虽然在细胞基础上筛选出小分子进行新药开发和细胞生物学的研究已有数十年，但这些小分子在干细胞研究领域中的重要价值才刚被认识。化学遗传学的手段是可控的和可逆的———可以随时加入或除去小分子化合物，从而启动或中断特定的反应。大多数小分子化合物对蛋白质的作用非常快，从而可以进行实时检测。此外，通过控制化合物的浓度，可以对其作用的靶分子的动力学过程进行分析。而且一个同样的小分子化合物，可以被广泛地用于影响各种不同生物体的某一种过程或功能。但如何解释这些小分子的特殊作用机制，在体外能有效诱导细胞分化的小分子是否在体内有同样功效，被这些小分子处理后的细胞与正常细胞相比，功能会不会发生改变，不同类型的干细胞对小分子化合物剂量的敏感度如何等问题仍是生物学家面临的挑战。毫无疑问，越来越多的决定干细胞命运的小分子的识别和筛选将明显促进干细胞生物学的发展和再生性药物的研制。

干细胞的定向分化是生物体发育、生长和修复的基础，是由细胞内外因素共同控制、调节特定基因的表达来实现的。这些因素包括生物物理学的相互作用如细胞和细胞间的相互作用:细胞基质信号相关分子如生长因子、激素类和细胞因子以及小分子(如营养素、代谢产物、天然产物和合成的药理学因子)。研究显示，特定转录因子的表达水平可能是维持干细胞特性的关键因素，生长因子及膜蛋白介导的细胞间相互作用在外源性调控干细胞定向分化方面起着重要作用。小分子化合物由于其显著的优势越来越多地被应用于体外诱导干细胞定向分化和疾病的治疗。

胚胎干细胞( ES细胞)具有能发育为不同类型细胞的潜力，在体外适宜条件下，能在未分化状态下无限增殖，为ES细胞的研究和应用提供了细胞来源。用视黄酸处理的鼠胚胎干细胞会分化为神经祖细胞，再经过Shh的特异性小分子拮抗剂Hh-Ag1. 3处理，则定向分化为运动神经元。Hori等证实PI3-K抑制剂LY294002能促使体外培养的胚胎干细胞分化为分泌胰岛素的β细胞，并进一步阐明分化得到的细胞确能提高体内胰岛素水平，阻止体重减轻，控制血糖浓度。Takahashi等发现抗坏血酸能有效地加强胚胎干细胞向心肌细胞分化。Wu等最近用组合化学组合的方法合成并筛选到能有效诱导鼠胚胎干细胞分化成心肌细胞的大量小分子化学文库，得到一系列具有这种定向诱导作用的双氨嘧啶化合物。Hironori等还采用微阵列技术检测胚胎干细胞的分化情况。胚胎干细胞向肾脏细胞系分化的技术一直相对滞后。最新研究实现在未添加外源性细胞因子，并不经拟胚体的条件下，将鼠胚胎干细胞分化成肾祖细胞库、间介中胚层( intermediate mesoderm IM:与泌尿系统和生殖系统有关)细胞。通过联合运用3种小分子: Janus相关酪氨酸蛋白激酶抑制剂、PI3K信号通路抑制剂LY294002和RhoA转录信号抑制剂CCG1423，首先使鼠胚胎干细胞分化成表达BMP7的阳性细胞( BMP7是预测的IM的诱导因子)，加入维A酸继续培养时，可以提高IM分化过程中必需的因子( Osrl)的表达。首次实现了不经拟胚体，并未添加外源性细胞因子的条件下，使鼠胚胎干细胞选择性分化成IM，与之前的报道相比大大提高了IM的诱导效率。当然，由于存在免疫相容性问题，对胚胎干细胞移植的安全性还须作全面、客观、深入的评价。

神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞，通过小分子诱导的方法可以获得相应表型的神经元，从而促进损伤中枢神经系统的修复。Ding等对10 000个经验证具有生物活性的小分子进行高通量筛选，得到一个具有诱导鼠畸胎瘤细胞和胚胎干细胞定向分化为神经元的小分子，命名为TWS119。进一步研究发现，TWS119可以与糖原合成激酶-3β( GSK-3β)结合。通过亲和技术和生物化学方法的验证，GSK-3β被鉴定为TWS119作用的一个靶点。Wnt信号通路是参与胚胎及器官发育的主要四大类信号传导途径之一，GSK-3β和β-连环蛋白(β-Catenin)在通路中起着激活与关闭的作用。Woodbury等用β-巯基乙醇、二甲基亚砜和丁羟基茴香醚等物质成功诱导骨髓间充质干细胞( MSCs)转变为神经元，并表达了神经元特有的标记物神经元特异性烯醇化酶和神经丝蛋白。Deng等联合应用异丁甲基嘌呤和二丁基环磷酸腺苷提高胞内环磷酸腺苷( cAMP)的含量，亦将MSCs转变为神经元样细胞。以苯并吡嗪为母环合成的小分子化合物也可以诱导间充质干细胞向神经元细胞分化。实验证实，经该类化合物诱导后，超过95%的骨髓间充质干细胞可以转化成神经元样细胞。聚合酶链式反应( PCR)结果显示，由于该化合物的作用使得神经肽、胆碱能受体和Fbxo2(神经元细胞的标记物1的水平显著上调。此外，经化合物处理的间充质干细胞表现出神经元电生理特性和胆碱能神经元特性。林绿标等研究发现，一氧化氮( NO)能促进神经干细胞的分化，并能促进细胞分化后轴突的发育。尹时华等研究发现，水杨酸钠有促进神经干细胞向谷氨酸( Glu)能神经元分化，同时抑制神经干细胞向γ-氨基丁酸( GABA)能神经元分化的作用。维A酸在体内对外胚层分化起着关键作用，人们曾利用维A酸在体外诱导胚胎干细胞分化成神经元细胞。

心脏病后修复是再生医学的重要课题和难题。干细胞具有分化成新的心肌细胞和新生血管的潜能，可再生性修复和代替变性坏死的心肌，提高和重新整合心肌收缩力，修复受损和狭窄的冠状动脉，增加和改善心肌的供血和供氧。Takahashi等通过报告基因法，利用心肌特异性基因心肌α-肌球蛋白重链(α-MHC)的启动子转染小鼠胚胎干细胞，通过单层培养的方法对800多种化合物进行了筛选，荧光分析显示维生素C可以显著诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。同理。Wu等用组合化学的方法合成了大量的小分子化合物并对其进行了筛选，得到一系列可以定向诱导鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的双氨嘧啶类化合物。分化得到的心肌细胞表达了多种特定标记物，如肌球蛋白重链、锌指转录因子GATA-4、肌细胞强化因子-2( MEF2)和转录因子NKX2. 5等。Graichen等通过筛选得到小分子化合物SB203580，可诱导悬浮培养的人胚胎干细胞分化为心肌细胞，转化效率相比对照组提高了2. 5倍。经鉴定SB203580为丝裂原活化蛋白激酶p38( P38MAP)的一种有效抑制剂，有助于早期中胚层的形成且分化效率与其浓度密切相关。

可诱导间充质干细胞成骨分化的小分子化合物，许多小分子可以用来调控间充质干细胞的分化，在特定条件下，地塞米松、5-氮杂胞苷、8-甘油磷酸钠、维生素C和过氧化物都可诱导骨髓间充质干细胞( MSCs)向骨和脂肪细胞的分化。Wu等利用C3H10T1/2细胞(小鼠间充质祖细胞系)通过高通量筛选的方法发现2，6，9-三取代嘌呤化合物purmorphamine，经鉴定能有效诱导间充质干细胞( MSCs)分化为成骨细胞。鉴于purmorphamine可以使原始成体神经干细胞增生，并且与RA联合应用可以诱导鼠胚胎干细胞向运动神经元的分化，推测其可能机制为Hh信号通路的选择性激动剂。

1型糖尿病是胰岛细胞被机体自身的免疫系统破坏，无法产生功能胰岛索，在体内胰岛素绝对缺乏的情况下引起血糖水平持续升高而出现尿糖的一类糖尿病。胚胎干细胞自主分化为胰岛素分泌细胞的比例很小，但在某些诱导分化因子的作用下胚胎干细胞可以向胰岛素分泌细胞分化。从胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中的关键一步就是胰腺祖细胞的形成。胰腺祖细胞可以表达Pdxl并能产生所有类型的胰腺细胞，Pdxl是调节胰腺发育和成熟β细胞功能的主要转录因子，Pdxl阳性细胞在体内外可进一步分化成更加成熟的β细胞。Indolactam V是经高通量筛选的方法鉴定出的一个可以诱导人胚胎干细胞分化成Pdx1细胞、内胚层细胞分化成胰腺祖细胞的小分子。烟酰胺也叫维生素PP，是维生素B的一种形式，通过其主要的代谢产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD)起作用。NAD在生物体中广泛存在，能量的产生、营养素的代谢、信号转导以及维持基因组的完整性等都与其密切相关。其抗糖尿病发生作用已经被人们所了解，研究发现烟酰胺具有诱导分化潜能，Lumelsky等曾报道，烟酰胺可以将小鼠Es细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。诱导后的细胞不仅表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等蛋白质，而且可以分泌胰岛素。Hori等证实磷脂酰肌醇3-激酶( PI3K)抑制剂LY294002能促使体外培养的胚胎干细胞分化为分泌胰岛素的β细胞，且分化得到的β细胞确能提高体内胰岛素水平。

作为细胞重编程研究的里程碑，2006年，Yamanaka小组将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等4个转录因子导入小鼠胚胎成纤维细胞( mouse embryonic fibroblasts，MEFs中，成功获得与小鼠胚胎干细胞( embryonic stem cells，ESC)在表型、生长特性、基因表达和分化潜能等方面高度相似的小鼠诱导多能干细胞( induced pluripotent stem cell，iPS-cell)，从此，iPS细胞的研究日趋火热。美国Thomson小组报道了通过转染Oct-4、Sox2、Nanog及Lin284个基因可将人的成纤维细胞重编程为iPS细胞。iPS细胞在其形态学、增殖特性、干细胞标志物的表达、表观遗传修饰都与ESC无显著差别，研究表明:鼠iPS细胞能有效分化为造血和神经祖细胞，并能在体内和体外分化为血液及神经系统的各种细胞。亦有研究证明，人体iPS细胞和小鼠iPS细胞均可分化为心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞;同时，iPS细胞孕育而成的活体小鼠，有力地证明了iPS细胞具有真正的“全能性”。由此可见: iPS细胞具有与ESC一样的优点和分化特性，同时可以避免ESC的免疫原性、伦理限制等缺陷。但目前为止，iPS细胞的研究才刚刚起步，一些重要的科学问题与关键技术问题还没有完全解决，iPS细胞走向临床应用为时尚早。

继Yamanaka小组用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等4种转录因子组合先后将小鼠和人的成纤维细胞在体外诱导为iPS细胞后，各国研究者又运用相似的方法和不同因子的组合证实了该方法的可行性;与此同时，发现被逆转的细胞并不局限于某一细胞类型及细胞的某一分化阶段，其可以来源于3个胚层中任一胚层的细胞，且既可以来源于胚胎细胞也可以来源于新生儿、成人甚至是终末分化的如皮肤、脂肪等成熟细胞，只是不同胚层来源的细胞或不同发育阶段的细胞重编程为iPS细胞的难易不同、效率不同、所需因子组合不同或形成克隆所需诱导时间不同而已。以往研究证实:成体细胞通过去分化重编程为iPS细胞是一个缓慢的过程，需要2～4周的时间，且需要至少3个外源基因同时参与，当细胞完成重编程后，导入细胞的外源基因在细胞中的表达逐渐沉默，转而内源基因表达逐渐上升。一般外源基因需要10～16天的表达，而内源基因在约12天时被激活，其继续调控细胞生理特征从而最终使成体细胞发育成为iPS细胞。若外源基因的表达迟迟不减弱，则会导致已完成重编程的早期iPS细胞在其引导下重新分化为其他细胞或在重编程后的初始阶段停滞不前。

iPS细胞诱导体系中，转录因子的组合不是一成不变的，体细胞重编程为iPS细胞所需转录因子的种类和数量需根据体细胞种类及其自身固有转录因子表达水平或额外加入的小分子化合物加以灵活选择。通常，Oct4、Sox2、Klf4组合即可将体细胞重编程为iPS细胞，只是后一种组合重编程的效率较前一种低许多。各种转录因子中，Oct4一直被认为是重编程过程中不可缺少的转录因子，其可通过与某些外部信号协同作用共同维持胚胎干细胞的全能型，同时也在重编程起始过程中起到重要调控作用。而Klf4与c-Myc则被研究者们认为具有癌基因活性，研究发现Klf4和c-Myc可能使成熟细胞产生肿瘤样转变，因此赋予MEFs无限增殖以及ESC样的快速生长能力，同时c-Myc可对MEFs的染色质进行修饰，致使重编程因子更容易与重编程中所需的基因结合。Shi等对转录因子各家族成员之间的关系和作用进行研究后发现:除Oct4外，Sox2、Klf4和c-Myc在细胞重编程过程中的调控作用可被各自同一蛋白家族的其他成员所替代，因此可以推断Sox2、Klf4和c-Myc也许并非是重编程过程中所必需的因子。Thomson实验室通过Oct4、Sox2、Nanog和Lin28 4个转录因子也同样获得了人的iPS细胞，可见在此过程中Nanog可完全代替Klf4和c-Myc的重编程作用。

早期，从鼠或人组织中分离的成纤维细胞重编程成为iPS的效率一般仅有0. 007%～0. 039%，属于随机发生事件，而该事件的发生依赖于细胞中Oct4等干性转录因子随机发生的“渗漏表达”与随机性发生的表观遗传学变化。MacArthur等通过计算机模拟分析，认为有Oct4等活陛因子“转录噪音”出现的体细胞才可能被诱导重编程为iPS细胞。低效率成为进行大规模iPS细胞分子机制研究的主要障碍，一直以来，各国研究小组都迫切希望通过一些途径提高iPS细胞诱导体系的效率。

总结以往经验，各国研究人员探索了以下几种途径:首先，增加转录因子使用个数，可大幅度提高重编程效率，通过导入Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc和Klf4 6个重编程因子共转染成纤维细胞可将重编程效率提高约10倍，其可能与Nanog和Lin28基因的加入增加了同时感染重编程必需基因的细胞比例有关;神经干细胞或其前体细胞自身高表达Sox2、c-Myc和Klf4，故利用Oct4和Klf4 2种基因，甚至只用Oct4一种基因，即可将神经干细胞或前体细胞转化成iPS细胞。其次，适当选用小分子化合物，亦可大幅度提高重编程效率和(或)减少转录因子使用个数。BIX和Bay是2种小分子化合物，当其与Oct4和Klf4两种转录因子组合使用时，可高效率将小鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞，这时BIX和Bay可以弥补外源Sox2的缺失，这是由于小鼠成纤维细胞重编程为iPS细胞至少需要Oct4、Sox2和Klf4 3种因子;小鼠成熟B细胞需要导入Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和C/EBPot 5种转录因子才能转化成iPS细胞，而当在培养液中加入小分子化合物5-AZA，此时仅用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等4种因子即可将成熟B细胞诱导为iPS细胞。中科院广州生物医药与健康研究院裴端卿研究小组在诱导小鼠及人iPS细胞过程中添加维生素c，使iPS诱导效率提高10倍，其可能与维生素C促进相关基因表达、推动体细胞进入重编程状态有关。第三，调控重编程相关基因的外源表达或内源表达亦可提高诱导效率，盐酸多西环素通过调节外源基因在宿主中表达或沉默的时机，从而促进成体细胞重编程，目前已经被广泛应用到iPS细胞诱导系统中，使外源基因的表达与沉默被人为所调控和优化成为可能; Hochedlinger等建立二次诱导模式，并采用盐酸多西环素调控诱导外源基因的开关时机，成功将人成纤维细胞来源iPS细胞的诱导效率提高到2%～3%; Belmonte等用反转录病毒转染人角质细胞，获得了1%的诱导效率，比成纤维细胞诱导效率高100倍，同时诱导时间也缩短了1倍; Hochedlinger等用慢病毒载体在人角质细胞中表达 Oct4、 Sox2、 c-Myc和 Klf4 4个基因，虽然诱导效率仅约0. 002%，但能在慢病毒载体仅10天后成功获得iPS细胞，与Belmonte的报道相符。第四，通过阻断相关基因路径可以提高诱导成功率。2009年8月，包括日本科学家Yamanaka在内的不同国家的5个科研小组同时报告了通过阻断“p53”基因路径可以将皮肤细胞转化为iPS细胞的成功率提高约100倍，但由于“p53”具有抑制细胞癌变、阻止肿瘤生长的作用，故在通过阻断“p53路径”提高iPS细胞诱导效率时，也同时要注意潜在风险; Yamanaka等还发现:当诱导环境的氧浓度从通常的21%降到5%时，iPS细胞的生成效率可提高到原来的2. 5～4. 2倍，但若将氧浓度进一步降低到1%，此时会导致部分细胞死亡。

iPS细胞未来的发展方向是安全、高效及有临床应用价值的治疗型干细胞，找到一种安全生产iPS细胞的方法与研究干细胞具有同等重要的生物学意义。其中最理想、最实用的方法是运用非转基因方法得到iPS细胞，研究发现小分子化合物的应用有望能够代替外源基因导入实现体细胞重编程而获得iPS细胞，之前所阐述的内容已经充分说明小分子化合物在促进细胞重编程及减少转录因子使用种类方面起重要作用。