IgM抗体来确诊梅毒的。IgM抗体是梅毒感染最早期产生的抗体，并能随疾病的治疗而逐渐消失。另外，IgM聚合体不能通过胎盘，因此，对先天梅毒确诊有特殊意义。另外，对一期梅毒非特异性血清反应阴性时的早期诊断，以及梅毒的再次感染和晚期梅毒的检测也有作用。一旦在胎盘血中检测到高滴度的抗梅毒螺旋体特异性抗体19SIgM，说明已感染梅毒。19SIgM还可作FTA-ABS和ELISA等项试验。

母亲是梅毒病人，患儿有早期或晚期先天梅毒的典型临床表现，或有早期先天皮肤黏膜损害，查到梅毒螺旋体，或梅毒血清学试验阳性，可作出先天梅毒诊断。

早期先天潜伏梅毒的实验诊断：母亲应肯定是梅毒病人，如患儿梅毒血清阳性，应排除被动抗体阳性的可能；如患儿非特异性试验滴度比母亲高，可能性大，以后按月检查，3～4个月内不转阴、滴度不下降或升高，则可诊断为早期先天潜伏梅毒。

母亲在妊娠晚期才感染梅毒，新生儿在4～12周内血清试验可为阴性，这不能排除先天梅毒的可能。如已感染，4个月后便可呈阳性。

为防止发生先天梅毒，应在婚前和产前作梅毒血清学检查。在梅毒高流行区，还需在妊娠期第九个月重复进行血清学筛查。产前发现梅毒不论以往是否经过治疗，都要在妊娠初期3个月内接受青霉素1个疗程的治疗；妊娠末期再治1个疗程，以治愈可能被感染的胎儿。对梅毒孕妇所生的婴儿均应进行血清学检查和追踪观察。

二、淋球菌检测

淋病（gonorrhea）的病原体是淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae），又称淋病双球菌，简称淋球菌或淋菌。淋球菌无鞭毛，无芽胞，无荚膜，容易侵犯人类泌尿生殖道的柱状上皮细胞。与淋球菌同属的有脑膜炎球菌、黏膜炎球菌和黄色球菌等，它们多寄居于人的鼻咽腔，在形态上和淋球菌相似，在检测时应该加以鉴别。

（一）标本的采集和运送

在取材作涂片时，应先用灭菌等渗盐水洗净尿道口，然后用手指由后向前挤出脓液，用棉拭子或白金耳蘸取脓液轻轻涂在载玻片上，待自然干燥后作染色。如从男性病人前尿道取材作培养，应用白金耳或棉拭子深入尿道2～4cm，取出的分泌物应略带黏膜。从女性病人的宫颈取材时，应将棉拭子插入宫颈口1.5cm，稍转动并停留10～30s，让棉拭子充分吸附分泌物。从肛门取材时，应将棉拭子插入肛门2.5cm以上，从紧靠肛环边的隐窝中取材。检查淋球菌性咽炎时应从扁桃体或扁桃体窝或咽后壁取材。取材的拭子应对病原体的生活力无影响，可用棉拭子或藻酸钙拭子。此外，从女性病人宫颈取材时，应用灭菌盐水湿润窥器，而不要用润滑油等以防止抑制淋球菌生长，拭子插入宫颈管前，应先将堆在宫颈口的分泌物揩去，以免过多杂菌干扰淋球菌的生长；取出拭子时不要碰到阴道壁，标本离体后应立即接种到培养基上。如取材处离实验室较远，应将标本放在合适的运送培养基中。

（二）检测方法

1．分泌物的徐片检查 急性淋球菌性尿道炎病人常有大量黄色脓性分泌物。在有些脓细胞内可有许多淋球菌。淋球菌革兰染色呈阴性反应，具有特殊的菌体形态。因此，取病人尿道分泌物制成涂片作革兰染色，检查有无典型细胞内革兰阴性双球菌，可作初步诊断的依据。

（1）方法：先用灭菌拭子揩洗尿道口，然后用手指由后向前挤出脓液，蘸取脓液后轻轻涂于载玻片上。待自然干燥后加热固定，染色，镜检。

（2）结果：在急性病人的尿道脓性分泌物革兰染色涂片中，常可见到大量红色多形核白细胞。在有些细胞中吞噬有淋球菌。淋球菌为革兰阴性，呈卵圆形或圆形，常成对排列，接触面扁平或稍凹。菌体长约0.7μm、宽约0.5μm。但两菌大小可有差异。多数多形核细胞中并不含淋球菌，但不少脓细胞中常含有1至数对，甚至20～30对淋球菌，淋球菌通常存在于细胞质内。

在病期较长的淋病病人的徐片中淋球菌比较少，有时呈单个、四联和八叠状，且常位于细胞外。对有些菌有时难以下结论，需要进行培养和鉴定。

（3）注意事项

1）涂片时不要用力涂擦，应将棉拭子在玻片上轻轻滚动。由于急性病人诊断标准为见到“细胞内革兰阴性双球菌”。所以徐擦过劲，细胞破裂或变形，细菌从细胞内逸出，会造成诊断上的混淆。

2）涂片厚薄要合适。涂片过厚，加上染色过程中脱色时间不足，革兰阴性菌会呈现紫色而成了阳性菌。因此，脱色时间要视涂片厚薄而定。在大量染片时，最好用一已知的革兰阳性菌（如葡萄球菌）和阴性菌（如大肠埃希菌）作对照，以免造成结果错误。

3）固定涂片，只需将徐片迅速通过火焰2～3次，避免加热过度使细胞变形扭曲。当把加热的片放到手背上时应不感到太烫为宜。

4）涂片检查方法简便，价格低廉。对有症状的男性病人，敏感性和特异性均在95%以上，徐片检查对这类病人的诊断是很好的方法；但涂片检查对女性宫颈标本，敏感性仅40%～60%。特异性从80%～90%不等。因女性宫颈分泌物中杂菌很多，有的菌如不动杆菌在形态上很像淋球菌。因此，WHO不推荐用徐片法来检查女性病人。可是当典型革兰阴性细胞内双球菌被训练有素的检验人员在宫颈分泌物徐片中找到时，也可作出初步诊断并进行治疗。但仅用涂片检查女性病人时，会有不少病人被漏诊。

5）不推荐用涂片检查来诊断淋球菌性直肠和咽部的感染，也不推荐用来作判愈。

2．淋球菌的分离培养 如果标本中有淋球菌，则在合适的培养基上经培养后可长成菌落。各种细菌在培养基上生长成的菌落形态各不相同。根据菌落的大小、表面高起或扁平、光泽、色素和边缘的情况等，作为细菌鉴定的标准。

（1）培养基：由于淋球菌的营养要求较复杂，所用的培养基中应含有动物蛋白及细菌生长所需的各种因子。目前国内常用的是血液琼脂或巧克力琼脂。为抑制杂菌，在培养基中可加入少量抗菌物质如多黏菌素B（25μg/ml）和万古霉素（3.3μg/ml）等。所用血液如羊血、兔血和人血均可，浓度为8%～10%。但避免血液中加入抗凝剂等药物。培养基的pH以7.4为好。目前，国外常用的培养基有Thayer-Martin（T-M）培养基、New York City（NYC）培养基和Martin-Lewis（ML）培养基等。T-M培养基是在GC基础培养基中，加入血红蛋白（1%）、抗生素（万古霉素3μg/ml、黏菌素7.5μg/ml和制霉菌素12.5μg/ml）和淋球菌增菌剂，使绝大多数杂菌被抑制而淋球菌菌落长得较大，在平皿中几乎呈纯培养，从而大大提高了由子宫颈、尿道，尤其是咽和直肠部位分离出淋球菌的阳性率。

（2）培养条件：淋球菌对外环境变化颇为敏感，对寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养有足够的成功率，取材后应立即接种，标本离体时间越短越好。取材处离实验室距离较远时，应将标本接种于Stuart或Amies运送培养基或1%葡萄糖肉浸液中，并注意在运送过程中保温。接种的血平皿应先放在37℃温箱中预温。

培养的最适温度为35～36℃，＞38.5℃或＜30℃便生长不良。因此，孵育的温度要恒定。

淋球菌为需氧菌，但最初从人体分离时动促进其生长，需用5%二氧化碳环境培养。为保持一定的相对湿度，可在培养缸中放些浸水棉球。

（3）培养结果：淋球菌在血平皿上经24～48h的培养后，可形成圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落。边缘呈花瓣状，直径为0.5～1.0mm，用白金耳触之有黏性。如继续培养，菌落面积增大，表面变得粗糙，边缘出现皱缩。若从菌落上取材作徐片，可见到菌的大小及染色的深度有差异用排列也不一致，约有25%的菌为典型的双球菌，其他75%为单球菌、四联形或八叠形。

据报道，把淋球菌培养在控制的条件下可见到4种形态的菌落，分别为T1、T2、T3、T4。T1和T2是从新采集的标本中分离出来的并与感染力有关，而T3和T4不能感染人。

淋球菌在液体培养基中生长于液体表面，或稍有轻度混浊和颗粒沉淀。

（4）注意事项

1）培养要获得成功，取材的部位和方法一定要准确。

2）对症状不典型的男性病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后2～3h之后。

3）对女性病人的检查主张用淋球菌培养。国内目前使用的血液琼脂或巧克力琼脂中加人多黏菌素和万古霉素以分别抑制革兰阴性和革兰阳性杂菌。但由于部分淋球菌（某些地区可高达5%）对万古霉素也敏感，因此，最好不用万古霉素。

4）淋球菌在血平皿上培养24h，菌落形态很小，肉眼难以辨认其特点。24～36h，菌落迅速长大。所以观看菌落特征最好在36h左右。超过36h，菌落特征也会有较大的改变。

（三）初步鉴定试验

1．革兰染色 淋球菌有特定形态。用白金耳从培养基上挑取可疑菌落在玻片上制成盐水涂片，经革兰染色，若见到具有淋球菌特征形态的双球菌，可做出初步诊断。

在载玻片上加盐水1滴，取可疑菌落制成涂片，干燥固定后作革兰染色。镜下可见革兰阴性球菌。菌体为0.7μm×0.5μm大小，呈肾形或卵圆形。约1/4为双球菌，多数为单球菌，个别呈四联或八叠状。与分泌物涂片所见不同，此徐片中无白细胞。

2．氧化酶试验 淋球菌在生长过程中产生氧化酶。往培养基上生长了24～48h的菌落上加氧化酶试剂（0.5%～1%新配制的盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液），淋球菌菌落的颜色可变成红紫乃至黑色。其反应式如下：

（1）方法与结果：①在混有杂菌的淋球菌分离平皿上滴加氧化酶试剂后变成紫红色的菌落为氧化酶试验阳性。②也可先挑取可疑菌落涂于一干滤纸条上，滴加试剂，涂菌处变成红色者为阳性。③或先滴一滴试剂于滤纸条上（勿太湿），再涂菌落，观察颜色变化，变成红色者为阳性。

（2）注意事项

1）为了保证有良好的反应，所用氧化酶试剂不应过分陈旧。正常的氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺）应为淡红色。如果试剂买来时已成灰色或黑色，说明已失效而不应使用。试剂溶液配好后应放在棕色玻璃瓶中避光保存可使用1周。

2）氧化酶试剂遇铁也会出现红色而造成假阳性，所以操作用的接种环应避免用旧铁丝或电炉丝等制成，并在每次试验前先检查是否未挑菌的接种环接触试剂就有红色出现。

3）盐酸四甲基对苯二胺比盐酸二甲基对苯二胺敏感，将一滴盐酸四甲基对苯二胺溶液滴在菌落上，如菌落很快变为深紫色并保留0.5min以上则为阳性。

4）如需保留菌种，在菌落未完全变黑时可挑少许转种。菌落一旦变黑，多数菌即告死亡。

（四）鉴定试验

糖发酵试验：用作糖发酵试验的培养基中除供淋球菌生长所需的营养物质之外，还加有各种糖类和指示剂。淋球菌有分解葡萄糖的酶类，当它分解葡萄糖时产酸，使培养基的pH降低。因此，培养基中的指示剂颜色改变，如酚红由红变黄，溴甲酚紫由紫变黄。

几种奈瑟菌的糖发酵反应情况可见表4-1。

（五）淋球菌对药物敏感性测定方法

当前，由于不规则用药和细菌变异的结果，我国已出现淋球菌的耐药菌株。检测淋球菌对抗生素的敏感性可用来检测是否产生了耐药株及其比率，为修订淋病治疗方案和对策提供重要流行病学资料。

测定淋球菌对药物的敏感性的方法很多，常用的有以下几种。

1．纸片扩散法 将含药纸片贴到涂有淋球菌的培养基上，药物即扩散到琼脂中。如果淋球菌对此药物敏感，则生长被抑制，在纸片周围形成一个透明的抑菌圈。琼脂中药物浓度与纸片距离成反比，距纸片越远药物浓度越小。因而，可根据抑菌圈的大小判定细菌对该药的敏感程度。

检查平皿并测量抑菌圈直径。参照标准报告结果。

2．琼脂稀释法 将待检菌株种于含有不同抗菌药物的琼脂平皿上，药物浓度小时细菌生长，药物浓度高时细菌生长被抑制，据此可测出药物对该菌的最小抑菌浓度，依标准判定菌是否为耐药菌株。

淋球菌对药物的敏感度是指淋球菌不生长的药物最高稀释度。常用μg/ml或mg/L表示。此数值也即该药对此菌的最小抑菌浓度（MIC）。

3．产青霉素酶淋球菌菌株（PPNG）测定——青霉素琼脂法 某些淋球菌菌株获得耐药质粒后产生β-内酰胺酶。该酶能分解青霉素，使培养基的pH降低，培养基颜色发生改变。产酶菌株分解青霉素产生青霉酶噻唑酸使培养基pH降低，颜色由红变黄。

三、生殖道沙眼衣原体感染检测

生殖道沙眼衣原体感染的实验室检测包括细胞培养、抗原检测和核酸扩增法等。

1．生殖道沙眼衣原体培养法 生殖道沙眼衣原体是专性细胞内寄生物，它只有在活细胞中方能增殖。将标本处理后接种于实验室培养的活细胞中，如标本中有生殖道沙眼衣原体，则经培养后细胞中可出现生殖道沙眼衣原体的包涵体。目前，实验室常用的细胞为McCoy细胞及HeLa229细胞。培养要获得成功，取材是关键。所取材中必须含有活细胞。因此，取材的棉拭一定要插到柱状上皮部位，旋转且放置20s，以便拭子吸附更多的细胞。细胞培养是诊断和鉴定生殖道沙眼衣原体的“金标准”方法，敏感性和特异性均高。但操作比较复杂，需一定的条件与设备，且较费时。

2．抗原检测法 抗原检测法包括快速免疫层析法、酶联免疫法和直接免疫荧光法。快速免疫层析法试验是指将生殖道沙眼衣原体单克隆抗体的带色乳胶复合物吸附于滤纸上，将滤纸夹在2块塑料板中间。若加入的标本为阳性，则标本中的抗原与结合有乳胶的单抗结合，复合物因毛细作用向前扩散移动到结果窗，可被该处含有的未标记的鼠抗衣原体单抗所捕捉，在结果窗中出现一条黑线，标本即为阳性。过剩的未结合的带色乳胶标记的鼠抗衣原体单抗可移动到质控窗，与该处的免抗鼠抗体结合，显现一条黑线。

3．核酸扩增法 聚合酶链反应（PCR）的基本原理是一种酶促合成反应。在膜板DNA、引物和脱氧核糖核苷酸的存在下，在DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增延伸。试验通过加热变性使DNA双螺旋的氢链断裂，解离成单链DNA，然后通过退火，突然降温使引物与其互补的模板在局部形成杂交链，然后在DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸底物和镁离子存在的条件下，在聚合酶的催化下，以引物为始点，使DNA链延伸。通过数十次循环扩增，使DNA片段得到大量复制，数量可达数百万倍。由于各种微生物的DNA千差万别，使试验具有高度特异性；由于试验中DNA片段能成对数地扩增，使方法具有高度敏感性；加之现代分子生物学技术迅速发展，已有了诸如测序仪、合成仪等仪器，使试验相对简易化。但开展PCR应具有一定的主客观条件。试验需有精密的温度控制仪和准确的微量移液管等基本设备，技术操作需有严格的防污染措施，严防极微量的微生物DNA污染试剂和实验用品，试验者应具有一定的分子生物学理论和操作经验，能够及时发现和纠正操作过程中的错误。连接酶链反应（LCR）是1989年才出现的一种核酸扩增试验，它与PCR不同之处是采用了两对寡核苷酸引物，它们与靶DNA碱基配对，结合于其上，然后连接酶将它们连接起来。此连接产物的顺序与靶NDA顺序相同。连接产物变性后，可作为引物的模板，通过变性-复性-连接20～30个循环，将连接产物扩增几十万倍以上。用生物素和碱性磷酸酶标记物后可直接对扩增产物进行检测。

4．血清学试验 人体感染生殖道沙眼衣原体后，产生相对应的抗体，但血清学试验的诊断价值有限。

四、人乳头瘤病毒检测

尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒（HPV）所引起的性传播疾病。传统上，HPV引起的疣被认为是一种良性增生性损害，但是，人们渐渐认识到它有可能向恶性肿瘤转化。因此，对于该病毒及其检测方法引起了极大的兴趣。

诊断试验包括临床和实验室方法。在临床上，认真仔细的体格检查常能发现具有特征的疣损害，醋酸白试验有助于检查临床表现不明显的疣。实验室方法有细胞学检查和病理检查。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，利用核酸印迹技术、原位杂交试验和PCR等方法检测HPV DNA。

（一）醋酸白试验

醋酸白试验的作用原理尚未明了。一种认为是HPV感染所产生的异常角蛋白被脱色；而另一种看法则认为是蛋白质凝固的结果。

1．方法

（1）用棉拭子蘸5%醋酸于有可疑损害的皮肤上。

（2）1min后观察结果，肛周皮损需要观察15min，借助放大镜能更清楚地观察结果。

2．结果 可疑损害处局部变白为醋酸白试验阳性。

3．意义 本试验有助于检测临床表现不明显或不典型的HPV感染，十分敏感。

4．注意事项 在某些情况下，如慢性炎症（尿道炎和包皮龟头炎）、表皮增厚或外伤等，会出现假阳性反应。假阳性反应时的变白现象界限不清，也不规则。

（二）细胞学检查

常用来检测无症状宫颈人乳头瘤病毒感染，但常不敏感。细胞学特点是病毒所致的异形性表现凹空细胞。

（三）病理学检查

1．方法 在疣组织部位常规病理取材，制成切片，经HE染色后镜检观察。

2．结果 在HE染色中，细胞核染成鲜明的蓝色，细胞质染成桃红色。

诊断要点为角化不全，特别是有核异态的角化不全；表皮疣或棘层不同程度增生肥厚；空泡化细胞（特别是较典型较大量的空泡化细胞）；基底细胞增生。

五、疱疹病毒检测

生殖器疱疹（genital herpes）的病原体是单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）。HSV有两个血清型，即HSV-I和HSV-2，大多数的生殖器疱疹是由HSV-2引起的。生殖器疱疹的实验室检测包括病毒分离、细胞学检查、单纯疱疹病毒抗原检查和血清学检测。其中病毒分离和鉴定可作为确诊，其他方法的诊断价值有限。

（一）单纯疱疹病毒的分离和鉴定

1．标本的收集

（1）疱液：用结核菌素注射器从成熟的小疮中抽取液体，注入有2.0ml病毒运送液的小瓶中（每ml含100mg庆大霉素和10mg两性霉素B的0.5%牛血清白蛋白Hanks平衡盐水）。也可只刺破小疮后用无菌棉拭取材，并将棉拭头剪断放入2.0ml病毒运送液的小瓶中。

（2）溃疡：先将表面物质去除，再用灭菌棉拭用力擦拭或刮取溃疡的基底部，并将棉拭头剪入2.0ml病毒运送培养液中。

如果使用藻酸钙拭子，则它不应保留在培养基中，因藻酸钙对病毒有毒性，而应将标本洗于培养液中而将拭子丢弃。

2．试验方法 虽然标本可以冷冻，但在收集24～48h内就接种较为有利。所用细胞为原代人胚肾细胞、人胚肺成纤维细胞、HeLa细胞、Vero细胞和HEP-2培养物。标本在送达实验之后先将病毒输送液摇匀，取2.0ml处理过的标本接种于细胞培养基中，放在37℃孵箱中培养。每日观察有无出现病毒对细胞的致病作用。典型的病变可在24h或几天内出现，取决于接种液中病毒的含量和毒力。

3．疱疹病毒的鉴定 常用免疫荧光法，方法如下。

（1）如细胞出现典型的病变时，可初步报告为“单纯疱疹病毒分离可疑”。

（2）在至少50%人胚肾细胞出现疱疹病毒的病变之后，将培养物反复冻融3次，吸取0.2ml接种到新的HEP-2细胞管中。这种细胞至少有50%能产生病变，因而适合于做免疫荧光试验。

（3）再经培养后，将HEP-2细胞用吸管吹打下来，以200g离心10min使沉淀，去上清后，将细胞混悬到100μl pH7.2的磷酸缓冲液（PBS）中。

（4）取25μl的细胞悬液滴到载玻片两端标记好的位置上。

（5）每个涂点用小棒涂成直径为1cm的圆膜，经空气干燥后用丙酮固定10min，再在空气中干燥。

（6）涂片用直接或间接荧光法染色。试剂可用商品化的结合荧光素的多克隆抗血清和特异性单克隆抗血清。

（7）一旦一个疱疹病毒完成了分型鉴定则可报告为“初步的疱疹病毒分离物已鉴定为Ⅱ型（或Ⅰ型）单纯疱疹病毒”。

（二）单纯疱疹病毒的细胞学检查

用灭菌棉试使劲擦试水疱或溃疡的基底，在载玻片两端作直径为1cm的2个圆膜。放在空气中干燥。用丙酮固定10min，待干。用荧光抗体与其结合。当检出特异的病毒感染细胞时，涂片报告为“免疫荧光法检查单纯疱疹病毒阳性”。细胞也可以用Wright或Giemsa及PaPanicolaou法染色，用光学显微镜观察，在多核巨细胞的胞核内找到嗜伊红包涵体有助诊断。但此法敏感性仅50%～80%，且不具有特异性。阳性结果常在病初和从水疱或小脓疱损害中获得，从溃疡性损害或从多次发作的病人取材时阳性率低，而恢复期损害（结痂的）中，病毒的发现率更低。

（三）单纯疱疹病毒抗原检查

近年来，直接检查临床标本的单纯疱疹病毒（HSV）抗原的诊断方法发展较快，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光法（IFA）、乳胶凝集（LA）等。DNA杂交与PCR检测技术也已在我国应用。这些方法有快速、特异、敏感及无损害性等优点。因此，HSV抗原直接检测是今后HSV检测的发展方向。

1．酶联免疫吸附测定（ELISA） ELISA由于具有方法简单、灵敏和特异性高等优点，已经在许多领域得到应用。一般认为此法的标本检出率在52.5%～96.1%。试验的原理是用特异性抗体致敏载体，与含有抗原的溶液共同孵育，洗去过量的抗原，再加入酶标记的特异性抗体。孵育后，洗去过量的酶-抗体结合物，然后加入酶底物，底物颜色的改变与抗原量呈正比。ELISA法又分为间接法、双抗体夹心法和竞争法。

2．免疫荧光法（IFA） 先将异硫氰基荧光素（FITC）和罗丹明等荧光素与特异性抗体结合，在一定条件下，再与标本中的相应抗原产生结合反应，形成有荧光的抗体-抗原复合物，通过荧光显微镜观察，可看到复合物发出的荧光，即表示标本中存在相应的抗原。

3．DNA杂交 核酸分子杂交技术以其特异和敏感为主要特点。目前，核酸分子杂交技术已经成为病毒基因工程领域中的主要研究手段之一，它被广泛应用于研究和临床工作。

试验原理是各种生物的DNA中碱基对是互补的，在适当的条件下，互补的单链DNA能形成双链结构。反应体系中如果以放射性核素或生物素标记的DNA作为探针，它与待检核酸中的相同序列可形成双链结构，通过放射自显影或免疫手段可检查待检核酸中的共同序列。但该方法试验条件要求较高、费时、费事，且标记放射性核素不仅有损害性，也不易保存，使常规使用受到限制。

4．聚合酶链反应（PCR） 聚合酶链反应是20世纪80年代中期迅速发展起来的高生物技术，也是基因扩增技术的一次重大革命。此项新技术被广泛应用于分子生物学、医学及遗传学等各个领域。

利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特性，模仿体内的DNA复制过程。在附加的一对引物之间诱发聚合反应，经过DNA变性、退火、延伸三大步骤的多次循环，可以得到大量介于这对引物之间的序列，用电泳或核酸杂交技术进行检测。PCR技术具有敏感、特异、快速等特点。

PCR作为一种新型诊断方法，特别是它的灵敏性高，可检测到小至3pfu HSV。PCR的敏感性较细胞培养高，已初步在临床病毒检验工作中显示出了较大的优越性。但该方法由于高灵敏度，易产生污染而导致假阳性。对实验室设置要有3～4个各自封闭的工作区间，室内用品严格专用及一次性使用，实验过程要有严格的质检和内对照等；工作人员素质要求高，对临床标本的采集和处理要求也高，否则都会影响结果的准确性。目前市售的国产试剂盒，在质量上是有一定差异的，在选择时，一定要选用质量可靠的试剂盒，否则会影响结果的可靠性。

一般认为PCR基因扩增技术和DNA杂交技术不能单独作为确证指标，只有在PCR扩增和DNA杂交阳性并且检出该病原体相应的抗体时才能作出病原学诊断。目前，检测HSV病原体技术主要采用酶联免疫技术（ELISA）。它具有敏感度高、特异性强、准确率高、应用面广、不需高档实验仪器和操作简便等优点。

（四）单纯疱疾病毒的血清学检测

血清学诊断目前常用的是中和试验。它可用于诊断单纯疱疹病毒的原发感染，但对恢复期或复发的生殖器疱疹的诊断没有用处。

中和试验是指特异性抗体能中和相应的病毒活力（或细菌外毒素）的一种特异的抗原抗体反应。自从能用组织培养和鸡胚来代替动物做中和试验之后，该法已变得较为简便和实用。