基于亲水性金属配位印迹磁性微球的磁固相萃取-液相色谱测定奶粉中氟喹诺酮类药物残留

周少丹，任兴慧，吕运开^*

（河北大学化学与环境科学学院，保定 071002）

氟喹诺酮类药物（FQs）是一系列新型氟取代的喹诺酮类衍生物，其对Gram氏阳性和阴性杆菌、葡萄球菌均有强的抗菌活性，因而被广泛应用于人类和动物的感染性疾病的治疗中^[1]。但由此产生的FQs残留对人体引起的不良反应和毒副作用也逐渐凸显出来^[2]。为了保护人类的健康，一些国际组织，如欧盟和美国食品和药物管理局均规定了动物源性食品中FQs的残留量范围是30～1900μg/kg^[3]。

近年来，磁性分子印迹固相萃取技术具有高选择性、萃取时间短及易分离等优势，逐渐被应用于食品FQs残留的检测中^[4]。为了减少有机溶剂的使用，并实现在水相体系中形成足够强的相互作用，达到选择性识别目标分子的目的，金属配位印迹聚合物以其独特的优势引起人们的研究兴趣^[5]。

本研究首先以磁性硅胶微球为内核，通过修饰亚氨基二乙酸为功能单体，氧氟沙星-Cu(II)为模板分子，四乙氧基硅烷和甲基三乙氧基硅烷为交联剂，采用溶胶凝胶技术合成了氧氟沙星-Cu(II)配位印迹磁性微球，然后修饰γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，开环后成功使微球表面引入大量醇基。实验中，探究了微球的排阻蛋白质的能力。应用磁分散萃取法以及高效液相色谱检测法成功的检测了奶粉中FQs残留。

1　实验部分

1.1　试剂和仪器

三种100mg/L氟喹诺酮类药物的标准储备液，考马斯亮蓝，乙二醇（EG），六水合三氯化铁（FeCl₃•6H₂O），无水醋酸钠，氨水，四乙氧基硅烷（TEOS），亚氨基二乙酸3-氨基丙基三乙氧基硅烷（KH550），γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH-560），甲基三乙氧基（IDA），硅烷（MTES），氧氟沙星（OFL），环丙沙星（CIP），恩诺沙星（ENR），四环素（TC），乙腈（ACN）。

傅里叶红外光谱仪；SHD-III型循环水式多用真空泵（保定高新区阳光科教仪器厂）；THZ-82型恒温振荡器（THZ-82）；BF-2000M型氮吹仪（北京八方世纪科技有限公司）；LC-20A高效液相色谱仪（Shimadzu，Kyoto，Japan）。

1.2　色谱条件

LC-20A高效液相色谱仪，色谱条件：色谱柱，Venusil XBP C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相，0.1%三氟乙酸溶液-乙腈（75 : 25，体积比）；流速，1.00ml/min；检测波长，285nm；温度25℃。

1.3　限进介质-氧氟沙星-Cu(II)配位印迹磁性微球的制备

1.3.1　亚氨基二乙酸修饰磁性硅胶微球

称取Fe₃O₄@SiO₂磁性微球1.0g，加入到100ml三口烧瓶中，使其分散于50ml无水甲苯中，超声分散5min后，加入5mlKH-560和1ml吡啶，连续搅拌回流12h，反应完成后磁铁分离，产物依次用乙醇和水各洗涤4次，干燥。

将0.5g IDA溶解于50ml二次水中，用1.0mol/L的Na₂CO₃溶液调节溶液的pH值为8，再加入磁性微球，超声分散5min后，在60℃下搅拌反应12h。反应完成后磁铁分离，产物用水洗至中性，干燥。获得亚氨基二乙酸修饰磁性硅胶微球（IDA-MNPs）。

1.3.2　氧氟沙星-Cu(II)配位印迹磁性微球的制备

称取亚氨基二乙酸修饰磁性硅胶微球1.0g，置于250ml三口烧瓶中，加入50ml 0.05mol/L CuSO₄溶液，常温下搅拌5h后，磁铁分离，倾去上清液，用0.02mol/L pH=6.0的磷酸盐缓冲液洗去微球表面未结合的Cu²⁺，再加入100ml乙醇、100mg氧氟沙星，超声10min，分散均匀，常温下搅拌30min。然后依次加入4ml TEOS、1ml MTES、2ml 0.1mol/L HCl，搅拌下，反应体系先在冰水浴中反应2h，然后60℃下反应18h，最后75℃下反应8h。反应完成后磁铁分离，用水、乙醇洗涤，干燥。将产物分散于甲醇-乙酸（4 : 1，体积比）的洗脱液中，搅拌5h，然后再放入洗脱溶液中超声萃取2次，以充分去除模板分子氧氟沙星，最后，洗涤，干燥，保存。得到氧氟沙星-Cu(Ⅱ)配位印迹磁性微球（MIMMs）。

1.3.3　限进介质-氧氟沙星-Cu(Ⅱ)配位印迹磁性微球的制备

准确称取1.0g氧氟沙星-Cu(Ⅱ)配位印迹磁性微球，将其分散于50ml无水甲苯中，加入5ml KH-560和1ml吡啶，在110℃下回流反应12h。经磁分离得到反应产物，洗涤，干燥。将获得产物加入到50ml 0.1mol/L的H₂SO₄溶液中，在60℃下反应12h，反应结束后，收集产物，洗涤，干燥，得到了限进介质-氧氟沙星-Cu(Ⅱ)配位印迹磁性微球（RAM-MIMMs）。

限进介质-非印迹磁性微球（NIPs）的合成方法同上，但不加入模板分子OFL-Cu(Ⅱ)。

1.4　键合实验

50mg的RAM-MIMMs、MIMMs和NIPs置于锥形瓶中，首先加入10ml 0.05mol/L CuSO₄溶液，超声吸附30min，磁铁分离，倾去上清液，用0.02mol/L pH=6.0的磷酸盐缓冲溶液充分洗去微球表面未结合的Cu²⁺，再加入5ml不同浓度（0.05～0.5mg/ml）的氧氟沙星溶液。室温下摇床振荡萃取12h。萃取完全后，磁铁分离，由HPLC进行检测萃取后各溶液中OFL的浓度。通过公式Q=V(c_o−c_e)/m可计算出平衡吸附容量Q，其中V（ml）是溶液的体积；c_o和c_e分别是溶液中OFL的初始浓度和萃取后的平衡浓度。

1.5　蛋白质吸附实验

分别称取50mg IDA-MNPs、MIMMs和RAM-MIMMs置于锥形瓶中，加入10ml 0.05mol/L CuSO₄溶液，超声吸附30min，磁铁分离，倾去上清液，用0.02mol/L pH=6.0的磷酸盐缓冲液洗去微球表面未结合的Cu²⁺，再加入5ml 0.3mg/L BSA溶液，室温下摇床振荡萃取12h，最后磁铁分离，用考马斯亮蓝G250法检测上清液中BSA的浓度。

标准曲线的绘制：取6支试管，分别加入浓度（mg/ml）为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5的BSA标准蛋白溶液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，5min后用紫外分光光度计于595nm处测定吸光度，以牛血清蛋白标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标。

分别取IDA-MNPs、MIMMs和RAM-MIMMs吸附后的上清液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，5min后于595nm测定吸光值。从标准曲线中查出相应的浓度。通过公式Q=V(c_o−c_e)/m可计算出平衡吸附容量Q，其中V是溶液的体积，ml；c_o和c_e分别是溶液中BSA的初始浓度和吸附后的平衡浓度。

1.6　奶粉中氟喹诺酮类抗生素残留的测定

称取40.0g奶粉样品置于锥形瓶中，加入50ml 2.5 %三氯乙酸-乙腈（25 : 75，体积比）溶液，混匀后，静置10min，然后加入10g无水硫酸钠，充分混匀，静置5min。然后移入离心管中以5000r/min的转速离心分离20min，提取上清液，残渣再用50ml 2.5 %三氯乙酸/乙腈溶液萃取两次，合并上清液，然后在50℃水浴中，氮吹至干，残渣用40ml pH=6.5的乙醇-水（1 : 4，体积比）溶液重溶解，置于锥形瓶中待用。

取50mg的磁性微球置于锥形瓶中，加3.0ml甲醇、水进行活化处理后，加10ml 0.05mol/L CuSO₄溶液，超声吸附30min，磁铁分离，倾去上清液，用0.02mol/L pH=6.0的磷酸盐缓冲液洗去微球表面未结合的Cu²⁺，然后加入40ml乙醇-水（1 : 4，体积比），超声萃取40min，倾去上清液，然后磁性微球依次用3.00ml四氯化碳淋洗，3.00ml 2.0%乙酸甲醇溶液洗脱，洗脱液经0.45μm的滤膜过滤后，氮气吹干，用1ml流动相重溶解，进行高效液相色谱分析。氟喹诺酮类药物的加标浓度分别为0.05mg/kg、0.1mg/kg和0.2mg/kg。

2　结果和讨论

2.1　红外光谱分析

从图1可以看出，在波数573.90cm⁻¹左右都出现了吸收峰，这是Fe-O键的特征吸收峰，证明了Fe₃O₄磁性粒子已包覆在微球内部。图中很明显可以看到波数为1085.47cm⁻¹处的吸收峰，属于Si-O-Si的伸缩振动峰。从图1看到，曲线（a）在912.32cm⁻¹处的吸收峰为C-O-C的伸缩振动峰，证明了KH-560已成功接枝在微球的表面。曲线（b）在1725.08cm⁻¹处出现了C=O伸缩振动吸收峰，2923.21cm⁻¹出现了CH₃、CH₂的CH的伸缩振动吸收峰，在1381.80cm⁻¹出现了CH₃、CH₂的CH的弯曲振动吸收峰，这说明了亚氨基二乙酸和微球表面的环氧基反应，接枝到了微球的表面。在曲线（c）中CH的弯曲振动峰加强，这是由于在印迹过程中，使用了MTES作为交联剂，使微球表面的CH₃含量增加。从曲线（d）中可以看出此处吸收峰明显增强，这是由于环氧基开环，使微球表面的-OH含量大大增加。综上所述，我们已经成功制备了限进介质-分子印迹磁性微球。

2.2　排阻蛋白质效果研究

我们利用考马斯亮蓝G250法探究了磁性微球IDA-MNPs、MIMMs和RAM-MIMMs对牛血清蛋白的吸附量。如图2所示，磁性微球IDA-MNPs对蛋白质的吸附量最大，磁性微球MIMMs对蛋白质的吸附量明显大于RAM-MIMMs，这是因为磁性微球MIMMs表面含有大量的CH₃基团，可与蛋白质发生疏水性结合，因此牛血清蛋白容易吸附在磁性微球MIMMs的表面，这不仅仅降低了生物样品的净化效果，而且堵塞了印迹空穴，不利于生物小分子的吸附。然而磁性微球RAM-MIMMs表面含有大量的OH基团，保证了蛋白质等生物大分子在吸附剂的外表面不会发生不可逆的变性和吸附，对蛋白质显示出了良好的排阻能力。

2.3　静态吸附研究

由图3可以看出，当OFL的初始浓度低于0.4mg/ml时，RAM-MIMMs、MIMMs和NIPs的吸附量均随着OFL浓度的增加而增加，当OFL的浓度高于0.4mg/ml时，吸附量趋于平衡。RAM-MIMMs、MIMMs 和 NIPs 的平衡吸附量分别是11.7mg/g、12.3mg/g和7.76mg/g。可知在相同条件下印迹磁性微球对模板分子OFL的吸附量明显高于非印迹磁性微球，这说明RAM-MIMMs和MIMMs对模板分子OFL均具有较好的吸附效果，但由图中可以看出，MIMMs对模板分子OFL的吸附量略高于RAM-MIMMs，这是因为RAM-MIMMs表面的羟基基团对模板分子产生空间位阻效应，影响了OFL分子进入印迹位点。

2.4　标准曲线

配制浓度（mg/L）分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.0的OFL、CIP和ENR标准混合溶液进行测定，得到如表1各物质的标准曲线。结果显示峰面积（y）与其浓度（c）均呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.9。

分别取浓度（mg/L）为0.05、0.10、0.20、0.50、1.0的OFL、CIP和ENR标准混合溶液，考察RAM-MIMMs的富集能力，按1.6节进行磁分散萃取，最后经高效液相色谱测定富集后溶液的浓度。

2.5　不同吸附剂对奶粉的净化和富集

图4（a）是空白和加标奶粉直接进样色谱图，图4（b）是空白奶粉分别经RAM-MIMMs、MIMMs和C18萃取后的色谱图，可以看出RAM-MIMMs作为吸附剂时可对奶粉中的复杂基质有较好的净化效果，图4（c）是加标奶粉分别经RAM-MIMMs、MIMMs和C18柱萃取后的色谱图，可知以C18 SPE柱作为吸附材料时，三种氟喹诺酮类药物都能富集到固相萃取柱上，但其净化能力较差，对目标物的富集选择效果较弱于RAM-MIMMs和MIMMs。MIMMs作为磁分散萃取吸附剂时，虽然对氟喹诺酮类药物有一定的选择性富集效果，但其容易使样品中的生物大分子沉积在微球的表面，堵塞了印迹空穴，因而其对样品的净化能力明显小于RAM-MIMMs，然而RAM-MIMMs可以在复杂基质的样品中对目标分析物有比较好的选择性富集和分离效果，因此制备的限进介质-分子印迹磁性微球作为磁分散萃取吸附剂用于在复杂基质中对氟喹诺酮类药物的富集和检测具有重要意义。

2.6　奶粉中氟喹诺酮类药物残留的测定

为了验证RAM-MIMMs磁分散萃取法和高效液相色谱检测技术在实际样品中萃取FQs的可行性，我们分别测定了三种不同加标浓度下（0.05mg/kg、0.1mg/kg和0.2mg/kg）奶粉中FQs的回收率、相对标准偏差、检出限和定量限。如表2所示，奶粉中的OFL、CIP和ENR的平均回收率分别为78.0%～90.5%，82.0%～97.0%，85.9%～101.5%，相对标准偏差在3.3%～5.8%之间，其检出限和定量限分别为1.44μg/kg和4.81μg/kg，1.82μg/kg和6.07μg/kg，1.73μg/kg和5.78μg/kg。

3　结论

本实验，基于金属配位键作用力强、能在强的极性溶剂中应用等特点，采用层层包覆和溶胶凝胶法成功地制备了亲水性OFL-Cu(Ⅱ)配位印迹磁性微球。通过排阻蛋白实验、选择性分析和与C₁₈-SPE柱的对比显示出了该材料对氧氟沙星有特异的识别作用以及较好的富集和净化效果，在最佳萃取条件下，检测了奶粉中的氟喹诺酮类药物。

参考文献

[1] Chen B, Wang WD, Huang YM. Talanta, 2012, 88: 237-243.

[2] Shen JY, Kim MR, Lee CJ , et al. Anal Chim Acta, 2004, 513(2): 451-455.

[3] Posyniak A, Zmudzki J, Semeniuk S. J Chromatogr A, 2001, 914(1-2): 89-94.

[4] Chen LG, Zhang XP, Xu Y,et al. Anal Chim Acta, 2010, 662(1): 31-38.

[5] Kaur P, Narula P, Kaur V,et al. Anal Sci, 2014, 30(5): 601-607.

基金项目：国家自然科学基金资助项目（21375032）、河北省自然科学基金项目(B2016201213)

^*通信作者：吕运开, 男, 教授, Tel : 0312-5079795, E-mail：lvyunkai@hbu.edu.cn