学习活动5 外植体的褐变、玻璃化及防止

【学习目标】 1．能认识外植体褐变及玻璃化现象。

2．能分析褐变及玻璃化现象产生的原因。

3．能制定防止褐变及玻璃化现象的措施。

【学习准备】 培养室、褐变瓶苗、玻璃化瓶苗。

【学习过程】

问题1

观察外植体培养过程中出现的褐变现象，分析为什么会褐变？怎样预防？

基本知识

污染、褐变和玻璃化现象被称为植物组织培养的三大难题。

一、外植体褐变及防止

褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后使培养材料变褐而死亡。在植物组织培养中，控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。因此，能否有效地控制褐变是某些植物组织培养成功的关键。

图4-5-1蝴蝶兰组培苗的褐变现象

（一）褐变的原因

影响褐变的因素极其复杂，植物种类、基因型、外植体的部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。

1．种类和品种

不同植物与品种的褐变程度是不同的，有人把此归结为基因型的不同。一般来说，植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐变。多数木本植物比草本植物易产生褐变，多年生草本植物比一年生草本植物易产生褐变。

2．外植体的生理状态和大小

通常幼龄部位产生褐变较轻，随着组织的老龄化，其木质素含量增高，所含醌类物质增多而褐变加重。因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，以切取幼嫩的芽尖或顶芽分生组织（或带少量叶原基）接种更为理想。

3．外植体取材时间和部位

一般在春夏季，尤其是春季选取的生长旺盛的外植体产生褐变较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐变严重。这是分生部位接种后形成醌类物质少、分化部位形成醌类物质较多的缘故。

4．培养基的成分

外植体的培养基状态（固体、半固体、液体培养基）、无机盐浓度、激素种类和浓度以及培养基的pH值，都与外植体接种后的褐变程度有关。

过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化而褐变，低盐培养基，尤其是Mn2+和Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变程度，且可获得愈伤组织和胚状体。

植物生长调节物质使用不当时，培养材料也容易褐变。细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。

培养基的pH值较低时常有利于减轻外植体的褐变程度。

一般在液体培养基和半固体培养基上褐化程度比在固体培养基上轻。

5．培养条件

温度过高、光照过强、培养时间过长等均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。

6．材料转移时间

在同一培养基上培养时间过长也会引起材料的褐变，以至全部死亡。

（二）褐变的防止措施

1．选择适宜的外植体及最佳培养基

许多成功的经验表明，选择适宜的外植体并建立最佳的培养条件是防止外植体褐变最主要的手段。外植体材料应有较强的分生能力，在最适宜的细胞脱分化与再分化的培养条件下使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变程度。在诸多因子中，较为重要的是适宜的无机盐浓度、蔗糖浓度及激素水平。在适宜的温度及黑暗条件下进行培养可显著减轻材料的褐变程度。如能在初始培养的1~6周内进行暗培养，或在150 lx左右的光照强度下进行光培养，可抑制酚类物质氧化。

2．连续转移

对易褐变的材料进行连续转移可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用。在无刺黑莓的茎尖培养中，接种后1~2d就转入新鲜培养基，可明显减轻褐变程度；在山月桂树的茎尖培养中，接种后12~24 h便转入液体培养基，然后继续每天转移1次，连续7 d，褐化便得到了完全控制。

3．加入抗氧化剂

在培养基中加入抗氧化剂，或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可预防醌类物质的形成。抗氧化剂包括抗坏血酸（维生素C）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和牛血清白蛋白等。在静止的液体培养基中加入抗氧化剂比在固体培养基中加入抗氧化剂，效果要明显得多。在倒挂金钟茎尖培养中加入0.01%PVP，对褐变有抑制作用。

4．加入活性炭

0.1%～0.5%活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防止外植体褐变的明显效果。

问题2

观察玻璃化试管苗，分析为什么会产生玻璃化现象？怎样预防？

基本知识

二、试管苗的玻璃化现象及预防措施

试管苗玻璃化是指试管苗呈半透明和水渍状的现象。

与正常苗相比，玻璃化苗最显著的变化就是其外观呈半透明状。此外，玻璃化苗茎尖分生组织相对较小，并且茎尖发育部分保持分生组织性的时期也缩短；叶片表面积缩小或增大，叶片常皱缩并纵向卷曲，并且脆弱易破，颜色不正常；玻璃化苗难以增殖、生根、成苗。玻璃化苗由于生理功能异常，难以移栽成活。因此，玻璃化现象对利用植物组织培养技术进行植物的快速微繁殖是不利的。

（一）玻璃化苗产生的原因

产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂浓度、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。

1．激素浓度

激素主要包括生长素和细胞分裂素，激素浓度升高尤其是细胞分裂素浓度升高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。产生玻璃化苗的细胞分裂素浓度因植物种类的不同而异。

细胞分裂素的主要作用是促进芽的分化，打破顶端优势，促进腋芽发生，因而玻璃化苗表现出茎节较短、分枝较多的特点。

2．琼脂浓度

培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重。随着琼脂浓度的升高，玻璃化苗比例减少，但硬化的培养基又会影响养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖也减少。因此，琼脂浓度一定要适当。

3．温度

适宜的温度可以使试管苗生长良好。温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低，玻璃化苗的比例越高。随着温度升高，玻璃化苗减少，但温度超过一定限度后，会对试管苗正常的生长和代谢产生影响，反而促进玻璃化苗的产生；变温培养时，若温度变化幅度大，容易在瓶壁内产生小水滴，增加瓶内湿度，提高玻璃化苗发生率。

4．光照时间

不同的植物对光照的要求不同，达到植物需要的光照时间，试管苗才能正常生长。大多数植物在10～12 h光照下、强度1000～3000 lx时都能良好生长。光照不足再加上高温，极易引起组培苗过度生长，加速玻璃化发生。但是，光照时数大于15 h时，玻璃化苗的比例明显增加。

5．通风条件

试管苗生长期间要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类。在一定容量的培养瓶内，愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。如果培养瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。愈伤组织和试管苗长时间培养，不及时转移，容易出现玻璃化苗。组织培养所用瓶盖有棉塞、锡箔纸、滤纸、封口纸、牛皮纸、塑料膜等，其中棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气性较好，玻璃化苗的比例较低；而锡箔纸不透气，影响气体交换，玻璃化苗增加。用塑料膜封口时，玻璃化苗剧增。

6．培养基成分

植物生长需要一定的矿物质营养，如果营养离子之间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类及其比例不适合该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。一般认为，提高培养基的碳氮比，可以降低玻璃化苗的比例。

7．培养材料

植物种类、外植体的类型以及大小显著影响玻璃化苗的产生。外植体越小，玻璃化苗产生率越大，这可能是由于外植体的较老组织中含有防止玻璃化苗产生的物质，或者是较大外植体的分生组织远离培养基表面，使其生长环境的水分状况得到改善。

（二）玻璃化苗的预防措施

1．选不易玻璃化的基因型及组织部位做外植体

2．增加自然光，控制光照时间

自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化，减少玻璃化现象。因此，光照培养时，适当增加自然光，提高光照强度，有助于克服玻璃化。但光照时间不宜过长，多数植物以每天光照时间8~12 h、光照强度1000~3000 lx为宜。

3．改善培养容器的气体交换

使用棉塞、通气性好的封口膜封口，增加通气，尽可能降低培养容器内的空气相对湿度，改善氧气供应状况，有助于减少玻璃化现象。

4．提高培养基中琼脂浓度

适当提高琼脂浓度，有利于减少玻璃化现象。在提高培养基中琼脂浓度的同时，要选用含灰量低的琼脂粉。因为琼脂杂质中的Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+等含量高会影响培养基中矿质元素的含量和比例，进而影响玻璃化现象。

5．提高培养基中蔗糖浓度

适当提高培养基中蔗糖浓度，可降低培养基的渗透势，减少外植体从培养基中获得的水分，从而减少玻璃化现象。

6．降低细胞分裂素浓度

适当降低细胞分裂素的浓度，同时注意细胞分裂素和生长素的配合以及激素和K+之间的配合，力求兼顾不定芽增殖系数并控制玻璃化苗的产生。

【思考题】

1．什么是外植体？如何选择外植体？

2．简述外植体接种的技术步骤。

3．说明外植体褐变的原因和防止措施。

4．说明玻璃化苗产生的原因和预防措施。

5．组织培养工作中防止污染的措施有哪些？