组织工程与再生医学
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第二章 发育以及再生的模式控制

第一节 发育的模式控制

一、研究发育模式控制的动物模型———模式动物
模式生物在生命科学研究中有着非常重要的地位,因为以模式动物为基础的研究不仅能回答最基本的生物学问题,也对人类疾病预防和治疗也有借鉴意义。近年来随着分子生物学、发育生物学的发展及功能基因组计划的开展,模式生物的作用便显得越来越重要。
在生物学发展过程中,科学家们发现生命的基础问题可以在最简单和最容易获得的系统中得以回答。由于进化的保守性,许多生命活动的基本方式在地球上的各种生物物种中是相对保守的,以利用位于生物复杂性阶梯较低级位置上的物种来研究发育的共同规律是可能的。这是模式生物研究策略能够成功的重要基础。选择什么样的生物作为模式生物首先依赖于研究者要解决什么科学问题,然后寻找能最有利于解决这个问题的物种。除了在遗传学研究外,模式生物研究策略在发育生物学中获得了非常广泛的应用,一些物种被大家公认为优良的模式生物,如线虫、果蝇、非洲爪蟾、蝾螈、小鼠等。随着人类基因组计划的完成和后基因组研究时代的到来,得到了更多的重视。基因的结构和功能可以在其他合适的生物中去研究,同样人类的生理和病理过程也可以选择合适的生物来模拟。目前在人口与健康领域应用最广的模式生物包括,噬菌体、大肠埃希菌、酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、海胆、果蝇、斑马鱼、爪蟾和小鼠。在植物学研究中比较常用的有拟南芥、水稻等。
模式生物学就是利用模式生物来研究生物学问题的学科。由于生物进化的保守性,从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生物。因此研究人员可以利用一些技术上更容易操作的生物来研究高等生物的生物学问题。严格意义上来说,这不是一门独立的学科,国外也没有专门设置这个学科,而是把它作为一种研究手段和方法而已。模式生物具有许多共同的特征,如形体相对较小,在实验室内易于培养和繁殖,世代周期短,形态结构相对比较简单,繁殖系数高等,而且通常情况下它的基因组会比较小。形体较小和易于培养繁殖是出于实验室空间考虑,而世代周期短是出于研究时间的考虑;形态结构的简单性能够减少特有生命现象的干扰,以便使人们更专注于生物遗传发育的基本规律。除此之外,模式生物有利于回答研究者关注的问题,能够代表生物界的某一大类群。对人体和环境无害,容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖,容易进行实验操作,特别是具有遗传操作的手段和表型分析的方法。
(一)海胆
海胆( Sea urchin),是棘皮动物门下的一个纲,正式学名为“海胆纲”,是一种无脊椎动物,生活在海洋浅水区,是地球上最长寿的海洋生物之一。其分2亚纲,22目,现生种850多种,分隶于225个属。海胆是生物科学史上最早被使用的模式生物,它的卵子和胚胎对早期发育生物学的发展有举足轻重的作用。第一个被用作模式生物的是海胆,它的胚胎对早期发育生物学的发展有举足轻重的作用。1875年,德国生物学家OscerHertiwig( 1849—1922)开始以海胆为材料研究受精过程中细胞核的作用,1890年后,海胆开始在受精和早期胚胎发育的研究中担任重要角色。1891年,Hans Driesh( 1876—1941)在海胆中完成了胚胎分裂实验,为现代发育生物学奠定了第一块理念里程碑。他在显微镜下把刚刚完成第一次分裂的海胆一分为二,结果发现,分开后的两个细胞各自形成了一个完整幼虫。他的实验证明,生物并非一架机械,因为机械不会在拆开之后复原成两个相同的机械。海胆以其易于得到大量受精卵,同步发育,胚体透明,孵化速度快的特点成为了生物学研究的模式生物。由于棘皮动物的胚胎形成方式和脊索动物一样,所以样子虽然看起来原始,但实际上是包括人在内的脊索动物的近亲。因此海胆引起基因组测序人员的重视。而测序的结果分析表明海胆与人类有许多相似基因,但是人类基因数量比较多,脊椎动物在进化过程中至少出现过两次全基因组复制。
(二)果蝇
黑腹果蝇( drosophila)属于昆虫纲的双翅目。果蝇体形小,体长不到半厘米;饲养管理容易,既可喂以腐烂的水果,又可配培养基饲料;一个牛奶瓶里可以养上成百只。果蝇繁殖系数高,孵化快,只要1天时间其卵即可孵化成幼虫,2~3天后变成蛹,再过5天就羽化为成虫。从卵到成虫只要10天左右,一年就可以繁殖30代。果蝇的染色体数目少,仅3对常染色体和1对性染色体,便于分析。生命周期快、繁殖容易、具有可进行基因定位研究的巨大多线染色体等特性使果蝇最适合用于遗传分析。作遗传分析时,研究者只需用放大镜或显微镜一个个地观察、计数即可。果蝇与人类在身体发育、神经退化、肿瘤形成等的调控机制,都有非常多相通处,许多人类的基因在果蝇身上也有,甚至功能可以互通。
20世纪初摩尔根选择黑腹果蝇作为研究对象,建立了遗传的染色体理论,奠定了经典遗传学的基础并开创利用果蝇作为模式生物的先河。20世纪80年代以后针对果蝇的基因组操作取得重大进展,并发展出一系列的有效技术。2000年,果蝇的全基因组测序基本完成,全基因组约165Mb。在20世纪生命科学发展过程中,果蝇扮演了十分重要的角色,是十分活跃的模型生物。遗传学的研究、发育的基因调控的研究、各类神经疾病的研究、帕金森病、老年痴呆症、药物成瘾和酒精中毒、衰老与长寿、学习记忆与某些认知行为的研究等都涉及到果蝇。科学家不仅用果蝇证实了孟德尔定律,而且发现了果蝇白眼突变的性连锁遗传,提出了基因在染色体上直线排列以及连锁交换定律。摩尔根1993年因此被授予诺贝尔奖。1946年,摩尔根的学生米勒,证明X射线能使果蝇的突变率提高150倍,因而成为诺贝尔奖获得者。同时,在近代发育生物学研究领域中,果蝇的研究尤为重要。1995年,诺贝尔奖再次授予三位在果蝇研究中获得突出成就的科学家。果蝇为进一步阐明基因、神经、行为之间关系的研究提供了理想的动物模型。专家认为,近一个世纪以来,果蝇遗传学在各个层次的研究中积累了十分丰富的资料。人们对它的遗传背景有着比其他生物更全面更深入的了解。作为经典的模式生物,果蝇在21世纪的遗传学研究中将发挥更加巨大而不可替代的作用。
(三)斑马鱼
斑马鱼( Zebra fish)以其身体上与斑马身上相似的条纹而得名。斑马鱼为一种热带硬骨鱼,属鲤科短担尼鱼属,原产于南亚,是一种常见的热带鱼。斑马鱼体形小、生存能力强、物种稳定。成鱼个体长3~4cm,雄鱼个体修长,雌鱼个体肥大,便于饲养和性别识别。体外受精,体外发育,斑马鱼胚胎透明,易于观察。斑马鱼是研究脊椎动物器官发育和人类疾病的重要遗传学模型之一。20世纪60年代美国Oregon大学遗传学家George Streisinger注意到斑马鱼的优点,开始研究其养殖方法、胚胎发育等,发展了一些相关的遗传学技术,并在Nature上发表了关于斑马鱼体外受精、单倍体诱导技术相关的论文。到20世纪90年代初,德国发育生物学家Christine Nusslein Volhard以及美国哈佛大学的Wolfgang Driever博士的研究组同时开始对斑马鱼进行大规模化学诱变研究,到1996年共鉴定出约4000种突变体。斑马鱼是迄今适合饱和诱变的唯一的脊椎动物。
斑马鱼的主要优势在于易于繁殖,产卵量高发育快,许多组织在受精后24小时后开始形成;成熟周期短,体外受精且胚胎透明,可在体视解剖镜下观察。它的神经中枢系统、内脏器官、血液以及视觉系统,在分子水平上大体与人相同,尤其是心血管系统,早期发育与人类极为相似,在胚胎发育过程中可以全程观察和研究其心脏发育及血液流动状态。借助显微镜,可看到每个心肌细胞和血液细胞。目前,经过30多年的研究应用和系统发展,已形成约20个斑马鱼品系,斑马鱼基因数据库里有相关的资料可供查询和下载,方便了科学研究。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟,且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体,是研究胚胎发育分子机制的优良资源,有的还可作为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一,在其他学科上的利用也显示很大的潜力。
(四)秀丽线虫
秀丽隐杆线虫( Caenorhabditiselegans)是一种类似于蛔虫的微型低等动物,绝大多数雌雄同体,个别为雄性。它与人蛔虫、蛲虫等营寄生生活的线虫不同,线虫是营自由生活,以大肠埃希菌为食,易在实验室培养。秀丽线虫的体细胞数量少,只有不足2000个,染色体也只有6对,这使得科学家可以尝试追踪每一个细胞。秀丽线虫成虫长约1mm,身体为半透明,研究时不需染色,即可在显微镜下看到线虫体内的器官如肠道、生殖腺等;若使用高倍相位差显微镜,还可清晰的观察单一细胞。此外它的细胞数目以及细胞命运图谱几乎固定,并且易于追踪。又因为线虫仅有一千多个体细胞,所以它的所有细胞都可以细致地观察研究。因此,线虫是研究细胞分裂、分化、死亡等的好材料。在自然状态下,秀丽线虫绝大部分个体为雌雄同体,其一生能产生约300个受精卵。如果在一个培养皿上放上几只线虫,几天之后就可得到大量的后代。秀丽线虫可以像动物培养细胞一样储存在-80℃冰箱或液氮中,这就为大量保存各种遗传背景的秀丽线虫株系提供了极大的便利。这一优势也是其他模式动物,如果蝇和小鼠等所不具备的。
基于秀丽线虫的基础研究在当今的生命科学研究中起着举足轻重的作用,20世纪60年代,Brenner在确立了分子遗传学的中心法则以后,为探索个体及神经发育的遗传机制,而最终选择了秀丽线虫这一比果蝇更简单的生物。他于1974年在Genetics上发表文章,详细描述了秀丽线虫的突变体筛选、基因定位等遗传操作方法,为秀丽线虫作为模式生物进行个体发育的遗传研究奠定了基础。自Brenner开始,四十多年来,以秀丽线虫为模式生物的研究几乎涉及生命科学的各个领域并取得了重大突破,如MAPK信号传导、细胞程序性死亡、TGF-β信号传递途径、RNA干扰( RNA interference,RNAi)和microRNA等。2002年诺贝尔生理医学奖颁发给了两位科学家,以表彰他们通过对秀丽线虫的研究,揭示了细胞的程序性死亡机制和器官发育遗传学方面的贡献。其中,Sulston利用微分干涉显微镜观察研究了秀丽线虫细胞的命运,绘制了世界上第一幅细胞谱系图,发现了细胞的程序性死亡现象。
(五)模式生物对于发育生物学的意义
目前,生命科学基础研究主要是以模式生物为对象。近年来,这些模式生物的基因组测序相继完成,在这些基因组信息的基础上,以这些模式生物为研究对象的重大科学发现层出不穷。模式生物的研究是人类基因组计划的一个重要组成部分,是人类基因组计划的必要的补充,这对人类基因组计划的研究有很大的促进作用。由于人类对其自身理解的限制、实验的限制和伦理学的制约,医学、生物学的研究在很大程度上依赖于对一些模式生物的研究,在研究人类基因组的同时,平行地进行一些如微生物、植物、动物等模式生物的研究,可为人类基因组的研究作方法学和组织工作方面的准备。将从模式生物中得到的数据和资料与人类基因组比较,通过不同生物基因序列的同源性来阐明人类相应基因的功能;通过研究小而简单的模式生物的基因组,积累实验发展模式,同时对于模式生物的研究亦具有经济价值。一些与人类基因有相似性、但结构和基因组成却相对比较简单的生物体就成为进行人类基因组研究的好样本。随着越来越多的研究者的加入,也随着发育生物学的飞速发展,以及越来越多物种的基因组被测序,很多生物都有可能成为很好的模式生物。经典模式生物的数据库不断的完善将会加快对发育生物学的研究进展。有关模式生物的研究必将继续为人类探索生命规律的调控机制作出更大贡献。
二、发育模式控制的分子调控机制
生物体在整个生命周期都处于动态的发育过程中。多细胞有机体的生命过程是一个相对缓慢和逐渐变化的过程,这个过程被称为个体发育。传统的胚胎生物学是研究生物从受精卵到出生之间的发育,即胚胎发育。但生物体的发育过程在出生后并没有完全停止,如各种干细胞的正常更新过程以及肿瘤和畸形。因此,发育生物学研究的范围不仅限于胚胎发育,也包括成体的发育以及整个生命过程中生命现象的发展。发育具有严格的时间和空间的次序性,这种次序性由发育的遗传程序控制,发育是有机体的各个细胞协同作用的结果,也是一系列基因网络调控的结果。DNA上的遗传信息是如何控制生物体形态结构构建和生命现象的发展是科学家们一直研究的重要领域和课题。一个有机体的发生,从简单到复杂,从单细胞到功能多样的多细胞。里面隐含着极其精妙的发育调控机制。发育是物种遗传特性的表达,是遗传信息按照特定的时间和空间表达的结果,是生物体基因型与内外环境因子相互作用,并逐渐转化为表型的过程,它产生了生命机体内的细胞多样性和时序性,同时又保证了生命代代相传的连续性。高等生物个体是由多细胞组成的极其复杂、精巧而又协调的生命结构。例如脊椎动物有几百种形态结构和生理功能不相同的细胞。这些具有不同功能的细胞与不同的微环境及细胞外基质组成具有不同功能的组织继而形成器官。不同的器官最终形成关联协调的复杂系统。所有这些不同的组织、器官和系统都来源于一个细胞———受精卵,通过受精卵的分裂、增殖、分化和各种形态发生运动产生和演变而来。所有的进程也都是按照设定好的程序进行。动物的形体和结构模式以遗传密码的形式存在于受精卵的基因组中,胚胎发育就是按照严格时间空间秩序将这些遗传密码转换为实际的形态、结构和功能,即使基因型转换为表型。
(一)细胞分化与基因的选择性表达
细胞分化的概念是,多细胞生物由受精卵开始发育,经过反复的有丝分裂,同时这些多细胞各自向不同的方向发育,循一定的变化规律进行增殖、分化、凋亡和生长,并构成机体的各种组织和器官。它们各自在发育过程中在形态、结构和生理功能上都产生了差异,这一过程被称为细胞分化( cell differentiation)。在细胞分化的基础上,胚胎逐渐产生出许多不同的组织、器官和系统,协调地组成一个复杂、精巧、能自主生活的生命个体。因此、细胞分化是胚胎不同组织、器官和系统等结构形态发生的基础。细胞的形态结构、生理功能和生化特征都是由基因表达控制的。在发育过程中,所有的细胞都接受了完整的、而且是同样的基因组。细胞核移植实验表明:两栖类、鱼类、哺乳等的体细胞核移植到相应物种的去核卵中,都得到了发育正常,有自主生活能力的个体。因此,已经分化的成体细胞仍然具有个体发育所需要的所有遗传信息。同时也证明了细胞分化并非是遗传物质的不可逆性改变。
(二)形体模式的形成及基因控制
脊椎动物的胚胎形体模式是通过细胞之间的相互作用而逐渐形成的,例如得到广泛研究的间充质与上皮之间的相互作用。胚胎细胞中这种细胞间的相互作用称为胚胎诱导( embryonic induction)。胚胎诱导现象是比利时实验胚胎学家Spemann发现的。胚胎诱导现象最先发现于蝾螈的胚胎发育中。随后,在无尾两栖类、鸟类、鱼类文昌鱼以及无脊椎动物等的胚胎发生过程中都发现了类似的现象。因此,胚胎诱导现象广泛存在于动物发育过程中。该现象的发生同时也说明,发育过程中,组织、器官以及系统的发育并非是能独立发生的事件,而是需要不断地与邻近细胞或组织相互作用和相互影响下发生的。这些细胞或组织之间相互作用是通过细胞间相互接触、生长因子分泌以及多种细胞外来体的分泌来实现的。
(三)编程性细胞死亡
编程性细胞死亡( programmed cell death)或细胞凋亡( apoptosis)是指多细胞生物体的一些细胞当不再为生物体所需或是已受到损伤时,会激活受遗传控制的自杀机构而自我毁灭,出现所谓的细胞编程性死亡。细胞编程性死亡通常采取细胞凋亡的形式。细胞编程性死亡也是一种细胞的利他性死亡( altruistic cell death)。局部的、个别的死亡有利于整体的或种群的存活。编程性细胞死亡在发育过程中组织形态发生中起着重要的作用。在肢体发育过程中,编程性细胞死亡使指(趾)间的组织的消失从而使指(趾)相互分离。在神经系统发育过程中,多数潜在成神经死亡,只有正确连接的神经元才能生存。编程性细胞死亡清除掉不再需要的结构(如蛙类蝌蚪的尾巴,雄性哺乳动物的乳腺组织),控制特定组织的细胞数目(如脊椎动物的神经元),形成复杂的器官(神经视网膜、如腭、手指和脚趾以及心脏等的形状和结构等)。因此,编程性细胞死亡是发育过程得以正常进行的重要条件。