目前对正常菌群的研究基本可以分为两个方面，一方面是针对菌群自身的研究，包括采用传统的细菌培养技术和分子生物学技术研究肠道菌群所包含的种类，数量等，以及近年的人体宏基因组研究。由于培养技术受培养基选择和培养条件的限制，约有60%～80%的微生物无法培养，且敏感性低、耗时较长，用于菌群分析鉴定存在较大偏倚，分子生物学技术和宏基因组则可弥补这些不足。另一方面是针对正常菌群引起人体各种结构和功能改变的研究，包括菌群引起解剖结构或生理、生化或免疫功能等，其中菌群代谢产物是重要的内容。与菌群本身研究相比较，针对菌群代谢产物甚至菌群对人体代谢的影响研究可以更直接地揭示正常菌群与人体健康和疾病的关系。

在进行菌群代谢产物测定之前，各种生物样品包括粪便、尿液和血液需要根据检测物的不同进行提取与纯化，方法有蒸馏法、高速离心法、超滤法、萃取法等。

直接蒸馏法由Brieger在1878年首次提出。国外多项研究关于粪便中SCFA多是采用1977 年Zijlistra等所描述的在1984年被Hoverstad和Bjorneklett修改的方法，此方法中粪便进行GC分析前需进行蒸汽蒸馏或真空蒸馏，除此之外还有一种Duclaux蒸馏法。蒸馏法前处理较烦琐，需要大量样品，且费时，还容易导致蒸汽的污染。因此，蒸馏法

现已很少使用。

粪便可通过高速离心进行分离，一项研究测定经高速离心法直接获得的粪便上清液和粪便先加水后制成的混悬液再经离心后所得的上清液中的SCFA，发现直接高速离心法粪便中的SCFA的回收率较高。高速离心法的一个缺点是得到的液体量较少，且含有其他较多类型的有机酸以及糖和胺等。

超滤法借助离心力的作用，使样品中的液体与相对分子质量小的物质一起通过半透膜而进行分离。超滤法的缺点是有机酸的一部分可能会吸附在滤膜上，造成测定的含量不准确，且含量低的酸不易检出。

乙醚、乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷等为常用萃取剂。在萃取前要把粪便配成悬液，一般在悬液中加入酸使脂肪酸更易被有机溶剂提取。萃取法包括液-液萃取法、液-固萃取法、固相微萃取法、超临界微萃取技术等，它的缺点是步骤烦琐，费时费力，回收率偏低。

色谱法又叫层析法，是一种物理分离技术，其分离原理是使混合物中各组分在两相间进行分配，其中一相是不动的，叫做固定相，另一相则是推动混合物流过此固定相的流体，叫做流动相。当流动相中所含的混合物经过固定相时，就会与固定相发生相互作用。由于各组分在性质与结构上的不同，相互作用的大小强弱也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后顺序从固定相中流出，使混合物中各组分获得分离。当用液体作为流动相时，称为液相色谱（LC），当用气体作为流动相时，称为气相色谱（gas chromatographic，GC）。

使用GC对SCFA进行测定，由于羧基的极性较强，在GC柱中容易产生吸附从而使结果的重现性差，这种情况尤其在低浓度（＜1mmol/L）时会发生，因此SCFA在进入色谱柱前需衍生化，衍生化还可以降低这些挥发性酸的蒸发损失。SFCA经常被衍生成五氟苄基酯或苄基酯。其他的衍生化试剂如N-（叔丁基二甲基硅烷基）-N-甲基三氟乙酰胺也可被用来与SCFA反应获得相应的氟化酰胺。GC是目前SCFA检测应用最多的方法。程序升温、分流比、色谱柱类型、载气和检测器等条件都是决定测定准确度和精确度的重要因素。

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）又称为高压或高速液相色谱、高分离度液相色谱或近代柱色谱，以液体为流动相，采用高压输液系统，具有高压、高效、高灵敏度、分析速度快、载液流速快的特点。HPLC测定脂肪酸最主要的问题是脂肪酸分子结构中缺乏具有紫外吸收和荧光的基团。为了解决这一问题，经常在对脂肪酸进行柱前或柱后衍生化后用紫外或荧光检测器检测。紫外衍生试剂往往含有如下基团：苄基、对硝基苄基、对-甲硫代苄基、苯甲酰甲基、对-溴苯甲酰甲基、对-苯偶氮苯甲酰甲基和1-萘胺。荧光衍生试剂一般用香豆素类、重氮甲烷类、喹啉类、苯并酰肼类以及磺酸酯类化合物。

HPLC定性、定量测定SCFA的优点是分析过程条件温和，准确度好，且可选用的检测器多，如紫外、电化学、荧光和化学发光检测器。电化学检测器可以不用衍生化直接检测脂肪酸并具有高灵敏度和特异性，但其重现性不如紫外和荧光检测器。因此目前主要是将SCFA衍生化后再采用紫外或荧光检测器检测。

毛细管电泳法（electrophoresis，CE）是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，具有效率高、分离检测样本的速度快、所需要的样本和试剂少、检测的模式多且可以和其他技术联用、试剂易得廉价、能够实现自动化的优点，越来越广泛地被用于有机酸的分析。影响有机酸分离的主要因素有：缓冲溶液的种类、缓冲溶液的pH 值、电渗流改性剂和添加剂、分离电压等。与GC和HPLC相比，CE用于SCFA的测定具有快速、简便、样品量少和反应条件温和等优点。但CE技术对样品的水溶性要求较高，并且由于脂肪酸缺乏紫外或荧光发色基团，在进行直接或间接紫外检测和激光诱导荧光（LIF）检测时选择衍生化试剂非常关键。

质谱分析（mass spectrometry，MS）是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，其基本原理是待测样本中的成分在离子化器中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场或磁场使不同质荷比的离子在空间上或时间上分离，或是透过过滤的方式，将它们分别聚焦到侦测器而得到质谱图，从而获得质量与浓度（或分压）相关的图谱。由于质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，因此，质谱技术广泛应用于大分子生物标志物、小分子生物标志物、核酸、药物等的检测和分析。

直接应用MS进行代谢物分析虽然速度较快，但灵敏度以及分辨率较低，将MS与气相色谱或液相色谱联用（GC-MS或LC-MS），虽然降低了分析速度，但却提高了分析灵敏度以及分辨率。GC-MS 和LC-MS目前已经成为最有效的分析技术，可以检测包括糖、糖醇、有机酸、氨基酸、脂肪酸，以及大量次级代谢物在内的数百种化合物。GC-MS分析的主要缺点是分离样品分子量范围有限，不能分离大分子及难挥发物质，同时热不稳定性物质在GC条件下容易分解。LC-MS具有强大的分离能力，广泛应用于难挥发性物质的分析。近来，两种新质谱技术傅立叶变换回旋共振质谱（fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，FTICR-MS）和毛细管电泳质谱（CE-MS）被用于代谢物图谱分析。FTICR-MS具有高通量的优点，可检测上千种代谢物，但不能区分异构体限制了它的应用；CE-MS检测灵敏度较高，可以检测低丰度代谢物。Soga等利用CE-MS在枯草芽孢杆菌中检测到一千多种代谢物。

磁共振波谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）分析法是将磁共振现象应用于测定分子结构的一种谱学技术，目前，磁共振波谱的研究主要集中在H（氢谱）和C（碳谱）两类原子核的波谱。NMR可用于测定分子中某些原子的数目、类型和相对位置，是研究物质结构的有力分析手段。NMR检测样品的预处理简单，对样品的结构和性质无损害，因此检测具有普遍的适用性。相对于MS而言，NMR的灵敏度以及分辨率较低，所需样品量也大，对复杂样品中丰度较低的代谢物检测比较困难。

采用何种分析技术主要取决于待分析生物系统的种类以及解决何种科学问题。

短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）是指碳链中碳原子小于6个的有机脂肪酸，主要是由饮食中不能够被人体消化的碳水化合物包括淀粉、纤维多糖、寡聚多糖和部分氨基酸等在结肠腔内经厌氧菌酵解生成的。SCFA包含8种，分别是乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸和异己酸。SCFA可以降低结肠的pH值，控制有害酶的作用，抑制非耐酸的细菌，沉淀胆盐，降低血清胆固醇等，同时它们也可以抑制革兰阴性菌的生长，促进双歧杆菌和乳杆菌等有益菌的生长。SCFA的种类和数量受到发酵基质的类型、数量、降解程度、降解速率，以及肠道菌群和宿主生理状态等因素的影响。生物体内的SCFA主要为乙酸、丙酸和丁酸，约占SCFA总量的90%～95%，这三种SCFA是结肠中主要的阴离子，可以刺激水和钠的吸收，是结肠细胞氧化的燃料。他们在结肠腔中可以迅速的被吸收，其中丁酸是结肠黏膜的主要能量来源，促进结肠上皮代谢和正常细胞生长分化；乙酸和丙酸被吸收进入门静脉血，丙酸几乎完全被肝脏吸收，参与糖异生作用和抑制胆固醇合成；乙酸则渗透入全身血液循环，在肌肉、脾脏、心脏、脑内代谢，最终只有小部分的SCFA逃脱了吸收，在粪便样品中出现。粪便中的SCFA浓度约是76.8mmol/g湿粪，主要反映了肠道内盲肠和升结肠的微生物消化、生产、吸收或分泌的SCFA的净总和，因此，粪便中SCFA的含量就可以作为最接近结肠持续发酵的指标，是肠道菌群最重要的代谢产物标志之一。

肠道菌群中不同的菌属，产生的SCFA不同。Henis等首次报告，用乙醚提取各种细菌培养物，然后通过气相色谱对提取物中微生物的特征性代谢产物进行分析，得到这些细菌各种代谢产物的色谱图，它们就代表了被检细菌的属或种的特征。我国熊德鑫等利用气相色谱分析，发现拟杆菌属的主要代谢产物是乙酸、丙酸、琥珀酸，或产生丁酸同时伴有一定量的异戊酸和异丁酸。梭杆菌属产生丁酸，不伴或伴有极少量的异丁酸和异戊酸。一般认为对于同一菌属菌种而言，其主要代谢产物是一致的，但非主要脂肪酸略有差异，这种差异可能与各菌株的特性有关。丁酸是结肠主要能量的来源，产丁酸的细菌主要存在于盲肠和结肠，主要属于梭菌属、真杆菌属和梭杆菌属。乳酸杆菌主要的代谢终产物是乳酸。双歧杆菌主要生产乙酸和乳酸，不生产CO ₂、丁酸或丙酸，还可以生成一些维生素。异己酸的产生在早先的一项关于无菌小鼠单一相关性因素的研究中已经证实，异己酸与肠道内出现难辨梭状芽孢杆菌有关。

SCFA在人体肠道内的产生是随着肠道内菌群的建立而逐渐发展的。在无菌动物和胎儿肠道内尚未定植有细菌，故胎粪中尚未存在SCFA，在新出生的婴儿中，随着肠道内逐渐有细菌的定植，乙酸是唯一出现的SCFA，到出生后1月龄和3月龄时乙酸和丙酸是主要的SCFA，且母乳喂养的婴儿比配方奶喂养的婴儿含有较高的乙酸，随后发现有丁酸、戊酸、己酸等的产生。随着肠道内肠道菌群的建立，SCFA的模式也随之转变，随着婴儿的生长，产生含碳原子更多的SCFA逐渐增多，在儿童2岁时肠道菌群构成与成人相同，SCFA中除了异戊酸外，其他的SCFA都达到了成人水平，当然并不是所有的儿童都能达到这个水平，这还与多种因素有关，如接触除母乳以外的其他食物、抗生素的应用等。一项采用气相色谱和电泳技术的研究发现，出生后6个月内完全母乳喂养婴儿，肠道内产生的SCFA只发现有乙酸（96.3%）、丙酸（2.2%）和丁酸（1.5%），而相同年龄的混合喂养婴儿则大多含有5～8种SCFA，混合喂养的婴儿中较早含有如成人多样性的SCFA模式，而单纯母乳喂养的婴儿肠道内产生少数的碳链较短的SCFA。此后的另一项研究结果与其相似，即母乳喂养的婴幼儿盲肠和粪便中短链脂肪酸主要以乙酸和乳酸为主，在该研究中建立人母乳喂养的菌群相关的大鼠模型，这些模型盲肠和粪便中短链脂肪酸也主要以乙酸和乳酸为主，而配方奶喂养的婴儿则含有较多的丙酸和较少的乳酸。

目前已经有较多的研究显示，过敏性疾病儿童粪便的SCFA与正常儿童不同。瑞典的Bottcher MF等采用气相色谱检测25例过敏性疾病及47例健康13月龄婴儿大便中菌群相关代谢产物，发现过敏性疾病婴儿粪便中丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸水平降低，而乙酸和与难辨梭状芽孢杆菌相关的异己酸明显增高，提示过敏性疾病患儿与正常婴儿肠道菌群及其代谢存在差异，而检测的胆固醇/粪醇的比值和粪便胰蛋白酶（FTA）在过敏与非过敏的婴儿中无差异。这一结果说明患过敏性疾病的婴儿肠道中与定植较多的难辨梭状芽孢杆菌有关。Elisabeth Norin等也采用气相色谱研究了过敏性疾病低发地区爱沙尼亚43名和高发地区瑞典25名健康婴儿1岁以前粪便中SCFA的含量，发现1月龄以前瑞典儿童粪便中的乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸均较高，且这些SCFA比爱沙尼亚儿童较常出现在瑞典儿童，1岁时这种情况发生变化，爱沙尼亚儿童粪便中的乙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸则较瑞典儿童增多，丙酸和己酸在瑞典儿童1岁以前都较爱沙尼亚儿童低，而与难辨梭状芽孢杆菌相关的异己酸则较高。这种结果的转变可能与低发地区爱沙尼亚儿童肠道内较早较多的定植乳酸菌有关，较早且较多的定植乳酸菌会产生大量乳酸，可减少其他具有生产短链脂肪酸代谢潜力的微生物。随着婴儿的生长，这种SCFA模式迅速正确转变，当产生乳酸的细菌缺少时，SCFA的产生菌才能有更多的物质用于代谢，产生大量的SCFA。这对于研究过敏和非过敏机制提供了依据。这与较早Sepp E等的一项关于过敏性疾病低发生率的爱沙尼亚儿童与高发生率的瑞典儿童肠道菌群的研究结果相似，爱沙尼亚婴儿肠道主要优势菌为乳酸菌和真细菌类，而瑞典婴儿肠道优势菌则为梭状芽孢杆菌属，尤其是难辨梭状芽孢杆菌数量显著高于爱沙尼亚婴儿，这也与之后在荷兰首次进行的KOALA初生队列研究结果相似，该研究通过对957名过敏性疾病高危初生婴儿的粪便进行检测，并随访直到发生过敏性疾病，发现肠道大肠埃希菌和梭状芽孢杆菌可增加包括湿疹、反复发作性喘息在内的多种过敏性疾病的发生危险。

芬兰的Kalliomaki M等采用常规细菌培养，荧光定量原位杂交（FISH）和气液色谱检测检测大便脂肪酸三种技术，收集76名高危过敏婴儿在生后3周龄及3月龄时的粪便进行分析，发现1岁时出现皮肤过敏原检测阳性有29%（22/76），过敏和非过敏婴儿在3周龄时大便脂肪酸组成已存在明显差异，FISH实验结果显示过敏的婴儿大便中双歧杆菌与梭菌的比值减小，即所含的梭菌量较多，双歧杆菌的量较少。Anna Sandin等研究139名儿童，收集1岁和4岁时的粪便进行SCFA的检测，发现1～4岁时粪便中所含的乙酸和丙酸水平逐渐减少，而戊酸增加。1岁时低水平的异丁酸、异戊酸和戊酸与4岁时经问卷报告有食物过敏的症状有关，4岁时过敏较非过敏的儿童具有高水平的乙酸和低水平的异丁酸、异戊酸和戊酸。乙酸和丙酸的减少与具有碳原子较多酸类的增加是肠道内厌氧菌转变的结果，本研究还显示发展为过敏性疾病的儿童最早在1岁时肠道菌群的多样性已减少，1～4岁SCFA水平和组成的变化与更复杂的肠道菌群建立有关。西班牙的一项关于婴儿牛奶蛋白过敏（cow’milk protein allergic，CMPA）的研究，针对年龄在2～12个月的46名正常婴儿和46名诊断为CMPA的婴儿，收集粪便进行FISH、流式细胞术、气液色谱法等方法进行分析，发现CMPA婴儿的粪便中有较高比例的球形梭菌群和奇异菌群，而且不同种属的细菌的总量比正常婴儿多。粪便的pH值和氨的含量在两者之中没有明显的差异。粪便中的丙酸和短支链脂肪酸（branched-chain short fatty acids，BCSFA）在CMPA婴儿中比正常婴儿高。这种结果表明肠道内微生物组成的失调与CMPA的发病机制存在一定的联系，似乎并没有一个单一的物种或属发挥重要的作用，但是这种微生物的失调通过细菌发酵的产物导致了CMPA特有的生物标志。

最近杨晓庆和王烨采用气相色谱、气相色谱-质谱联用（GC-MS）对糖尿病小鼠和糖尿病儿童的粪便SCFA进行研究，发现糖尿病鼠和儿童粪便的乙酸、丙酸和正丁酸含量明显低于正常组，而血浆中的D-乳酸含量显著升高，提示糖尿病时肠道菌群存在紊乱。

代谢组（metabolome）是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合，包含一系列不同化学型的分子，比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。代谢组学（metabonomics/ metabolomics）来源于代谢组一词，是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态，协助阐释新基因或未知功能基因的功能。代谢组学与基因组学（genomics）、转录组学（transcriptomics）以及蛋白组学（proteomics）的最大区别是其研究代谢组的变化，是生物对遗传变异、疾病以及环境影响的最终应答。如同Billy David所说：“基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么，而代谢组学则告诉你已经发生了什么”。

代谢组学通过运用GC-MS、LC-MS、MS和NMR等先进的分析技术，对细胞提取物、组织提取物和生物体液随时间改变的代谢物进行检测，结合有效的模式识别方法进行定性、定量和分类，并将这些代谢信息与病理生理过程中生物学事件关联起来，从而了解机体生命活动的代谢过程。目前代谢组学的研究可分为以下3个层次：①目标代谢物分析（metabolite target analysis）；②代谢谱分析（metabolite profiling）：对一系列预先设定的目标代谢物（如某特定代谢途径中所有代谢物，或者一组由多条代谢途径共享的代谢物）进行定量研究；③代谢组学：定性和定量特定条件下生物样品内的全部代谢物。

代谢组学目前已经应用于疾病机制、疾病诊断，药理学研究、毒理学研究、食品及营养学和微生物研究等领域。在微生物领域的研究主要包括微生物分类，突变体筛选以及功能基因研究，发酵工艺的监控和优化，环境微生物研究。人体实际上是人体自身与体内共生微生物构成的超级生物体，因此对人体这个超级生物体进行代谢组学研究，将有助于评估共生微生物对人类健康和疾病的作用。最近Wang等采用GC/MS，HPLC和LC/MS/MS对冠状动脉硬化患者血浆进行了代谢组学研究，发现饮食中磷脂酰胆碱（卵磷脂）的三种代谢物——胆碱、三甲胺N-氧化物（TMAO）和甜菜碱是冠心病的独立危险因素；通过对无菌小鼠和抗菌药物处理小鼠的干预研究证实，肠道菌群在食物胆碱代谢、TMAO产生、促进冠状动脉巨噬细胞胆固醇聚集和泡沫细胞形成中发挥着关键作用。这一结果提示，食物中磷脂酰胆碱代谢依赖于肠道菌群，及其与冠心病的发病关系，为冠心病诊断和治疗提供了新的策略。另一项研究采用了LC-MS检测正常人群高卵磷脂饮食前后的血浆和尿液中TMAO，血浆中的胆碱和甜菜碱水平；并且对4007位冠心病患者的空腹血浆TMAO水平进行测定，随访3年。结果显示，食物中磷脂酰胆碱生成TMAO依赖于肠道微生物的代谢，TMAO水平的增高与主要心血管事件（死亡、心肌梗死、脑卒中）的增加密切关联。