第2章　离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF6）萃取DNA的研究

2.1　引言

核酸是一种重要的生命物质，是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。在生命科学研究中，DNA的分析检测对生命现象的深入研究以及对临床诊断、疾病的治疗等均有重要的意义。

常用的DNA提取方法包括加热去蛋白法、碘化钠法、TT（TritonX-100和Tris-HCl）溶血法、氯化铵法等。提取过程包括首先加入裂解液将细胞破碎，再加入蛋白酶K和提取液，离心后加入乙醇、氯仿、异丙醇、苯酚等有机溶剂，将DNA从溶液中沉淀出来[1，2]。液相萃取是一种常见的萃取分离DNA的方法。Haunshi等采用苯酚—氯仿—异戊醇萃取分离体系对人全血中的DNA进行了提取，并成功地将提取的DNA进行PCR扩增，并将该方法用于临床诊断[3]。Rayner等[4]在连续自动化的处理过程中采用碱消退法，以乙醇作为沉淀剂萃取分离DNA，该萃取分离方法可以实现大量DNA样品的处理，并且在操作过程中不需进行离心分离。采用以上萃取分离方法，可以实现DNA的粗提取，操作简单，常用于大量DNA样品的提取。但是在DNA提取过程中，需要加入乙醇、氯仿等有机溶剂，而这些有机溶剂不仅易导致DNA变性，而且分离出的DNA极易被有机溶剂污染，而这种污染对后续的生命过程研究将产生严重影响，因此，酚类及氯仿等有机溶剂的液相萃取方法在DNA分离纯化中的应用已经不能适应现代生命科学研究的需要。

固相萃取是较为常用的DNA分离纯化技术，一般常用的固相萃取材料包括硅胶、分子筛、离子交换树脂等。Ohmori等[5]采用离子交换树脂对食品中的DNA进行萃取分离，并成功地进行了聚合酶链反应（PCR）扩增。Faggi等[6]将磁珠用于真菌DNA的提取，与常规的乙醇/氯仿提取方法相比，该方法更简单、快速，并且能得到与常规提取方法相同的PCR扩增结果。固相萃取除了可以分离纯化DNA，还可达到适度富集的目的。Wang等[7]采用SiO2作为固相吸附材料，在流动系统中对DNA的萃取分离进行了研究，通过采用合适的洗脱体系，可以将DNA与蛋白质、其他基体分离，并且实现对微量DNA的富集。但是目前可用的固相吸附剂种类尚不多。除了以上的液相萃取和固相萃取方法，还可以采用反胶束对DNA进行萃取分离，用甲基三辛基氯化铵（TOMAC）/2-乙基己醇/异辛烷反胶团体系能够对质粒子DNA进行很好的萃取[8]，而且采用适合的反胶团体系可以实现质粒DNA与RNA的分离[9]。但是由于蛋白质等生物分子易通过电荷或静电作用而进入胶束内部，因此，采用这种方法将复杂生物体内的DNA与蛋白质进行有效的分离尚有难度。其他的萃取分离技术[10]及辅助萃取方法也能够实现特定生物样品中的DNA的萃取分离。Eggen等[11]采用微波辅助萃取，结果表明DNA的萃取分离速度显著地加快。Ki等[12]建立了一种自动化萃取分离固体样品中DNA的方法，而且无需对样品中的蛋白质进行处理，即可实现对DNA的萃取。以上萃取分离方法，能够实现特定生物样品中的DNA的分离与纯化，为DNA后续研究奠定基础。

对于经典的液相萃取分离DNA方法，主要是采用乙醇、酚类和氯仿等有机溶剂作为提取剂，这不仅带来一定的环境污染及对操作人员的危害，而且会污染分离得到的DNA样品，甚至导致DNA变性。因此，开发绿色、无污染的DNA新萃取方法是非常必要的。离子液体作为绿色溶剂，其不挥发、不易燃烧的特性使之成为传统有机溶剂的良好替代品，已经广泛地应用于金属离子、有机物、氨基酸、蛋白质等的萃取分离中，本章基于液相萃取存在的问题，以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF6）作为萃取溶剂，在室温下对DNA的萃取分离进行了系统研究，建立了离子液体萃取分离DNA的有效方法，同时对DNA与离子液体的作用机理进行了初步研究。