第四章 艾滋病性病实验室检测
第一节 艾滋病实验室检测
艾滋病检测是指采用实验室方法对人体血液、其他体液、组织器官、血液衍生物等进行艾滋病病毒、艾滋病病毒抗体及相关免疫指标检测，包括HIV抗体、HIV-1抗原、CD4+T细胞和CD8+T细胞检测、HIV核酸、HIV-1耐药和HIV-1的分离培养。艾滋病检测实验室必须通过技术和条件验收，经省级卫生行政部门审批合格后方可开展工作。
一、样品采集和处理
（一）血液
1．抗凝全血 消毒局部皮肤，用含有抗凝剂的真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，移至加有抗凝剂的试管中，轻轻颠倒混匀6～8次。
2．末梢全血 消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择耳垂、中指、无名指或示指。1岁以下儿童采用足跟部）。用采血针刺破皮肤，用无菌纱布擦掉第1滴血，然后收集滴出的血液。
3．血浆 将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15min，上层即为血浆。
4．血清 用一次性注射器（或真空采血管）抽取5～10ml静脉血，室温下自然放置1～2h，待血液凝固、血块收缩后再用1500～3000r/min离心15min，上层即为血清。
5．淋巴细胞富集液 将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15min，血浆层下即为淋巴细胞富集液。
6．外周血淋巴细胞（PBMC） 使用淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心，吸出PBMC层。
（二）滤纸干血斑（DBS）
（1）将采集的各种血液样品制备成滤纸干血斑，最常用的是用抗凝全血、外周全血和血浆制备滤纸干血斑。
（2）用移液器吸取100μl抗凝全血（或血浆）样品，对准滤纸印圈的中心处，将样品滴在滤纸上，或将穿刺后自皮肤伤口流出的外周全血直接滴加在滤纸印圈的中心处。
（3）在室温下自然干燥至少4h（潮湿气候下至少干燥24h），不要加热或堆叠血斑，切勿与其他界面接触。
（4）血斑充分干燥后，将其放入密封袋中，避免血斑之间的相互污染，同时放入干燥剂及湿度指示卡，密封包装。
（三）尿液和唾液
1．尿液 使用清洁的容器收集尿液。女性应避开月经期。尿液样品可以在2～8℃下存放。
2．唾液 使用试剂盒提供的容器收集唾液样品。
（四）样品的保存
（1）用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品，1周内进行检测的可存放于2～8℃，1周以上应存放于-20℃以下。
（2）用于核酸检测的血浆和血细胞样品4日内进行检测的可存放于4℃，3个月以内应存放于-20℃以下；3个月以上应置于-70℃以下。
（五）样品运输要求
（1）应符合生物安全要求，要获得相应部门批准并由具有资质的人员专程护送。
（2）采用3层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，放置在洁净区域。
1）第1层容器：通常使用试管，试管上应标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。
2）第2层容器：容纳并保护第1层容器，可以装若干个第1层容器。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒。
3）第3层容器：容纳并保护第2层容器的运输用外层包装箱。
4）用于抗体检测的血清和血浆样品应在冻存条件下运送；用于CD4+T细胞和CD8+T细胞测定的样品应在室温下（18～25℃）或4℃（特殊要求时）运送；用于HIV-1载量检测的样品应在-20℃以下运输；DBS样品在室温下（18～25℃）运送。每一件包装的体积不宜超过50ml。
5）特殊情况下经有关部门批准可以用特快专递邮寄样品，但必须按3层包装，严禁使用玻璃器皿。
（六）样品的接收
（1）样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内，由经过培训的工作人员在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时消毒。
（2）核对样品与送检单，如发现试管溢漏应立即将尚存留的样品移出，对试管和容器消毒，同时报告实验室负责人。
（3）检查样品有无严重溶血、微生物污染、血脂过多及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弃，并将样品情况立即通知送样人。
二、HIV抗体检测
（一）常规HIV抗体检测的方法
HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确证试验。
1．筛查试验 筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准，其中酶联免疫试剂应批批检合格。样品可采用血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液样品。
2．筛查方法
（1）酶联免疫吸附测定（ELISA）：可使用血液、唾液、尿液样品，ELISA多为单纯HIV抗体检测试剂。HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。
（2）化学发光或免疫荧光试验：这类试剂采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。
（3）快速检测（RT）及其他检测试验
明胶颗粒凝集试验（PA）：将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种：同时检测HIV-1和HIV-2抗体及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。
免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：均以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。
免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品（血液或唾液）沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。
3．筛查试验结果报告 HIV抗体筛查试验阴性反应报告为“HIV抗体阴性（-）”；阳性反应报告为“HIV抗体待复检”。
（二）确证试验
试剂必须是经国家食品和药品监督管理局注册批准。确证样品可采用血清、血浆、滤纸干血斑样品。确证方法包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验（RIPA）及免疫荧光试验（IFA）等。
1．常规试验为免疫印迹试验 硝酸纤维试剂膜条上结合了天然灭活HIV-1型蛋白的分离颗粒和特异性的HIV-2型合成多肽。硝酸纤维试剂膜条分别与加入稀释的血清或血浆样本和对照孵育。如果样本中含有HIV-1和HIV-2型的特异性抗体，则抗体会与试剂膜上的HIV-1蛋白和HIV-2多肽结合，通过清洗去除试剂膜上的未结合物，与HIV蛋白特异性结合的抗体再通过与带有碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体结合，加入BCIP/NBT底物等一系列反应即可显色。
2．HIV抗体确证试验结果的判定
（1）HIV-1抗体阳性：同时符合以下2条标准可判为HIV-1抗体阳性。①至少有2条env带（gp41和gp160/gp120）出现，或至少1条env带和p24带同时出现；②符合试剂盒提供的阳性判定标准。
（2）HIV-2抗体阳性：出现HIV-2型特异性指示带的样品：如果同时呈HIV-1抗体阳性反应，报告HIV-1抗体阳性，不推荐进一步做HIV-2抗体确证试验；如果同时呈HIV-1抗体不确定或阴性反应，需用HIV-2型确证试剂再做HIV-2的抗体确证试验。同时符合以下2条标准，即出现至少2条env带（gp36和gp140/gp105），和试剂盒提供的阳性判定标准，可判为HIV-2抗体阳性。
（3）HIV抗体不确定：出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性。①HIV-1抗体特异带包括：env带：gp160/gp120、gp41；gag带：p55、p24、p17（或p18）；pol带：p66（或p65）、p51、p31。②HIV-2抗体特异条带包括：env带：gp140/gp105、gp36；gag带：p56、p26、p16；pol带：p68、p53、p34。（由于使用的毒株不同，HIV-2 env带也可为gp125/gp80、gp36）。
（4）HIV抗体阴性：无HIV抗体特异带出现。
3．确证试验结果报告 符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性（+）”；符合HIV-2抗体阳性判断标准，报告“HIV-2抗体阳性（+）”。符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性（-）”。如疑似“窗口期”感染，建议进一步做HIV核酸检测。符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定（±）”，在备注中应注明“4周后复检”。
三、HIV-1抗原检测
常规试验为HIV-1P24抗原检测，又分定性和定量检测。样品可采用血清、血浆或病毒培养上清液，方法为ELISA抗体夹心法。
（一）定性检测
1．筛选试验 按照试剂盒说明书提供的标准判断有反应或无反应。
2．确证试验 是P24抗原的中和试验，用于排除筛选试验的假阳性。待检样品先与中和剂（P24抗原的抗体）共同孵育，如果样品中存在P24抗原，中和抗体将与之结合形成复合物，而不能与固相载体上的捕获抗体结合。用这样处理过的样品重复筛选实验的步骤，同时做一孔未中和的原始样品对照，将中和与未中和孔的OD值进行比较，如果中和孔的OD值下降50%以上，认为样品中的P24抗原是真正的阳性；如果中和孔没有出现OD值的下降，认为P24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。
（二）定量检测
将P24抗原的标准物质稀释成包含0.0和125pg/ml 2个浓度在内的6个不同浓度的系列标准，进行检测。以横坐标为P24抗原的浓度（pg/ml），纵坐标为OD值，绘制出标准曲线。测出未知标本的OD值以后，在标准曲线上查出抗原的浓度。如果未知标本的OD值超出标准曲线上最高抗原浓度的OD值，则需用正常人血清将标本稀释以后再行检测。
（三）结果报告和解释
HIV-1 P24抗原筛选试验有反应的标本必须经过中和试验确证以后才能判断阳性或阴性；HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊；HIV-1 P24抗原阴性结果不能排除HIV感染。监测病程进展或抗病毒治疗效果应进行HIV-1 P24抗原的定量检测。
四、CD4+细胞和CD8+T淋巴细胞检测
（一）样品种类、运输和接收
1．样品种类 采用抗凝全血，应选择合适的抗凝剂。①用于血液学检测的抗凝剂：K3EDTA或K2EDTA抗凝管；②用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂：K2EDTA、K3EDTA、酸性枸橼酸葡萄糖溶液（ACD）或肝素抗凝。一般要求48h内染色，染色后6h内分析。如采血后24h内染色，则可在染色后24h内分析。如利用CD45单克隆抗体和侧向光设淋巴细胞门，可检测放置72h的样品。
2．样品运输 室温（18～25℃）保存和运输样品，高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将样品置于有冰袋和吸热物质的容器中。
3．样品接收 由专人接收样品，检查样品数量并核对标识；溶血、凝血或结冰的样品应视为不合格样品，超过检测允许时间的样品不可检测；如果样品运输过程中温度超出室温范围，但没有明显的溶血或结冰，可以处理样品，但要在工作表的报告上注明温度条件。
（二）检测方法
CD4+T细胞和CD8+T细胞计数的方法分为两大类：一类是应用流式细胞仪测定法；另一类是非流式细胞仪测定法。常用的淋巴细胞计数检测方法为自动检测方法，包括流式细胞仪（主要有多平台法和单平台法）和专门的细胞计数仪。
1．流式细胞仪检测方法 可分双平台法和单平台法两种。
（1）双平台方法：是一种细胞群体的绝对计数方法，利用血球计数仪检测淋巴细胞数量，再根据流式细胞仪得到的细胞群体百分比，计算得到每微升的淋巴细胞数量，这种方法称为双平台方法。双平台法需要两种仪器，由于仪器有系统误差，计算结果的重复性和准确性影响因素较多，用这种方法进行CD4+和CD8+T细胞计数时，不同实验室差异很大。这种方法最大的缺点在于操作步骤复杂，操作人员多、费时。因此，很难将变异水平减小到最低。
（2）单平台方法：是相对双平台法而言的，即应用三色、四色流式试剂配以内参绝对计数微球，加上流式细胞仪淋巴细胞亚群获取和分析软件，一步即可获得T细胞亚群的相对数（百分比）和绝对数。通过使用已知数量的参考微球为内参，可以直接报告绝对计数，即通过获取的目标细胞与参考微球的比例、参考微球数量和样品体积，得到每微升的淋巴细胞数量。单平台法最大限度地减少了多个仪器检测带来的检测误差，细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证。
2．非流式细胞仪测定法
（1）Cyto-Spheres方法：CD4+计数试剂盒包含CD4+微球试剂，即包被有单克隆抗体的惰性乳胶微球，可以通过光学显微镜鉴别和手工计数新鲜全血中CD4+T细胞的绝对数。其原理是人和动物的T细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以黏附到T细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。
（2）Dynabeads方法：以免疫磁珠细胞分离方法为基础，使用包被CD4+和CD8+抗体的Dynabeads磁珠，从全血中捕获分离CD4+T细胞和CD8+T细胞；另一种CD14微球用来阻隔单核细胞。用甲紫（龙胆紫）和台盼蓝染色分离出来的CD4+T细胞，在光学显微镜下或自动细胞计数仪上计数。
五、HIV核酸检测
HIV核酸检测分为定性和定量检测。
（一）定性检测
可检测单个样品或多个混合样品（集合核酸定性检测，Pooling PCR）。方法分为商品化试剂盒和实验室自建方法两种，商品化试剂应严格按说明书操作。以下介绍的是实验室自建方法。
检测血浆或血清样品使用反转录PCR（RT-PCR）方法，建议第1轮PCR扩增使用RT-PCR一步法；检测血细胞或组织样品使用PCR方法。一般使用扩增两轮的套式PCR方法。
设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照为与待测样品同质、含有目的基因的样品；阴性对照为与待测样品同质、不含有目的基因的样品。阳性和阴性对照样品应与待检样品处理程序一致。阴性对照的设置数量应根据实验样品的数量设置在不同的位置。
1．试剂
（1）PCR引物：一般使用扩增HIV gag和（或）pol和（或）env和（或）LTR等引物。进行RNA反转录时可使用下游特异性引物或随机引物。引物设计可参考文献或自行设计，应尽量涵盖常见的HIV流行毒株，也可使用兼并性引物。
（2）主要试剂：包括核酸提取纯化、反转录、PCR所需的试剂。使用商品化核酸提取纯化试剂、反转录酶反应试剂和PCR扩增试剂。
（3）抗污染试剂：实验室自建检测方法可使用抗污染试剂，参考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。
2．扩增目的基因片段
（1）核酸提取：可使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。
（2）反转录合成cDNA：使用商品化试剂并按说明书操作。反转录cDNA合成反应需使用反转录引物、dNTPs、反转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行反转录反应。建议使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第1轮扩增反应。
（3）PCR扩增反应：使用商品化试剂按说明书操作。PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水，以及模板（DNA或cDNA）。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。一般使用2次扩增的套式PCR扩增方法。
3．扩增产物分析及结果报告
（1）扩增产物分析：扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其他扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析及DNA序列分析等。自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析或荧光探针杂交等原理测定。
（2）结果判定和报告：实验成立的条件：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。HIV核酸检测阳性：使用商品化检测试剂，发现核酸阳性反应，应该重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判定为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。HIV核酸检测阴性：只可报告本次实验结果阴性。
（二）定量检测
HIV-1载量检测根据方法的原理不同分为核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术，实时荧光定量PCR扩增（real-time PCR）技术，分枝DNA信号放大系统（bDNA）技术。
1．核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术 此技术是以一种等温扩增系统。其代表产品为实时荧光技术NucliSens EasyQ分析仪，它通过结合NASBA技术、BOOM核酸提纯技术与分子信标探针技术检测血浆中的HIV RNA水平。
2．实时荧光定量PCR扩增（real-time PCR） 技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它的代表产品包括Cobas Amplicor Taqman检测系统、M2000检测仪和一些国产仪器。
3．分枝DNA信号放大系统（bDNA）技术 基于其独特的信号放大系统（分枝DNA信号放大系统），为一个人工合成的分枝DNA，它的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。代表产品为Bdna440病毒载量检测仪。
六、HIV-1耐药检测
HIV-1耐药检测的方法可分为两大类：一类是基因型检测法；另一类是表型检测法。常用方法为HIV-1基因型耐药检测法，它主要有美国FDA批准的ViroSeqTMHIV-1基因型自动检测法、TRUGENERHIV-1基因型半自动检测方法和各实验室自建的（In-house或Home-brew）方法。自建法与前两种方法检测结果的准确性无显著性差异，并且价格低廉，以下主要介绍此方法。
（一）样品采集和处理
要求HIV感染者血浆病毒载量≥1000拷贝/ml或国际单位，采用血浆、滤纸干血斑样本。
（二）检测试剂
1．引物 根据所检测的目的基因、参考文献和本地HIV-1流行毒株的序列设计扩增和测序引物。
2．主要试剂 实验室自建方法需配置病毒核酸提取、反转录、PCR和测序反应等步骤所需的试剂。
（三）核酸提取
按照核酸提取试剂盒说明书操作，提取血浆RNA常用QIAamp viral RNA Mina Kit试剂盒，提取DBS样品中的总核酸（RNA和DNA）常用NucliSENS RNA Isolation Kit试剂盒。实验中应加阴、阳性外部对照，提取RNA时应注意防止RNA降解。RNA和需长期保存的DNA应在-80℃保存。
（四）反转录和PCR扩增
将RNA模板、反转录引物、dNTP、反转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液和适量无RNA酶的超纯水加入反应管中，在适宜温度下进行反转录反应，合成cDNA。将模板（DNA或cDNA）、dNTP、引物、缓冲液、TAQ酶和适量灭菌纯水加入反应管中，放在扩增仪上，按照设定的程序进行PCR扩增。建议使用一步法试剂进行第1轮扩增反应。
（五）序列测定
通常采用Sanger法进行DNA测序。将扩增产物、dNTP、ddNTP、测序引物、缓冲液、Taq酶和适量灭菌纯水加入反应管中，置于扩增仪上，按照设定的程序进行测序反应，在测序仪中读取序列数据。也可以送到有资质的商业测序公司进行。
（六）耐药程度分析
提供HIV-1耐药基因型检测数据分析和解释系统（HIVDRDB）的主要机构有：
1．国际艾滋病协会（IAS, http://www.iasusa.org）。
2．美国斯坦福大学（HIVDB, http://hivdb.stanford.edu）。
3．法国国家艾滋病研究署（ANRS, http://www.hivfrenchresistance.org/index.html）。
4．比利时Leuven大学Rega医学研究所（REGA, http://www.kuleuven.ac.be/rega/cev/）。
（七）检测结果的分析解释
1．耐药相关的基因突变 分基因区报告耐药相关的基因突变，可将蛋白酶（PRO）和反转录酶（RT）两个基因区的基因突变分开报告。基因突变表示方式为“字母-数字-字母”，第1个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸，第2个字母代表在特定密码子处替换了的氨基酸。
2．耐药程度分析 每个HIV-1耐药基因型解释系统对耐药程度的报告是不同的：HIVDB系统分为敏感（S）、潜在耐药（P）、低度耐药（L）、中度耐药（I）和高度耐药（H）5个水平。Rega、ANRS和商品化试剂盒所采用的系统则分为敏感（S）、可能耐药（I）和显示耐药（R）3个水平。
3．其他 当耐药毒株在个体内病毒群体中的比例低于10%～20%时，通常检测不到其存在。因此，当在HIVDB、Rega或ANRS系统中报告为“S”，只可报告本次实验结果为“未发现耐药”，不能报告为“敏感”。
七、HIV-1的分离培养
一般采用靶细胞（HIV阴性者外周血淋巴细胞，PBMC）与受检者标本（PBMC、全血、血浆、精液及其他体液）共培养的方法，最常用的方法是PBMC共培养。
1．靶细胞制备 取HIV阴性者的抗凝全血，采用密度梯度离心的方法分离PBMC，并在含有适量天然白细胞介素-2（IL-2）和植物血凝素（PHA-P）的培养基中培养3日，使淋巴细胞由静止状态充分活化。
2．建立共培养 将靶细胞与待检样本混合，在合适的条件下培养，培养过程中适时换液或补加新鲜靶细胞，维持培养28日。
3．监测病毒生长 定时取适量培养上清液，检测HIV-1P24抗原或反转录酶活性；也可定期观察细胞的形态，看有无HIV特征性的合胞体或其他细胞病变。
4．病毒鉴定 取培养上清液提取纯化RNA，或取共培养的PBMC提取纯化基因组DNA，用PCR方法扩增HIV-1特征性基因片段，对扩增阳性的片段进行基因序列测定。
5．判定结果和解释 培养上清液P24抗原或反转录酶连续2次呈阳性反应、并有P24抗原含量/反转录酶活性升高，或同时出现HIV特征性细胞病变，并经鉴定为HIV基因序列，判为HIV-1分离阳性；培养上清液P24抗原或反转录酶始终为阴性，判为HIV-1分离阴性。HIV-1分离培养阳性可以确证为HIV-1感染，分离培养阴性不能排除HIV-1感染。