三、基因转染T细胞的方法^［16］

有几种不同的基因转移方法可用于CAR-T细胞的基因转导和靶基因表达。基因的转导/转染方法主要包括病毒和非病毒转染的方法。

1.γ反转录病毒载体

反转录病毒载体作为基因转移载体有两个特点：①大多数反转录病毒基因组能被转导的目的基因所代替；②反转录病毒载体转染的目的基因，能在细胞分裂的过程中整合到宿主细胞的基因组中。

2.慢病毒载体

慢病毒载体与γ反转录病毒载体比较相似，病毒基因可以被目的基因所替代，并且目的基因可以整合到宿主细胞基因组中。不同于γ反转录病毒，慢病毒表达载体需要顺式递呈rev基因，以及可以提高gag-pol mRNA核输出的中央聚嘌呤区/中央终止信号^［25］。慢病毒与γ反转录病毒载体的另一个不同之处是，慢病毒载体可以通过完整的宿主核膜，在整合到靶细胞时不需要细胞处于分裂期。慢病毒载体的另一个优势是在靶细胞基因组整合位点与启动子区域无关，这样可以减少插入突变的风险^［26］。

3.腺病毒相关病毒载体

腺病毒相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是单链的DNA小脱氧核糖核酸病毒，在每一个单链基因组的末端具有一个倒置的末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR），是基因组复制和包装需要的顺式作用元件。最近的研究发现，AAV在19号染色体上的特定整合位点，是基因插入比较安全的区域，有利于CAR-T细胞的基因转染。

4.质粒DNA依赖的载体

许多年来，一直使用质粒DNA载体将目的基因转移到癌细胞中。通过电转的方法也可以将质粒DNA有效地转移到淋巴细胞中，使目的基因瞬时表达。这个转基因过程虽然也可以导致基因组的整合，但是相比较于病毒载体，其发生基因整合的概率非常低。研究已经证明使用电转DNA的方法是安全的，但是基因转移效率不高，且经过该方法转基因的T细胞寿命较短^［27］。

5.转座子依赖的基因转移

转座子是不连续的DNA片段，具有在染色体位点之间迁移和携带基因信息的能力。目前两种不同的转座子依赖的表达系统被用来作为基因治疗的方法，即睡美人SB系统和来源于鳞翅目昆虫的PB系统。SB系统具有较低的免疫原性，低的增强子/启动子活性，精确和稳定的染色体整合以及能接受“负荷”的能力。通过SB和PB转座子系统，可以将表达CD19 CAR导入T细胞中^{［28，29］}。PB转座子系统也已经被用来制备靶向CD10和HER-2的CAR-T细胞^{［29，30］}。CD19 CAR-T细胞的制备需要经过3～4个星期^［31］。

6.mRNA介导的基因转导

使用电转的方法将mRNA转导进 T细胞可以获得接近100%的转染效率，且目的基因在靶细胞中能有效表达。mRNA基因转导的优点包括：①相对容易体外制备mRNA；②具备转导静止和增殖期细胞的能力；③很少导致基因组DNA的整合和插入突变。但是这种转导方法的缺点包括瞬时基因表达（大约7～10天）、需要多次输注CAR-T细胞等。有几项临床前的研究已经成功使用mRNA电转的方法制备CAR-T细胞^{［31，32］}。

体内试验结果证明，用病毒载体将CAR基因导入T细胞中制备CAR-T细胞，是安全和有效的方法^［33］。为了提高T细胞的转染效率，目前最常用的方法还是病毒转染介导的T细胞转基因方法^［34-36］。Philipp Vormittag等^［33］分析了978份CAR-T细胞制备产品，发现其中919份是使用病毒转染T细胞的方法，其中521份（占54%）使用的是慢病毒载体，398份（占41%）使用的是反转录病毒载体。