2.4 多糖分离技术
分级分离多糖是分析多糖结构的关键，只有得到分子量均一和极性均一的多糖，才能确定其结构［28］。将多糖混合物分离纯化为均一多糖的方法很多，主要有分级沉淀法、盐析法、膜分离法、离子交换柱色谱法、凝胶柱色谱法、季铵盐沉淀法和亲和色谱法等。
2.4.1 分级沉淀法
分级沉淀法（grading precipitation）是利用不同分子量多糖在不同浓度的乙醇等有机溶剂中的溶解度不同并按一定顺序沉淀下来而达到分离目的的方法。一般随着乙醇溶液浓度的增加，多糖按分子量从大到小依次被沉淀出来，但这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。
张卫国等选择4种浓度的乙醇（50%、60%、70%和85%）分离多糖，得到了7个多糖组分，其中50%乙醇浓度中沉淀出的多糖分子量最大，所占比例达49.2%，通过分级沉淀法可以将多糖按照分子量大小进行粗分，但局限性较大［29］。
2.4.2 盐析法
盐析法（salting out method）是依据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具有不同溶解度的性质分离多糖的一种方法［30，31］。在多糖中加入中性盐（如氯化钠、氯化钾、硫酸铵等）后使其达到一定浓度，此时在该盐浓度下溶解度最小的多糖将会先沉淀出来，然后上清液继续加入中性盐到更高的浓度，则另一多糖又会沉淀出来，依次进行分离。
2.4.3 膜分离法
膜分离技术（membrane separation technology，MST）是一项新兴的高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力（如压力差、化学位差、电位差等），使原料液中组分选择性地通过膜。根据膜的孔径大小可分为微滤、超滤、纳滤和反渗透［32］。膜分离法可以在室温下操作，不发生相变，尤其适合于分离和浓缩具有生物活性和热敏性的物质。膜分离技术具有高效率、低耗能、易操作、小投资和低污染等优点，广泛应用于化工、食品、医药、纺织、生物技术、环境控制和冶金等多个领域［33～35］。
近几年来，超滤（ultrafiltration，UF）技术因其截留分子量范围在2～300kDa内，恰好适用于多糖的提取和分离。孙汉巨等对超滤分离油菜籽多糖进行了详细研究，使用截留分子量为3kDa、8kDa和12kDa的膜分离多糖，优化跨膜压力、pH值和温度等条件，当跨膜压力为0.1MPa、pH>7和温度控制在40～50℃范围内时，截留各部分的多糖纯度最高［36］。闫超等选用截留分子量为5kDa、10kDa、30kDa和50kDa的4种超滤膜将甘蔗多糖分为5个部分，在温度范围为40～50℃、压差为0.15MPa和20m·s-1的膜面流速条件下，计算各部分多糖含量，结果发现5kDa以下的含量最高，10～30kDa含量最低［37］。M.Hamachi等利用膜分离技术对甘蔗多糖溶液进行脱色，使用1kDa和5kDa截留分子量的矿物质膜分离甘蔗多糖，结果发现使用1kDa的膜脱色效果最好，脱除率为58.67%［38］。张宇等选用分子量截留值为6kDa、10kDa、20kDa、50kDa、100kDa、150kDa的超滤膜将黄芪多糖分成7个部分，结合药理实验筛选得到生物活性最好的黄芪多糖的分子量范围［39］。
2.4.4 离子交换柱色谱法
离子交换柱色谱法（ion exchange column chromatography）是根据各种被分离物质的带电粒子性质不同，通过增强洗脱溶剂的离子强度或改变其pH值，将分离的混合物从离子交换剂上依次逐个洗脱下来的一种色谱分离方法［40～42］。DEAE-纤维素（DEAE-Cellulose）、DEAE-葡聚糖凝胶（DEAE-Sephadex）和DEAE-琼脂糖凝胶（DEAE-Sepharose）是常用来分离多糖的交换介质，适用于分离各种中性多糖和酸性多糖。
王玲崇等应用DEAE-Cellulose对四角蛤蜊多糖进行纯化，用不同浓度NaHCO3（0.005mol·L-1，0.01mol·L-1和0.05mol·L-1）对其进行洗脱，用紫外-可见分光光度法检测有效成分，结果得到3种均一多糖分别为MVPS-1、MVPS-2和MVPS-3，分离效果较好［43］。匡海学等选用DEAE-Cellulose 52和DEAE-Sepharose F.F 纯化麻黄多糖，并用双蒸水和不同浓度NaCl洗脱，得到4种麻黄均多糖［44］。杨翠娴应用DEAE-Cellulose 52纤维素柱对龙眼粗多糖进行分离，比较了阶段性和线性梯度洗脱两种洗脱方式的分离效果，结果发现：阶段性梯度洗脱虽然得到4个主要的洗脱峰，但各组分纯度低，不能有效的分离多糖；线性梯度洗脱以流速为0.4mL·min-1的蒸馏水洗脱得到一个中性多糖LPS-N，用不同浓度的NaCl洗脱得到2个酸性多糖，经验证后均为均一多糖，分离效果好［24］。
2.4.5 凝胶柱色谱法
凝胶柱色谱法（gel column chromatography）是利用分子筛原理分离物质的方法，当混合物随流动相经过凝胶柱床时，其中各组分按其分子由大到小的顺序而依次被分离，由于此方法具有设备简单、操作方便、不需要有机溶剂、对高分子物质（如多糖）有很高的分离效果等优点，现已被广泛应用［45］。
孔凡利在分离纯化荔枝多糖的研究中使用Sephadex G-100对荔枝多糖LFPC2和LFPC3进行了分离，洗脱剂为0.1mol·L-1的NaCl溶液，从LFPC2中得到2个均一组分LFPC2a和LFPC2b，从LFPC3分离得到1个均一组分［46］。刘洋在分离纯化金钱草多糖的研究中使用聚丙酰胺葡聚糖凝胶Sephacryl S-300对金钱草总多糖进行分离，以纯水为洗脱剂，分离得到6种多糖组分，均为对称洗脱峰［47］。
罗强等用琼脂糖凝胶（Sepharose CL-6B）对花脸香菇多糖进行纯化，洗脱剂为0.15mol·L-1的NaCl溶液，得到均一多糖［48］。朱振媛等对黄芪多糖进行纯化时使用葡聚糖凝胶G-100（Sephadex G-100），洗脱剂为双蒸水，得到一种均一黄芪多糖［49］。钟闲柯等使用聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl S-400纯化仙人掌多糖，洗脱剂为0.2mol·L-1的NaCl溶液，流速为0.2mL·min-1，每1mL组分被收集，结果经高效液相凝胶色谱测定为均一多糖［50］。