学习活动3 培养基配制

【学习目标】 1．能根据母液浓度、培养基配方及配制培养基的数量要求，计算各种母液的取量。

2．能均匀分装营养液，并正确封口。

3．能正确使用高压锅对培养基进行灭菌。

【学习准备】 配制好的各种母液、蒸馏水、培养瓶、有刻度的钢精锅、电磁炉、pH试纸或酸度计、0.1 N的NaOH、0.1 N的HCl、量筒、移液管、蔗糖、琼脂、高压锅。

【学习过程】

问题1

前面我们已经制备好了培养基的各种母液，也已经准备好了培养基制备的设备，现在接到公司技术部下达的一培养基配方及制备数量，我们怎么来制备培养基呢？

基本操作

一、培养基配制基本操作

配方：MS+6-BA 2 mg+NAA 0.5 mg+蔗糖30 g+琼脂6 g，培养基制备量：10 L。

1．将已配好的各种母液按照大量元素（母液Ⅰ、母液Ⅱ、母液Ⅲ）、微量元素、铁盐、有机物质、生长调节物质母液的顺序摆放好。

2．根据母液浓缩倍数和培养基制备量计算各种母液的取量，并计算琼脂和蔗糖的量。

已知：大量元素母液Ⅰ、母液Ⅱ、母液Ⅲ浓缩20倍。

微量元素母液浓缩200倍。

有机物质母液浓缩200倍。

铁盐母液浓缩200倍。

6-BA母液浓度为1 mg/mL。

NAA母液浓度为0.5 mg/mL。

所以，1 L（1000 mL）培养基需要量取：

大量元素母液Ⅰ:1000÷20=50（mL）

大量元素母液Ⅱ:1000÷20=50（mL）

大量元素母液Ⅲ:1000÷20=50（mL）

微量元素母液：1000÷200=5（mL）

铁盐母液：1000÷200=5（mL）

有机物质母液：1000÷200=5（mL）

6-BA母液：2 mg÷1 mg/mL=2（mL）

NAA母液：0.5 mg÷0.5 mg/mL=1（mL）

那么，配制10 L培养基需要量取：

大量元素母液Ⅰ:50 mL×10=500（mL）

大量元素母液Ⅱ:50 mL×10=500（mL）

大量元素母液Ⅲ:50 mL×10=500（mL）

微量元素母液：5 mL×10=50（mL）

铁盐母液：5 mL×10=50（mL）

有机物质母液：5 mL×10=50（mL）

6-BA母液：2 mL×10=20（mL）

NAA母液：1 mL×10=10（mL）

琼脂：6 g×10=60（g）

蔗糖：30 g×10=300（g）

3．用量筒或移液管量取各种母液。

用天平称取琼脂用量：6 g×10=60（g）

用天平称取蔗糖用量：30 g×10=300（g）

4．一般在钢精锅中加入配制培养基总量2/3的蒸馏水，即约7L蒸馏水。

5．加入琼脂，放在电炉或电磁炉上加热，并不断搅拌使之溶解。

6．将量取好的各种母液按照顺序倒入琼脂已溶化的钢精锅中，继续加温并不断搅拌，使之均匀溶解。

7．将称取好的蔗糖加入，搅拌溶解。

8．加蒸馏水定容至最终体积。

9．用pH试纸或酸度计测pH值，用0.1 N的HCl或0.1 N的NaOH调溶液pH值至5.6~5.8。

10．将已配好的培养液在琼脂没有凝固之前及时分装到培养容器中。分装时掌握好分装量，一般以占培养容器的1/4~1/3为宜。分装时注意不要把培养液黏附在瓶口上，以防引起污染。

11．用棉塞、封口膜或培养瓶盖封口。

12．培养液分装完毕后，应立即灭菌。通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在汽相121℃条件下，灭菌20~25 min。灭菌后取出培养瓶，让培养基自然冷却凝固。最好放置1d后再使用。

经过灭菌的培养基应置于10℃下保存，特别是含有生长调节物质的培养基最好在4℃～5℃低温下保存。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基，要在配制后的1周内用完，其他培养基最多也不应超过1个月。在多数情况下，应在灭菌后2周内用完。

图3-3-1培养基的灭菌

问题2

经过培养基制备的实际操作，我们能否总结出培养基的配制流程？

基本知识

二、培养基的配制流程

图3-3-2培养基的配制流程图

问题3

在配制母液及培养基时应注意哪些问题？

经验总结

三、配制母液和培养基时需要注意的问题

1．使用储备的母液时，应在量取各种母液之前轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰该母液，重新进行配制。

2．用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管冲洗2次。

3．量取母液时，最好将各种母液按量取的顺序写在纸上，量取1种，画掉1种，以免出错。

4．在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替，但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。

5．调pH值时，用滴管吸取0.1 N的NaOH或HCl，逐滴滴入溶化的培养液中，边滴边搅拌，并随时用pH试纸（5.4~7）测试培养液的pH值，一直到培养液的pH值为5.8为止。

6．培养液分装时，先将培养液倒入烧杯中，然后倒入锥形瓶或培养瓶中。注意不要让培养液黏附到瓶口和瓶壁上。培养瓶中培养液的量为锥形瓶容量的1/5～1/4。每升培养液可分装20~30瓶。培养液分装完毕后，应及时封盖瓶口。

【思考题】

1．培养基的成分主要有哪些？

2．用于植物组织培养的植物生长调节物质主要有哪些？它们的主要作用是什么？

3．培养基母液一般有哪几类？如何配制？

4．简述培养基的配制流程。