2001年的WHO淋巴瘤分类标志着淋巴瘤的病理诊断进入了“综合时代”，即将临床特征、组织形态学、免疫表型、分子遗传学特征进行综合评价来作出淋巴瘤病理学诊断和分类的时代。目前认为，淋巴瘤的每一种亚型都是一个独立的疾病，都有着自己独特的临床表现、形态学特征、免疫表型及分子遗传学特点。

淋巴瘤不同的亚型有着不同的预后，需要不同的治疗，即使是相同亚型的肿瘤由于携带不同的分子遗传学异常对治疗的反应也可能不同。因此，淋巴瘤正确的诊断与分型是治疗的关键。虽然多数造血与淋巴系统肿瘤综合临床特征、组织形态学、免疫表型特征可得到正确诊断，但很多情况下，分子遗传学的检测可以提供更多普通病理学检查所不能提供的信息，从而有助于肿瘤的诊断、预后判定、治疗指导、微小残余病变的监测。把分子遗传学的检测（染色体/基因异常）纳入淋巴瘤的分类或视之为部分病理亚型分型的重要依据，说明了其地位的重要性。

分子遗传学在很大程度上已经揭示了免疫系统的正常发生和起源于免疫系统的肿瘤的发病机制。应用分子生物学的基本方法，以常规的病理标本为材料，通过检测分子遗传学异常，可以对绝大多数淋巴瘤作出精确诊断。分子遗传学异常作为一个独特的肿瘤分子标记可用于淋巴瘤的分类、预后判定、治疗指导、微小残余病变监测。而且，分子遗传学的异常改变要远远早于其他常规方法可检测到的异常。本章我们将介绍分子遗传学的基本知识及如何应用分子生物学的基本方法检测淋巴瘤的分子遗传学异常。

淋巴瘤是一个淋巴细胞（单）克隆性（clonal）增殖性疾病。在绝大多数淋巴瘤中，基因组DNA重排往往发生于克隆性增殖之前，因而一个淋巴瘤通常由遗传学特征完全一致的一个前体细胞的子代细胞组成，即淋巴瘤为（单）克隆性起源。在每一个子代细胞中至少含有一个完全相同的遗传标记物。正常细胞中不存在而肿瘤细胞中存在的独特的DNA重排（rearrangement）可以作为一个独特的肿瘤标记物，用来区分肿瘤细胞和正常细胞。

DNA或基因重排（gene rearrangement）可以是生理性的，也可以是病理性的。前者如B细胞抗原受体基因免疫球蛋白（immunoglobulin，IG）基因和T细胞抗原受体基因（T cell receptor，TCR）的重排，后者则是由于染色体异常，如染色体易位而导致的基因重排。

免疫球蛋白和T细胞受体基因重排发生在几乎所有相应的B和T淋巴细胞上，故为生理性重排。虽然该重排事件本身与肿瘤转化无关，却可用于克隆性分析，以帮助区别良性淋巴组织增生和淋巴瘤。

淋巴细胞有别于其他造血细胞的特点之一是存在抗原受体基因的重排，即IG和TCR基因的重排。每个淋巴细胞都具有特定的基因重排方式，因而形成独特的IG和TCR基因序列，产生独特的IG和TCR蛋白分子，即抗原受体，以应对内外环境中多种多样的抗原而进行免疫反应。后天获得性适应性免疫系统的首要效应分子就是抗原受体，IG和TCR基因的功能和结构独特且非常复杂。

Ig分子由B淋巴细胞产生，各种Ig分子均具有相似的由四条多肽链构成的Y字形结构，即由两条相同的重链（immunoglobulin heavy chain，IgH）和两条相同的轻链（immunoglobulin light chain，IgL）构成。根据免疫原性的差异，IgH有五种亚单位，即α、δ、ε、λ和μ链，它们决定了Ig或抗体的类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM；IgL有κ链（Igκ）和λ链（Igλ）两种，通常一个Ig分子只能具有两种IgL中的一种，即或为κ链或为λ链。

不同的Ig分子中，IgH和IgL的N端部分的氨基酸序列变化较大，因而称之为可变区（variable region，V区）；其余部分氨基酸序列相对恒定，故称之为恒定区（constant region，C区）。V区氨基酸序列的差异性主要体现在3个氨基酸多变的超变区（hypervariable region，HV），即互补决定区（complementarity determining region，CDR）。CDR才是真正的抗原结合位点。在V区内相对保守的氨基酸序列不与抗原结合，称之为骨架区（framework region，FR）。

TCR分子是T细胞特有的表面标志。TCR具有四个亚单位，即α、β、γ和δ四种肽链。每条肽链也由可变区（V区）和恒定区（C区）组成。TCR的V区氨基酸的主要差异性体现在3个CDR和第四个高变（hypervariable，HV4）区。3个CDR 和HV4区共同决定TCR的特异性抗原识别。

根据其异源二聚体组成的不同，TCR可分为αβ型和γδ型两种，大多数T细胞上的抗原受体为αβ型TCR（95%），仅少部分为γδ型TCR（5%）。

人类IG中的IGH、IGκ和IGλ基因分别定位于染色体14q32 （1Mb）、2p12（1.8Mb）和22q11（0.8-3Mb）上。各基因在除B细胞以外的体细胞及淋巴细胞的最初始阶段是不连续的，它们分别由分散在不同位置上的基因片段（segment）组成（胚系结构）。在淋巴细胞分化早期，各个分隔的片段组合在一起才可形成一个连续的完整基因。这种基因片段重新组合的过程即所谓基因重排（gene rearrangement）。

IGH基因的胚系结构由V（variable，V _H）、D（diversity，D _H）、J（joining，J _H）和C （constant，C _H）四个不连续的区域（region）构成，每个区域又由多个片段（segment）组成。目前已发现人V _H区有66个片段（分为7个家族V _H1～V _H7）；D _H区有27个片段（分为7个家族D _H1～D _H7）；J _H区有6个片段J _H1～J _H6；C _H区有11个片段。一个IGH基因即是由V _H-D _H-J _H-C _H四个片段相连而成（图2-1）。

IGκ和IGλ基因的胚系结构不含D区。IGκ基因由V _κ-J _κ-C _κ构成，V _κ区有76个片段（分为7个家族V _κ1～V _κ7）；J _κ区有5个片段J _κ1～J _κ5；C _κ区只有1个。IGλ基因由V _λ-J _λ-C _λ构成，V _λ区有38个片段（分为10个家族V _λ1～V _λ10）；J _λ区和C _λ区各有7个基因片段，其分布与IGH和IGκ不同，J _λ和C _λ成对排列（图2-1）。

整条链的基因由不同的V、D、J和C基因簇经随机重排后重组而形成。其中IGH的V区由VDJ重组组成，IGκ及IGλ的V区则仅由V和J基因片段组合而成。

编码人TCR的α/δ链、β链和γ链的基因位点分别定位于染色体14q11（1Mb）、7q34（700kb）和7p15（150kb），编码TCR的δ链的基因位于编码TCR的α链的基因之中。与编码Ig各链的基因结构相似，α链和γ链是由V、J、C基因片段编码的肽链，V、J基因编码可变区，C基因编码恒定区。β链和δ链是由V、D、J、C基因片段编码的肽链，V、D、J基因编码可变区，C基因编码恒定区。

TCRα的V _α区有54个片段（分为32个家族V _α1～V _α32），J _α区有61个片段，C _α只有1个片段；TCRβ的V _β区有67个片段（分为30个家族V _β1～V _β30），J区有13个片段，D区和C区各有2个片段；TCRγ的V _γ区有9个片段（分为4个家族V _γ1～V _γ4），J区有5个片段，C _γ区有2个片段；TCRδ的V _δ区有8个片段，D区和J区各3个片段，C _δ区只有1个片段，δ链基因比较特殊，整个基因位于α基因位点的V _α基因和J _α基因群之间。

人类有效的免疫反应取决于每一个B细胞和T细胞都可产生自己独特的Ig和TCR分子。人体内，Ig分子大约有2×10 ⁶种，TCRαβ分子大约有3×10 ⁶种，TCRγδ分子大约有5×10 ³种。Ig和TCR分子总的种类可超过10 ¹²种。

Ig和TCR分子种类的多样性除与胚系基因的多样性（V、D、J片段的数量）有关外，另外也与基因重组的多样性［V-（D）-J重组的数量］和连接的多样性（V、D和J片段间连接时碱基的丢失和插入）有关。在免疫反应过程中，B细胞的Ig组分还可通过同型转换组合（isotype switching recombination）、体细胞超突变（somatic hypermutation）以及受体编辑和校订（receptor editing and revision）等进一步多样化和精确化。但T细胞的TCR基因是否存在体细胞超突变目前尚无定论。目前认为T细胞也存在受体编辑和校订。

淋巴细胞在骨髓（B细胞）或胸腺（T细胞）发育过程中，为了通过V-（D）-J片段的结合而形成一个完整的可变区结构域，编码IgH链、Igκ链、Igλ链和TCR（α、δ、β、γ）链的7个基因位点均要经历体细胞水平的基因重排。V-D-J重组（发生于IGH、TCRβ 和TCRδ）首先发生的是1个D片段和1个J片段的连接（重组），形成D-J复合物，然后，1个V基因的5′端与D-J复合物连接，产生1个特异的重组V-D-J复合物（V区基因）；V-J重组（发生于IGL、TCRα和TCRγ）由于没有D片段，直接由1个V片段和1 个J片段连接重组，产生1个特异的重组V-J复合物（V区基因）。最后，产生的特异性的V-（D）-J基因片段与下游的C片段连接（图2-2）。重排期间，位于重排基因片段之间的DNA被切除，从而形成1个单链连续的抗原受体基因，然后转录为mRNA，最终翻译成肽链，相应的不同肽链组合形成抗原受体蛋白质，即Ig和TCR，从而产生特异的免疫分子。

抗原受体基因重排的发生高度有序。在B细胞分化发育过程中，IGH基因重排开始于祖B（pro-B）细胞，随着B细胞的发育IGL重排开始。首先进行κ链的重排，如果两条染色体κ链重排均失败，才启动λ基因重排。这就决定了一个B细胞只表达两种类型轻链中的一种。在T细胞分化发育过程中，TCRδ和TCRγ首先发生重排，TCRβ和TCRα随后发生重排。此外，由于TCRδ基因位于V _α和J _α基因片段之间，在重排过程中，TCRα基因重组导致了TCRδ基因被删除，所以TCRα的成功重组将排除TCRδ基因表达的可能。TCRδ基因的删除在决定前T细胞定向于TCRγδ或TCRαβ细胞系分化中起重要作用。

综上所述，每个淋巴细胞抗原受体各条链的基因经过功能性重组，都表现为一种独特的V-（D）-J基因片段组合。不同的V、（D）、J基因片段组合导致不同特异性分子的产生，由于各种基因片段的数目较多，这些基因片段及不同肽链的不同组合会产生大量多种不同的组合，从而产生多种类型的Ig和TCR分子。此外，各片段连接之前，在V与D、D与J或V与J之间都有核苷酸的“随机”丢失或插入，也增加了抗原受体基因多样性，从而使具有同样V、（D）、J基因片段的抗原受体基因在连接处有不同氨基酸序列而形成更多不同的Ig和TCR分子。

染色体易位是另一种形式的基因重排。与抗原受体基因重排不同，染色体易位不发生或极少发生在正常细胞，因此属于病理性的基因重排。

染色体易位所涉及基因的功能蛋白包括几个类别：丝苏氨酸蛋白激酶、细胞表面受体和生长因子。然而这些蛋白中最多的蛋白类型是转录调节蛋白——转录因子。转录因子调控基因转录的起始，它们识别并与位于基因调节元件的靶序列或其他DNA结合蛋白结合，转录因子的调控通常具有组织特异性。

染色体易位导致相应基因功能改变，其机制有两种。第一是质变，即由于染色体易位使两个位于不同染色体上的基因A和基因B断裂并发生部分基因相互交换，形成融合基因AB，表达新的并有致瘤潜能的融合（chimeric）蛋白。这一蛋白在正常组织细胞中不存在，因而具有肿瘤特异性。这样的融合基因或蛋白的检测在诊断和微小残留病变或肿瘤复发监控中具有重要意义，而且也可能是肿瘤个性化治疗的重要靶标。造血与淋巴组织肿瘤中许多类型可以见到这种独特的染色体易位。如MALT淋巴瘤的特异性染色体易位t（11；18）（q32；q32）导致API2和MALT1基因相互交换，形成融合基因API2-MALT1，表达有致瘤潜能的融合蛋白API2-MALT1。

染色体易位导致基因功能改变的第二种机制是量变，即染色体易位未破坏原癌基因B结构上或转录本的完整性，但将之移位至正常生理条件下转录活性高的基因A，如抗原受体（IG或TCR）基因的转录调控域内，导致基因B的异常高表达。如Burkitt淋巴瘤中的染色体易位t（8；14）（q24；q32），将C-MYC基因移至IGH基因的转录调控域内，导致C-MYC基因的异常高表达。这一机制仅导致原癌基因表达失控（过表达或正常情况下不表达的组织中出现异常表达），而其蛋白结构不改变，这种染色体易位常是淋巴瘤中染色体易位的特点。

许多淋巴瘤携带有一种或数种染色体易位（表2-1）。这些染色体易位导致的基因异常直接或间接地影响了细胞的正常增殖与凋亡的调控，进而导致了肿瘤细胞的转化。这些染色体易位的发生不仅具有重现性（recurring），而且具有病理形态学类型的特异性。因此，染色体易位可视为相应肿瘤在基因水平上的标志物。研究还发现，即便是同一病理亚型的肿瘤，因其所携带的染色体易位不同也可有不同的预后和对治疗有不同的反应。如携带t（2；5）（p23；q35）的间变性大细胞淋巴瘤预后好于不携带者；携带t（11；18）（q32；q32）的MALT淋巴瘤，对抗HP治疗无效。

总之，染色体易位不仅在淋巴瘤的发病机制中有着重要意义，而且还为淋巴瘤的分子诊断、分型提供了标记物，染色体易位的检测有助于淋巴瘤治疗方案的选择和预后的判定，此外这些遗传学异常也有可能成为治疗的靶标。

滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）是来源于生发中心B细胞的一种低度恶性、具有惰性临床进程的肿瘤。t（14；18）（q32；q21）是FL的特征性分子遗传学改变，大于90%的FL携带该染色体易位。这一染色体易位导致位于18号染色体（18q21）上的原癌基因BCL-2与位于14号染色体（14 q32）上的IGH基因易位，导致BCL-2基因的蛋白产物过量表达。

BCL-2是一个25kDa的线粒体内膜蛋白，具有抑制细胞凋亡、延长细胞存活的作用。BCL-2正常表达于次级淋巴滤泡套区和边缘带的小B细胞，许多T细胞也表达。正常滤泡中心细胞不表达BCL-2蛋白，而FL的肿瘤细胞因携带t（14；18）（q32；q21）导致BCL-2蛋白的异常表达。

极偶然的情况下，t（14；18）也可出现于正常个体的扁桃体或外周血中，表明该染色体易位本身并不导致肿瘤发生，只有再次发生了遗传学改变如C-MYC基因重排时，才有可能发生肿瘤。

此外，t（14；18）阴性的FL存在涉及3号染色体（3q27）上的BCL-6基因的染色体易位。

套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）是一种B细胞淋巴瘤，主要见于老年人。其假定起源细胞为滤泡套区CD5阳性的淋巴细胞。其特征性的分子遗传学改变是t（11；14）（q13；q32）。95%的MCL中可检出此种易位。

这一染色体易位导致位于11号染色体（11q13）上的BCL-1（CCND1）基因与位于14号染色体（14q32）上的IGH基因易位，导致CCND1基因的蛋白产物cyclinD1的过量表达。除MCL外，在少数其他淋巴瘤如多发性骨髓瘤、幼稚淋巴细胞白血病中也存在此种易位。

cyclinD1的过度表达可促进细胞增生，在体外可引起细胞转化并在动物模型中促成B细胞淋巴瘤的生成。这表明t（11；14）（q13；q32）在MCL的发生发展过程中起着重要作用。

MALT淋巴瘤是结外低度恶性B细胞淋巴瘤。其发生部位广泛，最常见的部位为胃肠道。发生在胃的MALT淋巴瘤与幽门螺杆菌（Hp）感染相关。

MALT淋巴瘤中存在的第一个特异性染色体易位为t（11；18）（q21；q21）。这一染色体易位使11号染色体（11q21）上的API2基因与18号染色体（18q21）上的MALT1基因重组为一个新的融合基因API2-MALT1，进而转录翻译成具有致瘤活性的融合蛋白API2/MALT1。

不同部位的MALT淋巴瘤，该染色体易位的发生率不同。在肺及胃的发生率最高，分别为38%及24%；其次为结膜及眼眶，分别为19%及14%；在涎腺中的发生率仅为1%；而在甲状腺、皮肤、肝脏及其他少见部位的MALT淋巴瘤及免疫增生性小肠病（immunoproliferative small intestinal diseas，IPSID）中缺乏这一染色体易位。携带t（11；18）的胃MALT淋巴瘤对抗Hp治疗不敏感。

MALT淋巴瘤中还存在另一个特异性染色体易位——t（1；14）（p22；q32）。这一染色体易位将1号染色体（1p22）上的BCL-10基因置于14号染色体（14q32）上的IGH基因增强子的下游，因而致使BCL-10蛋白过度表达。这一染色体易位的发生率大约为4%，在肺MALT淋巴瘤中为最高（12%）。携带t（1；14）的胃MALT淋巴瘤对抗HP治疗也不敏感。

MALT淋巴瘤中还存在的第三个特异性染色体易位为t（14；18）（q32；q21）。该染色体易位涉及18号染色体（18q21）上的MALT1基因，而不是BCL2基因。该染色体易位的发生率大约为5%，关于t（14；18）存在的临床意义目前尚不清楚。

近来，在MALT淋巴瘤中又发现了第四个染色体易位，即t（3；14）（p14.1；q32）。这一染色体易位将3号染色体（3p14.1）上的FOXP1基因易位到了14号染色体（14q32）上的IGH基因下游，导致了FOXP1蛋白的过表达。但该染色体易位并非MALT淋巴瘤所特有，在DLBCL中也有发现。

除以上染色体易位外，MALT淋巴瘤还存在其他遗传学异常。3号、8号、12号及18号染色体3体常出现在MALT淋巴瘤中。

Burkitt淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）是多发于儿童和青少年、与EB病毒（Epstein Barr virus，EBV）感染相关的侵袭性淋巴瘤。

从分子遗传学角度来讲，BL是一个同质性疾病。所有病例都存在涉及C-MYC基因重排的分子遗传学异常。约85%的病例存在t（8；14）（q24；q32）/C-MYC-IGH，该染色体易位导致8号染色体（8q24）上的C-MYC基因与14号染色体（14q32）上的IGH基因发生相互易位；10%的病例存在t（2；8）（p12；q24）/IGκ-C-MYC，该染色体易位导致8号染色体（8q24）上的C-MYC基因与2号染色体（2q24）上的IGκ基因发生相互易位；5%的病例存在t（8；22）（q24；q11）/C-MYC-IGλ，该染色体易位导致8号染色体（8q24）上的C-MYC基因与22号染色体（22q11）上的Igλ基因发生相互易位。以上3种染色体易位均不导致C-MYC基因的编码区破坏，只是引起其表达失控，致使C-MYC蛋白持续高表达。

在流行性BL中，8号染色体的断裂点位于MYC基因5′方向约100kb处，IGH基因的断裂点位于其J区或D区，表明流行性BL发生于发育早期B细胞。在散发性BL中，8号染色体的断裂点位于C-MYC基因的第一个外显子或内含子，IGH的断裂点位于其C区，提示散发性BL来源于发育晚期的B细胞。

正常情况下，在B细胞的增生和分化过程中，C-MYC的表达受到严格的调控。C-MYC基因表达失控被认为是细胞增殖、分化和凋亡异常，进而导致肿瘤转化的中心环节。少数弥漫大B细胞淋巴瘤也携带C-MYC基因的易位。

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuses large B cell lymphoma，DLBCL）是淋巴瘤中最常见的类型。不论是从形态学还是分子遗传学变化来看，它都是一种高度异质性的肿瘤。

在约30%的DLBCL中存在涉及3号染色体q27（3q27）区域的BCL-6基因的染色体易位。其中t（3；14）（q27；q32）最为常见，导致3号染色体（3q27）上的BCL-6基因与14号染色体（14 q32）上的IGH基因发生相互易位。此外，与BCL-6基因发生易位的伙伴基因还有IGκ基因、IGλ基因等，涉及十多条染色体，如2、22、11、12、8等。3号染色体的断裂点聚集区在BCL-6 5′端第1个外显子前后。上述染色体易位把位于3号染色体（3q27）上的BCL-6基因的编码区完整地移到了编码Ig重链和轻链基因活跃的启动子之后，通过启动子替换，导致BCL-6基因的过表达。

BCL-6基因是一个原癌基因，其编码产物是一个由706个氨基酸组成的磷蛋白，功能上是一个转录抑制因子，属于锌指蛋白家族。BCL-6蛋白在生发中心的发育和T细胞依赖的免疫反应中发挥重要作用。高水平表达见于生发中心B细胞而不表达于B细胞前体或成熟的浆细胞。

约25%的DLBCL中存在t（14；18）（q32；q21）/IGH-BCL-2。该染色体易位导致14号染色体（14q32）上的IGH基因与18号染色体（18q21）上的BCL-2基因发生相互易位。有研究表明，t（14；18）多与生发中心B细胞样（germinal center B-cell-like， GCB）DLBCL相关，且多表现为预后较好。DLBCL中，携带t（14；18）的病例，部分是原发的DLBCL，部分则可能是由携带有t（14；18）的FL转化而来的DLBCL。

约10%的DLBCL中存在t（8；14）（q24；q32）/G-MYC/IGH，该染色体易位导致8号染色体（8q24）上的C-MYC基因与14号染色体（14q32）上的IGH基因发生相互易位，从而导致C-MYC蛋白持续过表达。

约3%的DLBCL中存在t（3；14）（p14；q32）/FOXP1-IGH，这一染色体易位使3号染色体（3p14）上的FOXP1基因易位到了14号染色体（14q32）上的IGH基因下游，导致了FOXP1蛋白的过表达。

在DLBCL中，除存在上述诸多染色体易位之外，还存在多种基因扩增。其中最为常见的是BCL-2基因的扩增。此外，还有部分DLBCL中存在BCL-6、C-MYC及MALT1基因的扩增。

间变性大细胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）是T/裸细胞非霍奇金淋巴瘤的一个独特亚型。ALCL可分为原发系统性和原发皮肤性。

目前发现的与ALCL有关的遗传学异常有t（2；5）（p23；q35）/ALK-NPM及其变异型t（1；2）（q25；p23）/TPM3-ALK、t（X；2）（q11-12；p23）/MSN-ALK等染色体易位。其中，以t（2；5）（p23；q35）最为常见，约占40%～60%。该染色体易位导致2号染色体（2p23）上的ALK基因与5号染色体（5）上的NPM基因融合。以上染色体易位以累及2号染色体上的ALK（anaplastic lymphoma kinase）基因为共同特点，即将ALK基因与另外一个伙伴基因相互易位而导致ALK基因的重排。

ALK基因编码一个酪氨酸激酶受体，在正常情况下此受体在淋巴样细胞中是静止的，当发生易位时，ALK基因即被激活而可能参与肿瘤转化。目前，在ALCL中陆续鉴定的与ALK基因易位的伙伴基因有10个，这些染色体易位均可导致ALK基因与相应伙伴基因的融合而形成融合基因及其相应的转录本（transcript），并有不同分子量的X-ALK（X代表不同的伙伴基因）融合蛋白表达。X-ALK融合蛋白则可通过免疫组化方法检测。

正常情况下，ALK蛋白仅在胚胎发育组织及中枢神经系统中表达。出生后，如果在中枢神经系统以外的其他组织中检测到ALK蛋白，表明ALK有反常表达，ALK蛋白可能以某种融合蛋白的形式存在。高度特异性单克隆抗体ALK-1的产生，使融合蛋白X-ALK的检测变得方便、准确而快捷。t（2；5）（p23；q35）及其变异型均可通过ALK-1抗体而识别，依据分子遗传学异常的不同，阳性信号可为核浆型、浆膜或细颗粒状浆型。但携带t（2；5）（p23；q35）的ALCL与携带其他变异型染色体易位的ALCL之间，并无临床特征及形态学的不同。

53%～89%的ALCL携带有t（2；5）（p23；q35）及其变异型而表达ALK蛋白，且预后较好。然而，在ALCL中，除ALK阳性ALCL外，有很大一部分ALCL不表达ALK，关于ALK阴性ALCL的遗传学改变目前尚不清楚。

外周T细胞淋巴瘤-非特异型（peripheral T cell lymphoma-unspecified，PTCL-U）是来源于胸腺后不同阶段T细胞的一类恶性淋巴细胞肿瘤，其病理形态学、生物学行为及临床表现有着明显异质性。

最近Streubel等发现，17%的PTCL-U携带有一种新的染色体易位——t（5；9）（q33；q22）/ITK-SYK。该染色体易位导致5号染色体（5q33）上的ITK基因5′端和9号染色体（9q22）上的SYK基因3端融合，形成一种新的融合基因ITK-SYK。

ITK与SYK基因的产物均为非受体酪氨酸激酶，在淋巴细胞的抗原受体信号传导中起一定的作用。因此，从理论上ITK-SYK融合蛋白似乎具有连续激活酪氨酸激酶的作用。

在淋巴瘤中，DNA重排（包括生理性与病理性重排）往往发生于克隆性增殖之前。正常细胞中不存在而在肿瘤细胞中存在的独特的基因重排，包括生理性和病理性者，均可以作为一个独特的肿瘤标记物，用来区分淋巴瘤肿瘤细胞和正常细胞。

通常用于淋巴瘤分子病理学诊断中的常用靶标有抗原受体（IG和TCR）基因重排及染色体异常，如染色体易位。

导致淋巴细胞抗原受体（Ig/TCR）多样性的基因重排不仅仅是一个令人感兴趣的学术问题，同时我们也可以通过IG/TCR基因重排的克隆性分析，将这一理论应用到淋巴组织增生性疾病的诊断和研究中。

在抗原受体基因的生理性重排过程中，由于不同的V、（D）、J基因片段组合及核苷酸的“随机”丢失或插入，导致每一个不同的B或T细胞有不同（长度和碱基序列）的IG或TCR基因。在正常淋巴组织及淋巴组织反应性增生病变中，淋巴细胞为多克隆性的，因而B或T细胞的IG或TCR基因也表现为多克隆性重排。当某一个B细胞发生恶性转化后，其特殊的IG或TCR基因编码序列可遗传给所有子代肿瘤细胞，肿瘤性增生的细胞即表现为（单）克隆性的IG或TCR基因重排。因而，IG或TCR基因重排的（单）克隆性就可作为区别淋巴瘤和正常或反应性淋巴组织增生性病变的一个分子标记物。

Southern印迹法（以这一技术的发明者Edwin Southern命名）分析被视为检测淋巴细胞抗原受体基因克隆性重排的金标准。其原理和基本步骤为：首先提取细胞DNA，然后以一种或多种限制性内切酶消化（最终片段最好为2～15kb，且避免多态限制性位点作为酶切位点）。对于一个特定的基因，利用一定的限制性内切酶可将其切割为特征性的、一定大小或一定大小范围内的片段，这些片段被定义为胚系片段。胚系片段的大小是特定的，而发生过基因重组的细胞DNA的酶切位点有所改变，因此会产生有别于胚系的酶切片段。转膜后，与已标记的DNA探针（最好是J基因片段的下游区）杂交，以检测酶切后相应的DNA片段。当有一定数量的克隆性增生的淋巴细胞存在时（＞1%～5%），与胚系的DNA片段所产生的条带相比，在含有克隆性基因重排的样本中，就会产生一条额外的特异性的条带，而正常或多克隆性的淋巴细胞增生则因重排片段大小各异而呈弥散状，仅可能出现一条胚系DNA片段大小的条带。

这一技术有两个关键点：第一是通过高分辨凝胶电泳分离限制性内切酶消化的DNA片段；第二是利用特异性DNA探针与DNA片段进行杂交，然后利用放射自显影来定位探针，以确定限制性片段的大小。

尽管Southern印迹法分析具有高度的可靠性，被认为是识别克隆性基因重排的“金标准”，但因其需要新鲜组织、费时（通常需要1周～2周）、成本昂贵并使用放射性物质等缺点，逐渐被聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术所取代。

PCR是一种体外试管内合成DNA的反应，这一反应混合物包括样本DNA（模板）、一对寡核苷酸引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA合成酶及含有Mg ²⁺的缓冲液。在热循环仪上，反应经过变性、退火、延伸三个步骤的多次循环，在几个小时内将单一拷贝的DNA增加几百万倍，使得合成的产物可经过凝胶电泳而检测和分析。通常的PCR产物分析可使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。但琼脂糖凝胶分辨力较差，因此不能用于IG/TCR基因重排克隆性分析时PCR产物的分析。

在胚系构象中，IG/TCR基因中的V、（D）、J片段相隔甚远，不能通过PCR进行扩增。IG/TCR基因通过重排，将分布在不同区域的V、（D）、J片段结合在一起，利用PCR方法，通过采用针对重排片段V-（D）-J结合区的特异性或共有引物，V-（D）-J结合区得以扩增。因此，PCR检测IG/TCR基因重排克隆性的基础是，胚系构象中相隔甚远的V、（D）、J片段经过重排而结合在一起。

正常淋巴组织或反应性淋巴组织增生性病变中，淋巴细胞为多克隆性，因而V（D）J结合区的PCR产物多样，是大小不同、序列各异的片段，凝胶电泳显示产物呈涂抹片状（smear）或细密的阶梯状（ladder）。在淋巴瘤组织中，增生的细胞是肿瘤性即单克隆性的，因而V-（D）-J结合区的PCR产物单一，大小一致、序列相同，凝胶电泳显示产物呈一个或两个（双等位基因重排）单一性条带（band）。

可用于PCR检测IG和TCR基因重排克隆性的样本多样。肝素或EDTA抗凝的外周血（5ml）及骨髓抽吸物、骨髓活检标本、新鲜组织、石蜡包埋组织中提取的DNA均可用于PCR检测IG和TCR基因重排的克隆性，甚至经过组化或HE染色的切片刮取组织中提取的DNA也能利用。

利用PCR技术检测IG/TCR基因克隆性的方法简便、快速、成本较低、敏感性较高（1%～5%），因而优于Southern印迹法。其业已取代Southern印迹法的一个重要因素是这一方法所需DNA量少，对DNA质量要求不高，常规甲醛溶液（福尔马林）固定、石蜡包埋组织中提取的DNA即可满足这一技术要求。

然而，PCR方法也有不足之处。首先，由于PCR的高敏感性及具体方法学上的不同或结果解释标准的不同而有可能导致假阳性的出现，也有可能因标本污染而出现假阳性结果；其次，如果DNA质量过差（如断为小于100bp的片段）或体细胞超突变、特定区域的删除、染色体易位（translocation）或倒位（inversion）引起缺失或靶序列方向错误而导致的引物结合失败，均可导致假阴性的出现。如DLBCL、FL、MALT可由于存在体细胞超突变引起引物结合失败出现假阴性（多克隆重排）的结果。此外，当被分析组织中淋巴样细胞过少，可能会出现由仅一个淋巴细胞而产生PCR产物，出现相似与克隆性重排的结果（寡克隆），此时应结合形态学来判断，以避免假阳性结果。

在以往的实际工作中，IGH、TCRβ和TCRγ基因常被用作检测IG或TCR基因重排克隆性分析的目标基因。利用PCR方法检测IGH基因重排时，一般在V区相对保守的骨架区FR（包括FR1、FR2、FR3）及J区设计引物，扩增FR1、FR2、FR3到J区的（FR/J）片段，因FR3/J的扩增片段较小，可应用于已降解为较小片段的DNA，故较为常用。在大约70%～80%的B细胞肿瘤中，通过FR3/J的扩增，可检测出其单克隆性。用PCR方法检测TCR基因重排主要以TCRβ和TCRγ基因为靶目标。因为TCRα基因结构复杂而TCRδ基因在成熟T细胞中常常被删除，因而不或很少作为检测TCR基因重排的靶目标。在大约70%的T细胞肿瘤中，通过PCR扩增TCRβ和TCRγ基因，可检测出其单克隆性。TCRδ基因的扩增可应用到前驱T细胞性肿瘤的研究中。

但通过多重引物的应用，可提高T和B细胞肿瘤的单克隆性检出率。van和Langerak 等2003年发表了一个欧洲合作性研究报告：标准化的检测克隆性IG和TCR基因重排的BIOMED-2 PCR方案。利用这一方案，在理论上可检测出100%的T和B细胞肿瘤的单克隆性。以下将重点介绍这一方案。

“标准化的检测克隆性IG和TCR基因重排的方案”——BIOMED-2 PCR方案（以下简称BIOMED-2方案）是欧洲7个国家（荷兰、比利时、西班牙、葡萄牙、英国、德国和法国）的47个研究所约90个研究人员合作进行的一项大规模的研究。这些研究人员包括了在分子生物学、免疫学、血液病学及病理学领域中具有丰富实验室研究经验的专家。所用组织标本（所有诊断困难及10%的随机抽取病例）经过由7个国家的病理学家组成的国际病理学专家组进行复习核实。

BIOMED-2方案的主要目的是研发标准化的多重PCR试管和标准化的PCR方案，为早期可疑（恶性）淋巴组织增生性疾病提供可靠而简便的克隆性检测方法。为达到这一目的，BIOMED-2方案需要解决的问题有两个。其一，防止假阴性结果：通常由于不恰当的引物复性（常因体细胞超突变所致）所导致；其二，防止假阳性结果：主要由于不恰当的（单克隆和多克隆性重排）结果解读造成。BIOMED-2方案通过设计针对每个Ig和TCR分子位点的、覆盖所有IG和TCR基因重排方式的多种引物来解决第一个问题；通过使用双链PCR产物的异源双链分析和荧光标记单链PCR产物的基因扫描两种不同的技术，辨别单克隆和多克隆性IG和TCR基因重排，避免假阳性结果，以解决第2个问题。

目前，在欧洲，BIOMED-2方案已被成功地应用于可疑（恶性）淋巴组织增生性疾病的克隆性分析中。

BIOMED-2方案将107种不同的引物组合在18个试管中，其中一些引物用于1个以上的试管中（表2-2）。这些引物组合在一起，在检测克隆性重排上具有互补性，但引物本身不发生交叉复性（退火）。所用引物有家族性引物（识别一个特殊家族的大多数或全部基因片段）和通用引物（识别存在于许多或全部相关基因片段的保守序列）两种类型。

BIOMED-2方案的18个多重引物试管中，8个用于IG基因重排的克隆性分析，其中包括5个用于检测IGH基因重排（包括完全性V _H-J _H和不完全D _H-J _H重排）的试管（IGH tube A、IGH tube B、IGH tube C、IGH tube D、IGH tube E）；2个用于检测IGκ基因重排（包括V _κ-J _κ和Kde）的试管（IGK tube A、IGK tube B）；1个用于检测IGλ基因重排的试管（IGL tube）。

此外，BIOMED-2方案的多重引物试管中，还包括4个检测两个染色体易位的试管。其中1个用于检测t（11；14）（BCL1-IGH）的试管［t（11；14）tube］和3个用于检测t（14；18）（BCL2-IGH）的试管［t（14；18）tube A、t（14；18）tube B、t（14；18）tube C］。检测t（11；14）和t（14；18）的试管，除可检测两个染色体易位的存在与否外，也可作为B细胞克隆性的检测靶标。

BIOMED-2方案的多重引物试管中，用于TCR基因克隆性重排分析者有6个，其中包括3个用于检测TCRβ基因重排（包括完全的V _β-J _β和不完全的D _β-J _β重排）的试管（TCRB tube A、TCRB tube B、TCRB tube C）；2个用于检测TCRγ基因重排者（TCRG tube A、TCRG tube B）；1个检测TCRδ基因重排者（TCRD tube）。

此外，BIOMED-2方案中，为评估石蜡包埋组织所提取DNA的质量（完整性和可扩增性），特设计包括5对对照基因引物组成的1个多重引物试管。利用这一试管可扩增出包含100bp、200bp、300bp、400bp和600bp的产物。通常，如果获得300bp以上的PCR产物，可基本满足克隆性重排的分析。如果扩增产物片段过小，则说明DNA质量较差，不能保证克隆性重排的检出。

A. 反应液配制：以一个反应25µl为例

若使用InVivoScribe Technologies公司的IG和TCR基因重排克隆性分析的试剂盒，则反应液配制如下：

B. PCR扩增程序

C. PCR产物的分析方法：用于PCR产物的分析方法有多种。BIOMED-2方案主要采用两种分析法——异源双链分析（heteroduplex analysis）和基因扫描（gene scanning）。

a. PCR产物的异源双链分析（heteroduplex analysis）：异源双链分析是将PCR产物（以未标记引物扩增）在高温下变性（94℃，5分钟），然后在低温下（4℃，1小时）快速随机复性再次形成双链结构。经过这样的处理，在多克隆性淋巴组织增生病变中，产生许多拥有不同迁移速度的异源双链；但是在单克隆性病变中，则产生拥有同一迁移速度的同源双链。在6%的聚丙烯凝胶电泳中，同源双链形成预知大小范围的单一条带，而异源双链则在较高位置呈现为弥散片状。

异源双链分析是一个快速、简单且价格便宜的技术，其检测敏感性可检测出大约为5%的克隆性淋巴细胞。异源双链的形成也消耗一部分单克隆性PCR产物，所以检测限度受单克隆性增生的淋巴细胞所占比例的影响。

由于异源双链分析以PCR产物的长度或大小和连接区域多样性为基础，对于分析连接区域多样性有限的位点尤为重要。

b. PCR产物的基因扫描（gene scanning）：不同于异源双链分析法，基因扫描法基于单链PCR产物、仅利用结合区域长度的不同进行分析检测，而且用于基因扫描检测的PCR产物其引物需荧光标记，以便自动测序仪检测。

变性后荧光标记的单链PCR产物，通过变性聚丙烯酰胺测序胶或毛细管测序聚合物分离，然后利用激光自动扫描进行检测。在多克隆性淋巴组织增生的病例中，由于含有许多长度不同的PCR产物，因此会产生多个峰组成的高斯正态分布，但是在一个单克隆性增生病例中，由于仅包括一种长度的PCR产物，因此会产生一个单峰。

一般来讲，基因扫描比异源双链分析更加敏感，其敏感性可检测出0.5%～1%的克隆性淋巴细胞。基因扫描检测PCR产物快速、简便，精确测定的PCR产物大小，可用于随访期间监测克隆性增生。但其缺点是需要昂贵的设备。

对于结合区异质性较大的IGH（V _H-J _H）和TCRB的PCR产物，基因扫描和杂交双链分析的效果是相同的，而对于结合区异质性有限的IGH（D _H-J _H）、IGK和TCRG的PCR产物分析，应优先选择异源双链分析法。此外，尽管TCRD的PCR产物的多色基因扫描对TCRD基因重排的类型识别非常有益，但是异源双链分析法在IGL和TCRD的PCR产物的分析中具有极大的优势。

由于各种BIOMED-2方案多重引物管的互补性，使用引物组合进行克隆性重排的检出率空前的高。联合应用IGH （VH-JH和DH-JH）和IGK试管能够检测几乎所有的克隆性B细胞增生（包括携带高水平体突变的B细胞淋巴瘤）。联合使用TCRB和TCRD试管可检测几乎所有的克隆性T细胞群。TCRD试管在可疑TCRγδ阳性T细胞增生病例中具有重要价值。

BIOMED-2 PCR以尽可能少的引物管检测尽可能多的基因重排，大大地促进了克隆分析在临床中的应用。不仅如此，如果按照一定的顺序选择引物，可以大大节约时间和试剂，提高其在临床检测中的应用价值。英国剑桥大学Addenbrooks医院的Liu等使用BIOMED-2 PCR方法对125例新鲜/冰冻组织和316例石蜡包埋组织进行检测，通过各种引物管对于克隆性增生检出率的总结，对引物的选择进行了优化。这一优化方案可作为临床应用BIOMED-2方案进行IG和TCR基因克隆性重排检测的参考。

一般而言，PCR产物分析呈现弥散片状（异源双链分析）或正态分布（基因扫描）代表多克隆性，意味着相应病变为反应性淋巴组织增生；而PCR产物分析呈单一条带（异源双链分析）或单峰（基因扫描）代表克隆性，意味着相应病变为淋巴瘤。但克隆性分析的结果需结合临床资料、形态学改变、免疫组化而进行解释。同时要注意以下事项：①首先，IG和TCR基因克隆性重排分析一定要设定多克隆性对照、（单）克隆性对照、无DNA模板空白（H ₂O）对照。如果各个对照的结果不正确，则无法进行样本结果的报告。②当克隆性增生的淋巴细胞数在正常淋巴细胞中所占比例小于1%时，BIOMED-2方案检测结果不可靠。

在淋巴瘤的诊断中，尽管通过广泛的免疫表型检测，仍有大约5%～10%的病例诊断困难。此时，IG和TCR基因重排克隆性分析将有助于诊断的确定。通常，需要进行IG 和TCR基因重排克隆性分析的情况如下：①通过形态学和免疫组化检测未能诊断的可疑性（恶性）B细胞增生性病变；②所有可疑性（恶性）T细胞增生性病变；③免疫缺陷患者，包括器官移植后患者的淋巴组织增生性病变；④判定一个患者身上发生的两个淋巴瘤之间的克隆关系，或区别淋巴瘤的复发还是第二次发生的淋巴瘤；⑤淋巴瘤的分类，是B细胞还是T或NK细胞性肿瘤。

克隆性分析的检测敏感性随所用技术的不同通常在1%～10%之间，如果肿瘤细胞过少（＜5%～10%）可能会检测不出。

尽管，IG和TCR基因克隆性重排与淋巴瘤显著相关，但克隆性分析的检测结果为（单）克隆性并不总是意味着恶性肿瘤的出现。当进行分子遗传学分析时，一定要清楚患者的免疫状况。当患者存在先天性免疫缺陷、自身免疫性疾病、器官移植后免疫抑制和AIDS病时，即使没有恶性淋巴瘤的存在，也可能检测到克隆性增生的淋巴细胞。很显然，免疫系统功能失调可导致淋巴细胞在抗原刺激或分裂原（如EBV）诱导下，不受正常免疫系统的约束反复分裂。这些分裂的细胞群体存在着继发性的遗传物质损伤（可能为染色体易位）的高危性，从而导致细胞转化形成淋巴瘤。这一现象的早期表现是寡克隆性淋巴细胞增生，并可自行消退。但晚期寡克隆中的一个克隆呈优势生长，可形成淋巴瘤。

临床上，常见的一些呈（单）克隆性增生的良性病变有CD8（有时CD4）阳性T细胞增多症、良性单克隆性γ病、免疫缺陷患者的EBV感染性淋巴组织增生性病变的初始阶段（通常是寡克隆性）及良性皮肤T细胞增生（如淋巴瘤样丘疹病等）。因此，分子克隆性检测结果应该结合临床、形态学、免疫组化资料来进行综合分析。

尽管绝大多数IG基因重排发生于B淋巴细胞，TCR基因重排发生于T淋巴细胞，近十年的研究已经清楚，IG和TCR基因重排并不一定代表相应B细胞和T细胞起源。有时可见二者的交叉。如在不成熟的B细胞性肿瘤中，交叉性的TCR基因重排时有发生，特别是前B细胞性急性淋巴细胞性白血病（B前-ALL），90%以上有交叉性的TCR基因重排，而且急性髓细胞性白血病（AML）和成熟B细胞肿瘤也可出现交叉性的TCR基因重排。交叉性IG基因重排（主要涉及IGH位点）在T细胞性肿瘤和AML中也有发生，但发生率很低。

此外，几乎所有的（＞98%）的TCRαβ阳性T细胞肿瘤均有TCRG基因的重排（通常是两个等位基因），而TCRγδ阳性T细胞肿瘤有TCRB基因的重排，因此检测到TCRB和TCRG基因的重排并不意味着一定是TCRαβ阳性或TCRγδ阳性T细胞起源。

由于PCR敏感性高，如果被检测组织中淋巴细胞数量较少，其中个别B或T细胞的IG或TCR基因被扩增，可形成假克隆性结果。特别是在小的细针吸取组织或高肿瘤负荷的B细胞非霍奇金淋巴瘤标本中所存在的少量反应性T细胞，可形成寡克隆性的PCR产物（通常产物量较少），尤其是TCRG基因作为PCR靶点时更为显著。对于这种情况，要对同一标本同时扩增2～3份，然后将所获得的PCR产物混合后进行分析，这样将有助于明了表面上像克隆性的PCR产物是否实际上来自不同的淋巴细胞。

此外，由于抗原选择作用，一些亚克隆显著占优势会导致反应性淋巴组织增生的Ig 或TCR成分的多样性减少，尤其在携带活性EBV或CMV感染的病人淋巴结或血液标本中，可显示TCR基因的寡克隆性，例如在器官移植后患者或毛细胞白血病患者中。

最后，需要强调的是，可靠的分子克隆性诊断，不仅仅取决于PCR引物和方案的质量，PCR产物的基因扫描和异源双链分析结果的经验同样重要。足够的知识和经验可在一定程度上避免问题的出现，但同时克隆性分析的结果一定要结合临床、形态学、免疫组化资料进行综合分析，然后作出最后的诊断和分类。

染色体是细胞遗传学的基础。非霍奇金淋巴瘤存在许多遗传学方面的改变，可表现为染色体数量异常和（或）结构改变。不同类型的恶性淋巴瘤有其特有的细胞遗传学和分子遗传学改变，涉及不同类型的染色体异常，其中包括染色体的易位、缺失、获得、三倍体以及染色体片段的扩增等。这些染色体的异常可以通过分子生物学或细胞遗传学的方法进行检测。目前用于染色体异常的检测方法主要有以下4种。

20世纪60年代建立了一系列染色体显带技术，包括C带、G带、Q带、R带和T带等，其中应用最广的是G显带技术。后来出现的高分辨G带技术能进一步提高分辨率，可以将染色体的细微变化准确地定位在一个特定染色体的某一个区带上。早期淋巴瘤的细胞遗传学研究均采用染色体核型分析来完成，并通过该方法发现了一系列淋巴瘤特异性的染色体异常。染色体核型分析是细胞遗传学不可缺少的基本手段，但该方法结果的可靠性取决于收获的中期有丝分裂象数量、染色体分散和显带质量，并且费时费钱。这一技术应用受限的最主要原因是不能用于石蜡包埋组织。

比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）技术是由Kallioniemi在1992年首先提出。该技术通过单一的一次性杂交对某一肿瘤全基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查。其基本原理为利用不同荧光素分别标记肿瘤组织的基因组DNA（通常采用绿色荧光素标记）和正常细胞或组织的基因组DNA（通常采用红色荧光素标记）作为探针，与正常人的分裂中期染色体进行共杂交，通过比较两种探针杂交后染色体上显示的肿瘤组织与正常对照组织的荧光强度，来判断肿瘤组织的DNA是否存在缺失、获得或扩增。该技术已被广泛应用于恶性肿瘤，包括淋巴瘤的研究。通过该技术可用于染色体异常的检测，寻找与淋巴瘤发生、发展及预后判定有关的遗传学异常。

本技术的优点是单一的一次性杂交即可对肿瘤全基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查，所需DNA量较少，且研究材料不仅可以是外周血、培养细胞和新鲜组织，也可是石蜡包埋组织。其缺点为分辨率低，仅可检测到较大范围的DNA缺失与获得（3～5Mb），小于2Mb的DNA获得和缺失不能被发现，且检测不出平衡染色体易位，不能将DNA拷贝数变化与基因或基因标记物直接联系起来.

近来发展起来的高分辨微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，a-CGH）技术，将DNA克隆或cDNA作成微阵列，代替中期染色体作为杂交靶，不仅使分辨率提高，结合生物信息学分析，甚至可以确定肿瘤相关基因，并提供精确的定位。尽管a-CGH问世不久，但已广泛用于各种肿瘤的研究。但通过a-CGH发现的基因异常，通常需要间期FISH、实时定量PCR和免疫组化等来进一步证实。

利用PCR及RT-PCR技术可检测染色体易位的存在。其基本原理是染色体易位将两个特定基因结合在一起，通过在两个基因断裂点附近或以融合转录本为目标设计引物，以合成融合基因或融合基因转录本的方式来判定染色体易位的存在与否。如果有染色体易位存在，染色体易位将两个远隔在两条染色体上的基因结合到了一起，则有PCR产物出现；如果没有染色体易位，两个基因分别在不同的染色体上，则不会出现PCR产物。

利用PCR检测染色体易位受断裂点分布的影响。如果染色体易位的断裂点分布比较集中，则通过PCR检测染色体易位是一种相对简便易行的方法，但有时染色体易位的断裂点分布较散，有的易位涉及多个染色体，这样若要采用PCR检测就需要设计很多对引物来检测，因此这时PCR方法显然不是最好的。目前PCR检测染色体易位的技术正在被荧光原位杂交技术所取代。

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术是近年发展起来的一种分子遗传学分析技术。FISH有中期FISH（metaphase FISH）和间期FISH（interphase FISH）两种。中期FISH因需要新鲜组织和细胞，并需要制备中期染色体，故在应用上受到很大限制。而间期FISH技术不仅适用于新鲜组织，也可应用于经甲醛溶液固定的组织，并可以将组织细胞学形态和遗传学改变相互联系，因而在日常分子病理学诊断工作中，是一个非常有用的手段。

许多淋巴瘤中的染色体易位断裂点分布很广或样本DNA/RNA质量较差，在很多情况下无法利用PCR方法进行检测。而间期FISH检测不受断裂点变化的影响，对样本DNA/ RNA的质量要求不高，因此已被广泛应用于淋巴瘤染色体异常的检测。

基于DNA双链互补的特性，将荧光标记的DNA片段（探针）特异性杂交于靶基因，然后通过荧光显微镜观察结合到靶目标上的探针，从而判定相应染色体数目和结构的状况。间期FISH则是利用上述原理专门检测处于细胞分裂间期的细胞染色体数目和结构异常的技术。

目前FISH技术在淋巴瘤方面的临床应用主要有以下几个方面：①有助于淋巴瘤的诊断和鉴别诊断；②判定淋巴瘤的预后和指导其治疗；③监测淋巴瘤的复发和对治疗的反应。

例如，检测到t（11；18）/API2-MALT1和t（1；14）/IGH-BCL10的意义：①明确MALT淋巴瘤的诊断。以上两个染色体易位是MALT淋巴瘤的特异性染色体易位，在MALT淋巴瘤相关良性病变及其他类型淋巴瘤中尚未发现；②判定胃MALT淋巴瘤的预后并对其治疗进行指导。t（11；18）/API2-MALT1或t（1；14）/IGH-BCL10阳性的病例，通常处于晚期阶段，预后较差，且对于HP根除治疗不反应，常需要放化疗；③监测MALT淋巴瘤的复发。

甲醛溶液固定、石蜡包埋组织切片（涂有APES的胶片），该技术在胃活检组织、针吸组织等较小组织标本中也可应用。

常用于检测染色体异常的探针有3种。

双色分离重排探针均含有以绿色和橙色荧光素标记的两个探针，其分别与所检测靶基因的两端（telomeric 和centromeric）杂交。在相应双色滤光片下观察，正常间期细胞核中存在橙色荧光和绿色荧光融合而成的两个黄色融合信号。当相应基因出现断裂时（如与另一染色体上的基因发生易位），间期细胞核中出现一个黄色的信号、一个单独的橙色和一个单独的绿色信号。当所检测靶基因出现拷贝数增多时，细胞核内出现多于2个的黄色融合信号。双色分离重排探针既可检测基因的数量也可检测基因结构的改变。但此探针用于检测涉及某一基因的染色体易位时，无法确定与其发生相互易位的伙伴基因。

双色双融合易位探针以绿色荧光标记一个基因，以橙色荧光标记另一个基因。正常情况下，细胞核中显示两个单独的橙色信号和两个单独的绿色信号；当存在染色体易位时，细胞核中出现阳性信号，典型类型为一个黄色的融合信号、一个单独的橙色和一个单独的绿色信号。若某个基因有扩增，则细胞核内出现多于2个的橙色或绿色信号。

双色双融合易位探针同样既可检测基因数量也可检测基因结构的改变。此探针用于检测染色体易位，并可确定发生相互易位的伙伴基因。

染色体计数探针以橙色或绿色荧光标记整个着丝粒，故又称着丝粒特异性探针。正常的情况下，在细胞核中显示两个橙色或两个绿色信号，当存在染色体数量异常时，细胞核中则显示多于或少于两个的橙色或绿色信号。

染色体计数探针用于检测染色体单体、三体等数目异常的变化。

FISH实验中，要设定相应基因异常的阴性和阳性对照。其步骤简述如下：

（1）4～5μm厚的石蜡切片常规脱蜡、水化。

（2）高压锅内沸水煮3分钟。

（3）0.1%的胃蛋白酶37℃消化25分钟。

（4）梯度酒精脱水、空气干燥。

（5）加FISH探针。

（6）80℃水浴箱中孵育25分钟，以使DNA及探针变性。

（7）45℃避光杂交2～3天。

（8）杂交结束后，以梯度SSC液清洗。

（9）用含有DAPI的抗荧光衰退的封片剂封片。

（10）荧光显微镜下观察结果，并采集图像。

阳性和阴性的诊断依赖于所使用的探针。在分析解释临床样本之前，要先观察对照。如果对照的结果不正确，那么检测无效，临床样本结果不能解释。

两个清晰的绿色和橙色融合（黄色）信号。

一个清晰的橙绿融合信号（黄色），一个分离的绿信号和一个分离的橙信号。

提示染色体非整倍性或者基因扩增或缺失。需要进一步的研究。

独立而清晰的两个绿色信号和两个橙色信号。

两个清晰的橙绿融合信号（黄色），一个独立的绿色信号和一个独立的橙色信号。

两个分开的同色信号（绿色或橙色）。

非整倍数量：一个、三个或者多个分离的绿色或橙色信号。

（1）间期FISH无法确定基因在染色体中重排的断裂点。

（2）信号会受组织切片质量（如组织固定不好或者切片过厚）的影响。

最后，像在IG和TCR基因重排分析中强调的一样，利用间期FISH进行分子遗传学异常的检测，需要以分子生物学、遗传学知识和病理形态学作为基础。结果的解释一定要结合临床、形态学、免疫组化资料进行综合分析，然后对淋巴瘤作出最后的诊断和分类。

分子遗传学分析为病理医生和临床医生提供了淋巴瘤诊断和分类强有力的手段。对于一个特定的可疑恶性的病理诊断来讲，分子遗传学异常的检出可以提供有力的恶性证据。

特异性的遗传学异常的检测，有助于淋巴瘤的诊断和分型，从而有助于临床医生选择正确的治疗方式、预测临床过程和其对治疗的反应。具有较好预后特征的患者受益于标准化的治疗；而那些具有较差临床或分子遗传学特征的患者，则可能需要强化治疗或探索性治疗。一种肿瘤中，染色体异常的消失是治疗后肿瘤完全缓解的重要标志，染色体异常的再次出现预示着肿瘤的复发。

分子遗传学异常的研究，对于肿瘤分子生物学研究有着重要影响。染色体易位的分子分析使得许多新基因得以鉴定，也使对调节正常细胞生长、分化和恶性转化的过程有了新的认识。越来越多的高通量检测技术和基因组范围的数据库可以应用到临床实验室的工作中，已完成的人类基因组测序、基因表达芯片和对细胞信号传导通路的深入理解正在改变着我们对淋巴瘤细胞的认识方式。

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