第二节 色谱分离及鉴定

色谱法根据其分离原理可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法与分子排阻色谱法等。

吸附色谱法是利用被分离物质对吸附剂吸附能力的不同，用溶剂或气体洗脱，使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。

分配色谱法是利用被分离物质在两相中分配系数的不同，使组分分离。其中一相被涂布或键合在固体载体上，被称为固定相；另一相为液体或气体，被称为流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。

离子交换色谱法是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同，使组分分离。常用的树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂。流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。

分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，是利用被分离物质分子大小不同导致其在填料上渗透程度不同，使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等。根据固定相和供试品的性质，一般选用水或有机溶剂作为流动相。

色谱法又可根据分离方法分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。所用溶剂应不与供试品发生化学反应、纯度高。分析时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系在室温操作。分离后各成分的检出，应采用各品种项下所规定的方法。采用纸色谱法、薄层色谱法或柱色谱法分离有色物质时，可根据其色带进行区分；分离无色物质时，可在短波（254nm）或长波（365nm）紫外灯下检视，其中纸色谱或薄层色谱也可喷以显色剂使之显色，或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光淬灭法检视。柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法可用连接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱法还可分部收集流出液后用适宜方法测定。

一、液-固色谱分离常用固定相

液-固色谱分离常用固定相的种类有多种，如硅胶、键合相硅胶、氧化铝、活性炭、离子交换剂、大孔吸附树脂、凝胶、聚酰胺等。上述固定相各具特点，可选择用来分离不同类型的化合物。天然产物化学研究中，往往需采用不同的固定相进行多次有针对性的色谱分离，才能得到纯化合物。下面就几种常用液-固色谱分离固定相做简单介绍。

1．硅胶。

硅胶色谱适用范围广，能用于非极性化合物、极性化合物，如芳香油、萜类、甾体、生物碱、苷类、蒽醌类、酚类、磷脂类、脂肪酸、氨基酸等及一系列合成产物的分离。

正相色谱硅胶是多孔性物质，可用通式SiO2·xH2 O表示。它具有多孔性的硅氧烷（siloxane）及—Si—O—Si—的交链结构，其骨架表面的硅醇（silanol）基团能通过氢键与极性或不饱和分子相互作用。硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅醇基的数目及含水量。随着水分的增加，其吸附能力降低（见表1-1）。当含水量超过12%，硅胶的吸附力极弱，不能用作吸附色谱的载体，只可用作分配色谱的载体。硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均会直接影响色谱分离的效果。

色谱硅胶应是中性、无色颗粒，由于在制备过程中接触强酸，常呈酸性，故在使用前应检查其水浸液的pH值，pH值不低于5时才可使用；否则应用水洗至中性，再在110℃活化24h。硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解度，约为0.01%。如溶液pH值大于9，则溶解度大幅度增加。

有时可以向硅胶中加入某种试剂，以改良其吸附性能，提高其分离效果。通常，AgNO3处理过的硅胶对不饱和烃类有极好的分离效果。改良吸附剂的制备一般是将含1%～10%填加试剂的水或丙酮溶液与硅胶混匀，待稍干后于110℃活化即可。

正相硅胶色谱可选择的流动相种类相对较多，为得到好的分离效果，可选择具有一定比例的多种溶剂的混合液作为流动相。可借助分析型硅胶薄层色谱的结果来摸索制备型色谱的分离条件。在实际色谱分离过程中，也可采用梯度洗脱方式。常用溶剂的介电常数见表1-2。

硅胶的再生一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂，烘干，活化处理后即可。必要时用0.5%NaOH溶液浸泡、洗涤，过滤，水洗，再以5%～10% HCl浸泡、洗涤，最后用纯化水洗至中性，110℃活化，过筛即可。

2．键合相硅胶。

硅胶表面的硅羟基能与正辛醇、氰乙醇及聚乙二醇等，在一定温度下加热脱水后生成单分子键合固定相（Si—O—C型），与十八烷基三氯硅烷生成烷基化学键合相（Si—O—Si—C型）。另外，用SOCl2将硅胶表面氯化后，可与各种有机胺反应生成具有Si—O—Si≡N键的各种不同极性基团的化学键合相。键合相硅胶对化合物的分离具有不同的选择性，在液相色谱中占有重要地位，并普遍应用于高效液相色谱。

键合相硅胶根据粒度，可用于常压至高压的各种液相分离。在键合相硅胶中，以C18反相硅胶应用最为普遍，它对极性化合物和非极性化合物均适用。在利用键合相硅胶进行反相色谱时，常用甲醇-水、乙醇-水或乙腈-水为洗脱剂。可用具有相同键合相硅胶的薄层色谱或分析型高效液相色谱进行制备型色谱的洗脱剂选择。

3．氧化铝。

氧化铝是一种常用的吸附剂，由氢氧化铝直接在高温下（约600℃）脱水制得。由于制备条件常为弱碱性，对于分离植物中的碱性成分（如生物碱）颇为理想，但不宜用于醛、酮、酯等类化合物的分离，因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生反应，如异构化反应和氧化反应等。可用水洗除去氧化铝中的碱性杂质，再活化即得中性氧化铝。目前，除了生物碱等碱性物质外，很少使用氧化铝色谱，基本上被硅胶色谱所取代。氧化铝吸附树脂、叶绿素及其他杂质能力强，常用于预处理提取物，去除杂质，便于之后的分离与纯化。硅胶对杂质的吸附能力较差，样品处理量相应地比氧化铝少。

氧化铝的活性与含水量关系极大，一般在200℃左右加热4h～6h活化，除去其中水分，可得Ⅰ～Ⅱ级氧化铝；若要降低活性，可加入一定量的水。活化时，氧化铝表面的氧能与水分子结合形成羟基，具有离子交换性质，但温度不宜过高（＜400℃），否则会引起氧化铝晶格的改变，导致其吸附力不可逆地下降，而不能用于色谱。通常色谱用氧化铝为Ⅲ级，级别过高的氧化铝吸附的选择性能差，有时也可加适量乙酸来降低活性。表1-3列出了氧化铝含水量与活性的比较。

同硅胶色谱一样，在氧化铝色谱中，极性溶剂的洗脱能力较非极性溶剂大，所以逐步递增溶剂的极性可使吸附在氧化铝柱上的不同化合物依极性大小依次洗脱，达到分离的目的。在实际操作中，主要根据薄层色谱展开情况来选择柱色谱洗脱剂。

4．活性炭。

活性炭色谱是用来分离水溶性物质的主要方法之一，对植物中的某些苷类、糖类及氨基酸等成分具有一定的分离效果。由于活性炭价廉易得，因此适用于大量制备型色谱的分离。

活性炭一般分为动物炭、植物炭和矿物（煤）炭3种，分别由动物的骨头、木屑、煤屑高温炭化而成。目前市售的医药用活性炭及色谱用活性炭多以木屑作原料，加氯化锌在700℃～800℃高温炭化，活化，再经适当处理除去杂质而制成，最终通常呈粉末状或颗粒状。粉末状活性炭颗粒极细、吸附力强，但流速慢，色谱过程中需要加压或减压操作，难以达到理想的流速。因此，色谱用活性炭通常呈颗粒状，虽然总表面积减少，但流速易于控制。

活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，故用于有机溶剂脱吸附。例如，以乙醇-水进行洗脱时，随乙醇浓度的递增而洗脱力增加，有时也用稀甲醇、稀丙酮、稀乙酸溶液洗脱。

活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物；对极性基团（如—COOH、—NH2、—OH等）多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。因此，可以利用吸附性能的差别，将水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物、氨基酸与肽、单糖与多糖分离开来。

使用前，应先将活性炭于120℃加热4h～5h，将所吸附的气体除去。使用过的活性炭可用稀酸、稀碱交替处理，然后水洗，加热活化。有时，可将粉末状活性炭制成颗粒状锦纶活性炭或与硅藻土混合后装柱，以增加流速，但颗粒状活性炭吸附性能要比粉末状活性炭低。

5．离子交换剂。

离子交换剂是高分子化合物，具解离性离子交换基团，在水溶液中能与其他阳离子或阴离子进行交换作用，而这种交换作用是可逆的。当两种以上成分被“吸附”在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，它们被洗脱的能力取决于各物质洗脱反应的平衡常数。利用物质“吸附”及“脱吸附”能力的不同进行分离，即离子交换色谱。目前，大部分采用合成离子交换剂，一种是单体在聚合前本身就含有交换基团；另一种是首先形成聚合物，然后引入交换基团，其中用途最广的是离子交换树脂。另外，也有在纤维素或多聚糖上人工引入交换基所成的离子交换剂，它们大多用于植物大分子蛋白质、核酸、酶及多糖体的分离和精制。

离子交换树脂可分为两大类，即阳离子交换树脂与阴离子交换树脂。

根据上述原理可采用不同型号的离子交换树脂，将植物在水中具有一定溶解度的酸、碱成分与两性成分分离开来，如图1-12所示。植物中的生物碱，特别是水溶性生物碱可用阳离子交换树脂分离与纯化。

影响离子交换的因素如下：

（1）溶液的酸碱度。离子交换剂可以简单地理解为一种高分子不溶性酸或碱，因此溶液的酸碱度对离子交换有很大地影响。当交换溶液中氢离子的浓度显著增加时，因同离子效应，可抑制阳离子交换剂中酸性基团的解离，故离子交换反应进行大幅减少，甚至不进行。通常，强酸性交换剂交换液的pH值应大于2，弱酸性交换剂交换液的pH值应在6以上。同样，在阴离子交换剂中，当溶液的pH值增大时，也会发生同样的情况，故强碱性交换剂交换液的pH值应在12以下，弱碱性交换剂交换液的pH值应在7以下。

（2）交换离子的选择性。离子交换剂对交换化合物来说，主要取决于化合物解离离子的电荷、半径及酸碱性的强弱。解离常数大、酸碱性强者容易发生置换，但洗脱相对较难。解离离子价数越高，电荷越大，它的吸附性越强，越易交换在交换树脂上。碱金属、碱土金属及稀土元素还与其原子序数有关，碱金属和碱土金属原子序数大，则交换吸附就强；稀土元素的原子序数小，其交换吸附弱。

（3）被交换物质在溶液中的浓度。离子交换操作通常是在水溶液或含有水的极性溶剂中进行的，这样有利于解离与交换。浓度低的溶液对离子交换剂的选择性大。在高浓度时，解离度会趋向降低，有时会影响吸附次序及选择性。浓度过高时，还会引起树脂表面及内部交联网孔收缩，影响离子进入网孔。因此，一般实验操作时，所用的溶液的浓度应略高，有利于提取和分离。

（4）温度的影响。稀溶液温度的改变对交换性能的影响不大，但当溶液浓度在0.1mol/L以上时，温度升高，水合倾向大的离子容易发生交换吸附，同时离子的活性系数增大。对弱酸性、弱碱性交换剂来说，温度对其交换率有较大的影响，一般温度升高，离子交换速度加快。

（5）溶剂的影响。通常在水中进行交换，也可采用含水的极性溶剂。

此外，对交换树脂本身来说，交联度大，结构中的交联网孔直径小，大分子和离子就不容易进入；反之，交联度小，交联网孔直径大，则易于离子的扩散与交换。因此，通过交联度的大小可以改变交换树脂对被交换物质的选择性。树脂颗粒的大小也会影响交换速率。颗粒小，表面积大，有利于与溶液中的离子接触，交换速率增加。强酸性和强碱性的交换树脂交换基团的解离能力强，容易与溶液中的离子交换。

6．大孔吸附树脂。

大孔吸附树脂是一种不含交换基团、具有大孔结构的高分子吸附剂，也是一种亲脂性物质。大孔吸附树脂具有各种不同的表面性质，如疏水的聚苯乙烯，可以有效地吸附具有不同化学性质的各种类型化合物，其吸附的特点是解吸附容易。当吸附过程是以亲脂键为主时，随着被吸附物的相对分子质量增加，吸附量也增加。吸附剂的表面积越大，吸附量越大。通常，大孔吸附树脂的比表面积可达100m2/g～600m2/g，因此它又具有吸附容量大的特点。但对一些分子立体结构较大的有机化合物，还要考虑树脂的孔径，使分子能进入颗粒间隙。

大孔吸附树脂具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快等优点，因此适用于水溶液中分离弱极性或非极性化合物。组分间极性差别越大，分离效果越好。混合组分在大孔吸附树脂吸附后，一般依次用水、含水甲醇、乙醇或丙酮〔10%、20%……（体积分数）〕洗脱，最后用浓醇或丙酮洗脱。再生时，用甲醇或乙醇浸泡、洗涤即可，必要时可用1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液依次浸泡，然后用纯化水洗涤至中性，浸泡在甲醇或乙醇中备用。使用前用纯化水洗涤，除尽醇即可应用。

在分离的开始阶段，先将强极性样品通过聚合物载体，可很好地除去其中的亲水性杂质（氨基酸、糖类等）。典型的分离过程是先采用大孔吸附树脂色谱，再进行硅胶色谱、反相色谱及凝胶过滤等。

对强极性成分进行初步分离的另一方法是使用AmberliteXAD-2树脂。这种树脂可吸附多酚类化合物，因而被用于黄酮类成分的分离。在得到黄酮组分之后，可继续采用其他吸附剂进行分离，得到黄酮单体。

20世纪70年代末，大孔吸附树脂开始应用于中草药化学成分的提取与分离。用于中草药化学成分提取与分离的大孔吸附树脂型号有D-101型、DA-201型、MD-05271型、GDX-105型、CAD-40型、XAD-4型、SIP系列、D-型等。常用的大孔吸附树脂有D-101型、DA-201型（天津制胶厂）、D-型（天津骨胶厂）。

7．凝胶。

凝胶色谱法是20世纪60年代发展起来的一种分离分析技术，使用的固定相是凝胶。凝胶是具有许多孔隙的网状结构的固体，具有分子筛的性质。当被分离物质的分子大小不同时，它们进入凝胶内部的能力不同。凝胶中的孔隙大小与分子大小有相近的数量级。当混合物通过凝胶时，比孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，而比孔隙大的分子就不能进入，因此不同孔径的分子的移动速度就产生了差异。大分子不被迟滞而随溶液流动较快，小分子则由于向孔隙内扩散或移动受到滞留，所以落后于大分子而得到分离（如图1-13所示）。此法被称为凝胶色谱（gel chromatography），在蛋白质及多糖等大分子化合物的分离中应用较普遍。

从理论上讲，凝胶过滤柱是利用分子排阻效应来发挥分离效能的。但当将凝胶用于分离小分子时，溶剂、溶质、固定相之间的相互作用变得重要起来。凝胶可分为亲水性凝胶和疏水性凝胶。

1）亲水性凝胶

目前，最常用的亲水性凝胶是交联葡聚糖凝胶（Sephadex），是由葡聚糖（右旋糖酐）和甘油基通过醚桥（—O—CH2—CHOH—CH2—O—）相交联而形成的多孔性网状结构。交联结构直接影响凝胶网状结构中孔隙的大小。交联度越大，网状结构越紧密，孔隙越小，吸水时膨胀也越小；反之，交联度越小，网状结构越疏松，孔隙越大，吸水时膨胀的程度也就越大。根据交联度的不同，所能分离成分的分子大小也不同。交联度可用“吸水量”或“膨胀质量”来表示，即1g干凝胶所吸收的水的质量，英文字母G代表葡聚糖凝胶不同规格型号，阿拉伯数字为凝胶的吸水量乘以10的值，如G-25表示每克葡聚糖凝胶膨胀时吸水2.5g。

2）疏水性凝胶

在交联葡聚糖分子上引入一个基团增大其亲脂性，成为疏水性凝胶。例如，在Sephadex G-25中引入羟丙基基团形成醚链的结合状态：R—OH→R—O—CH2CH2CH2OH，即成为Sephadex LH-20，从而使它不仅具有亲水性，能吸水，而且可以膨胀，这就扩大了它的应用范围，适用于分离难溶于水的亲脂性成分。目前，在植物小分子化学成分分离中常使用Sephadex LH-20。表1-4列举了Sephadex LH-20在不同溶剂中浸泡后的床体积。

一般来说，使用过的凝胶不需经任何处理，适当方法保存以备用。若加样处颜色较深，可将此部分丢弃。若整个柱体的凝胶颜色较深，可用0.2mol/L NaOH溶液（内含0.5mol/L NaCl）处理，再用水洗净。

利用Sephadex LH-20进行分子排阻色谱，对天然产物的分离具有重要意义。凝胶可根据混合物中各组分分子质量的不同对其进行分离，因此非常适用于从样品中除去大分子成分及聚合物。

Sephadex LH-20过滤不仅可作为一种有效的初步分离手段，还可用于最后的分离工作，以除去微量的固体杂质、盐类或其他外来物质。当纯化合物的量很少时，通常在分离的最后阶段使用Sephadex LH-20过滤法，原因之一在于它只导致极少的样品损失。以凝胶过滤作为最初的纯化手段也越来越常见。

8．聚酰胺。

聚酰胺（polyamide）是通过酰胺基团聚合而形成的一类高分子化合物，分子中含有丰富的酰胺基团，可与酚类、酸类、醌类、硝基类化合物等以氢键形式结合而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离。

化合物分子中酚羟基数目越多，则吸附力越强；芳香核、共轭双键越多，吸附力也强。易形成分子内氢键的化合物，其吸附力减弱。从聚酰胺柱上洗脱被吸附的化合物是通过溶剂分子取代酚类化合物来完成的，即以新的氢键代替原有氢键脱吸附而完成。通常，脱吸附剂是在水中递增甲醇或乙醇的含量。如黄酮体苷元与苷的分离，当用稀醇作洗脱剂时，黄酮体苷比其苷元先洗脱下来，而以非极性溶剂作洗脱剂时，黄酮体苷元比苷先洗脱下来，这表明聚酰胺具有“双重色谱”的性能，因聚酰胺分子中既有非极性的脂肪键，又有极性的酰胺基团。当用含水的极性溶剂作流动相时，聚酰胺作非极性固定相，其色谱行为类似反相分配色谱，所以黄酮体苷比苷元更容易洗脱。当用非极性氯仿-甲醇作流动相时，聚酰胺则作极性固定相，其色谱行为类似正相分配色谱，所以苷元比其苷更容易洗脱。因此，聚酰胺色谱除了上述化合物外，也可用于分离萜类、甾体、生物碱及糖类。

色谱中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的聚酰胺-6（尼龙-6）及由己二酸与己二胺聚合而成的聚己二酰己二胺（尼龙-66）。其既亲水又亲脂，性能比较好，既可分离水溶性物质，又可分离脂溶性物质。它们可溶于浓盐酸、甲酸，微溶于乙酸、苯酚等溶剂，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和苯等常用有机溶剂。它们对碱较稳定，对酸的稳定性较差，尤其是无机酸，温度高时更敏感。

制备柱时，将颗粒状聚酰胺混悬于水中用湿法装柱。在用非极性溶剂系统时，则用组分中低极性的溶剂装柱。一般100ml聚酰胺可上样1.5g～2.5g，实际比例视具体情况而定。样品先用洗脱溶剂溶解。若样品不溶解于洗脱剂，可选用易挥发的有机溶剂溶解，拌入聚酰胺干粉中后将溶剂减压蒸去，用湿法装入柱顶。洗脱剂常采用水-乙醇（95∶5,9∶1,7∶3,1∶1,3∶7），或采用氯仿、氯仿-甲醇（19∶1,10∶1,5∶1, 2∶1,1∶1）依次洗脱。若仍有物质未洗脱下来，可采用稀氨水或稀甲酸胺溶液洗脱，并分段收集。使用过的聚酰胺一般用5%NaOH溶液洗涤，然后用水洗涤，再用10%乙酸洗涤，最后用纯化水洗至中性即可。

聚酰胺薄膜色谱是将聚酰胺溶于甲酸并涂布在涤纶片基上制成的，待甲酸挥发、干燥后即可使用。它既可用于聚酰胺柱色谱探索分离条件，又可检查柱色谱各洗脱部分的成分和纯度。聚酰胺薄膜层析常用展开溶剂系统见表1-5。若在各种溶剂系统中加入少量酸或碱，可避免色谱中出现拖尾现象，使斑点清晰。

二、纸色谱法

纸色谱法是以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱法。供试品经展开后，可用比移值（Rf）表示其各组成成分的位置（Rf=原点中心至斑点中心的距离/原点中心至展开剂前沿的距离）。影响Rf的因素较多，因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比的方法以确定其异同。进行药品鉴别时，供试品在色谱图中所显主斑点的位置与颜色（或荧光）应与对照品相同。进行药品纯度检查时，可取一定量的供试品，经展开后，按各品种项下的规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色深度（或荧光强度）。进行药品含量测定时，将主色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定。

1．仪器与材料。

（1）展开容器。

展开容器通常为圆形或长方形玻璃缸，称为展开缸。缸上有磨口玻璃盖，应能密闭。用于下行法时，盖上有孔，可插入分液漏斗，用以加入展开剂。在近顶端有一用支架架起的玻璃槽作为展开剂的容器，槽内有一玻棒，用以压住色谱滤纸；槽的两侧各支一玻棒，用以支持色谱滤纸，使其自然下垂，避免展开剂沿色谱滤纸与溶剂槽之间发生虹吸现象。用于上行法时，在盖上的孔中加塞，塞中插入玻璃悬钩，以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上，并除去溶剂槽和支架。

（2）点样器。

常用具支架的微量注射器或毛细管点样，应能使点样位置正确、集中。

（3）色谱滤纸。

色谱滤纸应质地均匀、平整，具有一定机械强度；不含影响展开效果的杂质；不应与所用显色剂起作用，以免影响分离和鉴别效果，必要时可进行处理后再使用。用于下行法时，取色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条，离纸条上端适当的距离（使色谱滤纸上端能足够浸入溶剂槽内的展开剂中，并使点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处）用铅笔划一点样基线。必要时，可将色谱滤纸下端切成锯齿形，便于展开剂滴下。用于上行法时，色谱滤纸长约25cm，宽度则按需要而定，必要时可将色谱滤纸卷成筒形。点样基线距底边约2.5cm。

2．操作方法。

（1）下行法。

将供试品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用微量注射器或毛细管吸取溶液，点于点样基线上。溶液宜分次点加，每次点加后，使其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，样点直径为2mm～4mm，点间距离为1.5cm～2.0cm。样点通常应为圆形。

将点样后的色谱滤纸的点样端放在溶剂槽内并用玻棒压住，使色谱滤纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂，点样基线在支持棒下数厘米处。展开前，展开缸内用各品种项下规定的溶剂的蒸气使之饱和，一般可在展开缸底部放一装有规定溶剂的平皿，或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展开缸内壁上，放置一定时间，待溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。然后小心添加展开剂至溶剂槽内，使色谱滤纸的上端浸没在槽内的展开剂中。展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸移动进行展开。展开至规定的距离后，取出色谱滤纸，标明展开剂前沿位置，使展开剂挥散后，按规定方法检出色谱斑点。

（2）上行法。

上行法的点样方法同下行法。展开缸内加入展开剂适量，放置待展开剂蒸气饱和后，再下降悬钩，使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm，展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升。除另有规定外，一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定方法检视。

展开可以采用单向展开，即向一个方向进行；也可采用双向展开，即先向一个方向展开，取出，使展开剂完全挥发后，将滤纸转动90°，再用原展开剂或另一种展开剂进行展开；亦可采用多次展开、连续展开或径向展开等。

三、薄层色谱法

薄层色谱法是将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同样方法所得的色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。

1．仪器与材料。

（1）薄层板。

①市售薄层板：市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜等。

②自制薄层板：在保证色谱质量的前提下，可对薄层板进行特殊处理和化学改性，以适应供试品分离的要求，可用实验室自制的薄层板。最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、微晶纤维素等，一般要求粒径为10μm～40μm，加水或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.2%～0.5%）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。使用涂布器涂布时，应能使固定相在玻板上形成一层符合厚度要求的均匀薄层。玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。

（2）点样器。

一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。

（3）展开容器。

上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时必须能密闭。水平展开使用专用的水平展开缸。

（4）显色装置。

喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代替；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。

（5）检视装置。

检视装置为装有可见光、254nm和365nm紫外光源及相应滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。暗箱内光源应有足够的光照度。

（6）薄层色谱扫描仪。

薄层色谱扫描仪是指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。

2．操作方法。

（1）薄层板制备。

①市售薄层板：临用前一般应在110℃活化30min。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板可根据需要剪裁，但必须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。如在存放期间被空气中的杂质污染，使用前可用氯仿、甲醇或二者的混合溶液在展开缸中上行展开预洗，晾干，110℃活化，置干燥器中备用。

②自制薄层板：除另有规定外，将1份固定相和3份水（或加有黏合剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（薄层厚度为0.2mm～0.3mm）。取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30min，最终置于有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，并且无麻点、无气泡、无破损及无污染。

（2）点样。

除另有规定外，在洁净、干燥的环境中，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上。样点一般为圆点状或窄细的条带状。点样基线距底边10mm～15mm，高效板基线一般距底边8mm～10mm。圆点状样点的直径一般不大于3mm，高效板一般不大于2mm。接触点样时，切勿损伤薄层表面。用半自动或自动点样器械喷雾法点样，条带状样点的宽度一般为5mm～10mm，高效板一般为4mm～8mm。样点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品样点间距离不少于5mm。

（3）展开。

将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开8cm～15cm，高效板上行展开5cm～8cm。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。

展开前如需溶剂蒸气预饱和，可在展开缸中加入适量的展开剂，放入薄层板，密闭，一般保持15min～30min。溶剂蒸气预平衡后，展开。

（4）显色与检视。

若供试品含有可见光下有颜色的成分，可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法，以适宜的显色剂显色，或加热显色，在日光下检视。对于有荧光的物质或遇某些试剂可激发产生荧光的物质，可在365nm紫外灯下观察荧光斑点。对于在可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分，可用带有荧光剂的薄层板（如硅胶GF254板），在254nm紫外灯下观察荧光板面上的荧光物质淬灭形成的斑点。

（5）记录。

薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层扫描仪扫描或其他适宜的方式记录相应的色谱图。

3．系统适用性试验。

按各品种项下要求，对实验条件进行系统适用性试验，即用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整，以达到规定的检测灵敏度、分离度和重现性要求。

（1）检测灵敏度。

用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液，在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点。

（2）分离度。

用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点应显示为两个清晰的分离的斑点。用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计算公式为

式中，d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离，d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；W1及W2分别为相邻两峰的峰宽。除另有规定外，分离度应大于1.0。

（3）相对标准偏差。

薄层扫描含量测定时，同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于5.0%，需显色后测定的RSD应不大于10.0%。

4．测定法。

（1）鉴别。

取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）和位置应与对照溶液的斑点一致。

（2）限度检查。

采用定量配制的对照品或稀释的对照品作为对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点相当，颜色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作，测定峰面积，供试品的峰面积值不得大于对照品的峰面积值。必要时，应规定检查的斑点数和限量值。

（3）含量测定。

按照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。或将待测色谱斑点刮下洗脱后，再用适宜的方法测定。

5．薄层色谱扫描法。

薄层色谱扫描法是指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定。测定时，可根据不同薄层扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定。一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。除另有规定外，含量测定应使用市售薄层板。

扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱中待测斑点的Rf和光谱扫描得到的吸收光谱图或测得的光谱最大吸收和最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，供试品与对照品同板点样、展开、扫描、测定和计算。

薄层色谱扫描用于含量测定时，通常采用线性回归二点法计算。如线性范围很窄，可用多点法校正多项式回归计算。供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，供试品点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少于2个。扫描时，应沿展开方向扫描，不可横向扫描。

四、柱色谱法

1．吸附柱色谱。

色谱柱为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂。吸附剂的颗粒应尽可能大小均匀，以保证良好的分离效果。除另有规定外，通常多采用直径为0.07mm～0.15mm的颗粒。色谱柱的大小、吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均应符合各品种项下的规定。

（1）吸附剂的填装。

①干法：将吸附剂一次性加入色谱柱，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入洗脱剂；或在色谱柱下端出口处连接活塞，自管顶加入适量的洗脱剂，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿、下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中，应保持有充足的洗脱剂留在吸附层上面。

②湿法：将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去气泡，再缓慢倾入色谱柱中，然后加入洗脱剂，将附着在管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。填装的吸附剂用洗脱剂从色谱柱自然流下，至液面和柱表面相平时，即加供试品溶液。

（2）供试品的加入。

除另有规定外，将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿管壁缓缓加入，注意勿使吸附剂翻起。或将供试品溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽，并使混有供试品的吸附剂呈松散状，加在已制备好的色谱柱上面。如供试品在常用溶剂中不溶解，可将供试品与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

（3）洗脱。

除另有规定外，通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例。分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中，应保持有充足的洗脱剂留在吸附层的上面。

2．分配柱色谱。

分配柱色谱的方法与吸附柱色谱基本一致。装柱前，先将载体和固定液混合，然后分次移入色谱柱中用带有平面的玻棒压紧。供试品可溶于固定液，混以少量载体，加在预制好的色谱柱上端。

洗脱剂需先加固定液混合使之饱和，以避免洗脱过程中固定液的流失。

五、高效液相色谱法

高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各成分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1．对仪器的一般要求。

所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检测，并符合有关规定。

（1）色谱柱。

最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱，凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等，手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。

填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，均影响供试品的保留行为和分离效果。孔径在15nm以下的填充剂适合分析相对分子质量小于2000的化合物，相对分子质量大于2000的化合物应选择孔径在30nm以上的填充剂。

以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH值为2～8的流动相。当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂等。

（2）检测器。

最常使用的检测器为紫外-可见分光检测器，其他常用的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

紫外-可见分光检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与待测物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的待测物，其响应值几乎仅与待测物的量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱测定和色谱峰的纯度检查。

紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常呈指线关系，一般需经对数转换。

不同的检测器对流动相的要求不同。采用紫外-可见分光检测器，所用流动相应符合紫外-可见分光光度法对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发盐的流动相。

（3）流动相。

可采用固定比例（等度洗脱）或按规定程序改变比例（梯度洗脱）的溶剂作为流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。

各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径和长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。对于必须用特定型号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下注明。

2．系统适用性试验。

色谱系统的适用性试验通常包括理论塔板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性5项指标。

按各品种项下要求，对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱系统进行适当调整。

（1）色谱柱的理论塔板数（n）。

在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质色谱峰的保留时间（tR）和半高峰宽（Wh/2），tR、Wh/2可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。按下列公式计算色谱柱的理论塔板数，即

（2）分离度（R）。

无论是定性鉴别，还是定量分析，均要求待测物质色谱峰与其他色谱峰内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为

式中，为相邻两峰中后一峰的保留时间，为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1及W2分别为此相邻两峰的峰宽（如图1-14所示）。除另有规定外，定量分析时分离度应不小于1.5。

（3）重复性。

取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次。除另有规定外，其峰面积测量值的RSD应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其RSD应不大于2.0%。

（4）拖尾因子（T）。

为保证分离效果和测量精度，应检查供试品色谱峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为

式中，W0.05h为5%峰高处的峰宽，d1为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离（如图1-15所示）。

除另有规定外，峰高法定量时T值应为0.95～1.05。峰面积法测定时，T值偏离过大，会影响峰面积的检测和定量的准确度。

（5）灵敏度：通常以信噪比（S/N）表示。通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3。灵敏度可以用来评价色谱系统的检测能力。

3．测定法。

（1）内标法加校正因子测定供试品中某种杂质或主成分含量。

按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液。精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子（f），即

式中，As为内标物质的峰面积或峰高，AR为对照品的峰面积或峰高；Cs为内标物质溶液的浓度，CR为对照品溶液的浓度。

再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，进样，记录色谱图。测量供试品中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高按下式计算，即

式中，Ax为供试品（或其杂质）的峰面积或峰高，Cx为供试品（或其杂质）溶液的浓度，A′s为内标物质的峰面积或峰高，C′s为内标物质的浓度，f为校正因子。

采用内标法，可避免因供试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。

（2）外标法测定供试品中某种杂质或主成分含量。

按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液。分别精密取一定量，进样，记录色谱图。测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积或峰高，按下式计算含量

式中，Ax为供试品（或其杂质）的峰面积或峰高，Cx为供试品（或其杂质）溶液的浓度，AR为对照品的峰面积或峰高，CR为对照品溶液的浓度。

由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某种杂质或主成分含量时，以定量环或自动进样器进样为宜。

（3）加校正因子的主成分自身对照法。

测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图。按前述方法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需做校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。

测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液，作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以噪声水平可接受为限）或进样量（以色谱柱不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰的峰高达满量程的10%～25%。除另有规定外，通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的RSD应小于10%；含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样。除另有规定外，供试品溶液的记录时间，应为主成分色谱峰保留时间的2倍。测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。

（4）不加校正因子的主成分自身对照法。

当没有杂质对照品时，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述“（3）加校正因子的主成分自身对照法”配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除另有规定外，供试品的记录时间，应为主成分色谱峰保留时间的2倍。测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。

（5）面积归一化法。

由于峰面积归一化法测定误差大，因此通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。其方法是测量各杂质的峰面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积之和占总峰面积的百分率。

注意：本法进样前的溶液应澄清，除另有规定外，供试品进样前必须经0.45μm微孔滤膜过滤。

六、气相色谱法

气相色谱法是采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用数据处理系统记录色谱信号。

1．对仪器的一般要求。

所用的仪器为气相色谱仪。气相色谱仪由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统等组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均应根据分析要求进行适当设定。

（1）载气源。

根据供试品的性质和检测器种类选择载气。除另有规定外，常用载气为氮气。

（2）进样部分。

进样方式一般可采用溶液直接进样或顶空进样。

①溶液直接进样：采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样；进样口温度应高于柱温30℃～50℃；进样量一般为数微升，柱径越细，进样量应越少。采用毛细管柱时，一般应分流以免过载。

②顶空进样：适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。将固体或液体供试品制成供试液后置于密闭小瓶中，在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性组分在液态和气态达到平衡后，由进样器自动吸取一定体积的顶空气注入色谱柱中。

（3）色谱柱。

色谱柱为填充柱或毛细管柱。

①填充柱：材质为不锈钢或玻璃，内径为2mm～4mm，柱长为2m～4m，内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体，粒径为0.18mm～0.25mm、0.15mm～0.18mm或0.125mm～0.15mm。常用载体为经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球。常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

②毛细管柱：材质为玻璃或石英，内壁或载体经涂布或交联固定液，内径一般为0.25mm、0.32mm或0.53mm，柱长为5m～60m，固定液膜厚0.1μm～5.0μm。常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛细管柱在使用前需老化处理，以除去残留溶剂及易流失的物质。色谱柱如长期未用，使用前也应老化处理，使基线稳定。

（4）柱温箱。

由于柱温箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性，因此柱温箱控温精度应在±1℃，且温度波动小于每小时0.1℃。温度控制系统分为恒温和程序升温两种。

（5）检测器。

适合气相色谱法的检测器有火焰离子化检测器（FID）、热导检测器（TCD）、氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）、电子捕获检测器（ECD）、质谱检测器（MS）等。火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好，适合检测大多数的药物；氮磷检测器对含氮、磷元素的化合物灵敏度高；火焰光度检测器对含磷、硫元素的化合物灵敏度高；电子捕获检测器适于含卤素的化合物；质谱检测器能给出供试品中某种成分相应的结构信息，可用于结构确证。除另有规定外，一般使用火焰离子化检测器，用氢气作为燃气，空气作为助燃气。在使用火焰离子化检测器时，检测器温度一般应高于柱温，并不得低于150℃，通常为250℃～350℃，以免水汽凝结。

（6）数据处理系统。

数据处理系统可分为记录仪、积分仪以及计算机工作站等。

各品种项下规定的色谱条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体型号和粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图于30min内记录完毕。

2．系统适用性试验。

除另有规定外，应照高效液相色谱法项下的规定进行。

3．测定法。

（1）内标法加校正因子测定供试品中某种杂质或主成分含量。

（2）外标法测定供试品中某种杂质或主成分含量。

上述（1）～（2）法的具体内容均同高效液相色谱法的相应部分。

（3）标准加入法测定供试品中某种杂质或主成分含量。

精密称（量）取某种杂质或待测成分对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加入供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质或主成分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试液溶液中某种杂质和主成分含量。

也可按下述公式进行计算，加入对照品溶液前后校正因子应相同，即

则待测组分的浓度Cx可通过如下公式进行计算，即

式中，Cx为供试品中组分X的浓度，Ax为供试品中组分X的色谱峰面积，ΔCx为所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度，Ais为加入对照品后组分X的色谱峰面积。

气相色谱法定量分析，当采用手动进样时，由于留针时间和室温等对进样量的影响，使进样量不易精确控制，故最好采用内标法定量；当采用自动进样时，由于进样重复性的提高，在保证进样误差的前提下，也可采用外标法定量。当采用顶空进样时，由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中，故可采用标准溶液加入法，以消除基质效应的影响。当标准加入法与其他定量方法结果不一致时，应以标准加入法结果为准。

（何勤 宋颢 钱广生）