1981年人们从小鼠囊胚的内细胞团直接获得多能性胚胎干细胞并采用预先为小鼠畸胎瘤细胞研制的培养液进行培养。来源于单个细胞的胚胎干细胞能够分化成为种类广泛的细胞类型，也可以在注射入小鼠后形成畸胎瘤。然而，不像畸胎瘤细胞，这些核型正常的胚胎干细胞在嵌合体中表现出较高的形成多种组织的概率，包括生殖细胞。这为小鼠生殖细胞的修饰提供了实用的方法。

小鼠胚胎干细胞的分离效率受基因背景的影响。例如，研究者们可以容易地从近交系的129/ter-Sv系分离出胚胎干细胞，但是从C57BL/6和其他品系小鼠分离的效率会就降低。种系间的差别在一定程度上与不同品系发展为畸胎瘤的倾向性一致。这一现象提示，基因和(或)表观遗传因素在小鼠胚胎干细胞的分离诱导中扮演了重要角色。另一方面，宫外胚胎移植诱导的畸胎瘤的形成效率似乎与品系也有一定关系。这表明不同品系来源的小鼠的胚胎干细胞的分离效率可能与最适培养环境有关。实际上，研究者们可以用优化的方案分离出那些未经获准的品系。例如，双重抑制促分裂原活化蛋白激酶和GSK3的分裂诱导信号通路能够提高来源于非肥胖型糖尿病小鼠的生殖细胞系感受态细胞的分离效率。胚胎干细胞系通常来源于内细胞团，但这并不意味胚胎干细胞在体外就等同于内细胞团，或者内细胞团是胚胎干细胞的直接前体细胞。有可能在培养中内细胞团发育成为其他细胞，这些细胞成为直接前体细胞。一些实验证明胚胎干细胞更加类似于原始外胚层，这个细胞层来源于原始内胚层分层后的内细胞团。尽管这些实验表明比起内细胞团胚胎干细胞和原始外胚层更为接近，这并不能说明胚胎干细胞与原始外胚层细胞是否更加一致，或者在体外来源于原始外胚层的另一类型细胞。因为在完整的胚胎中多能性细胞没有经历过长期地自我更新，胚胎干细胞就会用于人工组织培养之中。令人惊奇的是，在其被分化分离纯化二十多年后，人们对该细胞的起源依然没有完全研究清楚。自从20世纪80年代该细胞被分离后，其对分子研究技术起到了巨大推动作用，因此重新评估胚胎干细胞的起源对于更好的理解多潜能状态的增殖调控有巨大的价值。

第一个由体外受精的胚胎发育而来的婴儿诞生于1978年，人类ES细胞的来源正是起自于婴儿的降生。虽然80年代曾经有一些研究者试图衍生出人类ES细胞，但是因为物种间的差异，再加上研究者并没有使用最佳的人类胚胎培养基，其进程一直缓慢，直到1998年研究者们才成功分离出人类ES细胞。在可以分离老鼠ES细胞的环境中(在含有饲养层的培养基中添加了白血病抑制因子)，虽然可以成功培养从人类囊胚分离出来的内细胞团，但是不能生产出稳定的未分化细胞系。90年代中，在两个非人类的灵长类动物(猕猴与普通狨猴)中衍生出了ES细胞系。因为具有了在这些ES细胞系上的经验及其人类体外受精培养环境的提高，最终研究者成功地衍生出了人类ES细胞系。这些人类ES细胞具有正常的染色体核型，并且甚至经过长时间不分化的增殖，仍保留有发育成三个胚层晚期细胞的潜力。

目前为止，全世界已经有超过120个人类ES细胞系。大多数都是由分离的内细胞团衍生出来的，也有些是从桑葚胚或晚期囊胚衍生出的。现在还不清楚这些从不同发育期衍生出的ES细胞之间有没有一致性差异或者它们在发育上是否相同。有些人类ES细胞系是从带有疾病相关的基因改变的胚胎中衍生出的，它们可以提供新的体外疾病模型。