2.2　实验部分

2.2.1　仪器

F-4500荧光分光光度计（日立公司，日本）

LS-55荧光分光光度计（PE公司，美国）

T6新世纪紫外—可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）

Bruker Avance 600MHz核磁共振仪（Bruker，瑞士）

Spect rum One红外光谱仪（Perkin Elmer公司，美国）

90005-02纯水系统（LABCONCO，美国）

WX-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）

W-02电动搅拌器（沈阳工业大学）

恒温水浴锅（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）

2.2.2　试剂

小牛胸腺DNA（D4522），鲑鱼DNA钠盐（D1626）（Sigma，美国）

λ-DNA/HindIII（洛阳市华美生物工程公司）

1-甲基咪唑（临海市凯乐化工厂）

氯代正丁烷（北京化学试剂公司）

六氟磷酸（江苏昆山嘉隆生物科技有限公司）

乙酸乙酯（天津市天河化学试剂厂）

溴化乙锭（EB,Life Technologies，美国）

三羟甲基氨基甲烷（tris-hydroxymethyl aminomethane,Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸钠（EDTA）、磷酸氢二钾、柠檬酸、氢氧化钠、盐酸均购于国药集团沈阳分公司（沈阳）。所有试剂除特别声明外皆为分析纯，实验用水均为二次去离子水（18MΩ）。

1.0mg/mL DNA储备液：精确称取10mg DNA，用二次去离子水溶解后定容至10mL，于-20℃储存，使用时稀释为100ng/μL工作液。

1.0mg/mL EB储备液：精确称取10mg EB，以二次去离子水溶解后定容至10mL，于0～4℃储存，使用时稀释为100ng/μL工作液。

2.2.3　离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF6）的合成

参照文献[13]报道的方法并对其进行了一定的改进以合成疏水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF6），具体合成过程如图2-1所示。

将28mL（24.85g，0.27mol）氯代正丁烷和20mL（0.25mol，20.72g）1-甲基咪唑，加入250mL三口圆底烧瓶中，水浴加热到75℃，搅拌回流72h。反应过程中可观察到白色浑浊现象，继续反应直到溶液变为浅黄色透明液体，用20mL乙酸乙酯洗涤3次，在真空干燥箱中80℃干燥24h，可得到1-丁基-3-甲基咪唑氯代盐（BmimCl）约24mL，收率为80%。

将20mL（22g，0.125mol）的BmimCl和40mL水加到250mL三口圆底烧瓶中，不断搅拌中滴加30mL（0.2mol）的六氟磷酸，控制反应的温度不超过50℃，搅拌1h后，取出下层溶液用二次去离子水洗涤，直到洗涤水的pH为6.5左右，将产物放至干燥箱中80℃干燥24h，得到约20mL 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（Bmi-mPF6），收率为77%。合成的离子液体BmimPF6的核磁共振1H谱为：1H-NMR（in CD3COCD3）δCH3（1）：3H,singlet（s），4.004ppm，δH（2）：1H,s，8.941ppm，δCH2（3）：2H,triplet（t），4.311ppm，δH（4）：1H,s，7.703ppm，δH（5）：1H,s，7.652ppm，δCH2（6）：2H,quintet，1.884ppm，δCH2（7）：2H,sextet，1.357ppm，δCH3（8）：3H,t，0.928ppm。相关数据与文献[13]报道的基本吻合。

2.2.4　实验操作步骤

在室温下，将700μL一定浓度（0～100.0ng/μL）的DNA水溶液加入1.5mL离心管中，再加入一定体积（10～700μL）的离子液体与之混合，震荡10min使DNA水溶液与离子液体充分混合，静置5min分层后，取出上层水溶液0.5mL，以EB为荧光探针对其定量分析[14]。DNA对EB荧光有明显的增强作用，且在一定范围内成线性关系，据此计算萃取后水相中的DNA浓度。荧光分光光度计波长范围为400～700nm，激发波长为510nm，发射波长为600nm。DNA水溶液的初始浓度为，萃取后的剩余浓度为，按照下式计算萃取后离子液体中的DNA浓度：

DNA的萃取率（E）和分配比（D）分别按照式（2-2）和式（2-3）计算：