快速溶剂萃取法优化胡黄连提取工艺
李存满，杨晓华，王文淑
（河北科技大学河北省分析测试研究中心，石家庄 050018）
胡黄连系玄参科胡黄连属植物的干燥根茎，为常用中药。目前，已经从胡黄连中分离得到70多种化合物，主要含有环烯醚萜苷、苯乙醇苷、酚苷、葫芦烷型三萜苷等类成分[1]。其主要活性成分环烯醚萜苷类[2]，以胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ和胡黄连苷Ⅲ为主。由于胡黄连苷Ⅲ对照品不易得，而其结构中含有阿魏酰基，水解产物得阿魏酸，因此，我们以阿魏酸含量为指标间接考察胡黄连苷Ⅲ的提取工艺。
文献报道，胡黄连药材的提取方法多是以传统的浸泡、渗漉[3]、加热回流[4-6]，一般以胡黄连苷Ⅰ[6]和胡黄连苷Ⅱ[3,5]转移率为评价指标，利用高效液相色谱法[3,5]、薄层色谱扫描法[6]进行测定。但这两种提取方法的最大缺陷是耗时长。快速溶剂萃取（ASE）是一种在高温高压下萃取样品中有机成分的新方法，具有有机溶剂用量少、自动化程度高、萃取效率高、可以大大缩短样品的提取时间等特点，已被确认为美国EPA标准方法（编号3545）[7,8]。
本文利用快速溶剂萃取法对胡黄连药材进行提取，采用L9(34)正交试验，以胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ及阿魏酸含量为评价指标，利用高效液相色谱法对胡黄连药材的提取工艺进行优化。
1 实验部分
1.1 仪器
高效液相色谱仪（alliance e2695，美国Waters公司）配置二极管阵列检测器；快速溶剂自动萃取仪（AES300，美国Donex公司）。
1.2 试剂与材料
试剂：乙腈、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司），纯水（由美国Milipore 纯水系统制备），其他试剂为分析纯。
胡黄连药材（购自石家庄市神威大药房），胡黄连苷Ⅰ对照品（批号11062102，购自中国药品生物制品检定所），胡黄连苷Ⅱ对照品（批号12031501，购自中国药品生物制品检定所），阿魏酸（110773-201012，购自中国食品药品检定研究院）。
2 实验方法
2.1 色谱条件
色谱柱：SunFireTM C18 (250mm × 4.6mm, 5μm)；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；洗脱梯度：0→10min，5%→15% A；10→20min，15%→25% A；20→35min，25%→25% A；25→35min，25%→28% A；35→40min，28%→35% A；40→45min，35%→75% A；45→50min，75%→95% A；50→55min，95%→95% A；流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长264nm；进样量10μl。
2.2 不同提取方法
2.2.1 加热回流提取
精密称取胡黄连样品，约0.1g，置于50ml蒸馏瓶中，加热回流提取2次，每次加入30%（体积分数）乙醇溶液20ml，提取1h，过滤，合并两次滤液于100ml容量瓶中，并用30 %乙醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，滤液作为供试品溶液。
2.2.2 超声提取法
精密称取胡黄连样品约0.1g，置于三角瓶中，超声提取2次，每次加入30 %乙醇溶液20ml，提取时间30min，提取功率500W。过滤，合并两次提取液于100ml容量瓶中，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液作为超声提取供试品溶液。
2.2.3 ASE法
精密称取胡黄连样品0.1g左右，放入仪器样品池中，提取溶剂为30%乙醇，提取时间设置为5min，提取温度60℃，提取两次，合并两次提取液并用30 %乙醇定容至100ml，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液作为ASE法供试品溶液。
2.3 胡黄连供试品溶液的制备
称取胡黄连药材粉末约0.1g，精密称定，用快速萃取仪提取，萃取溶剂为50%（体积分数）乙醇溶液，萃取压力为1500psi（约10.3MPa），萃取温度为80℃，萃取时间为5min，循环萃取2次。提取液合并，减压浓缩，然后用乙醇定容到100ml，摇匀，该溶液作为胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ供试品溶液。从上述供试品溶液精密移取50ml溶液于烧瓶中，减压浓缩，至乙醇干，残渣用2% NaOH溶液溶解，于水浴上回流3h，放冷。分解液移入分液漏斗中，用浓盐酸调pH=3～4，用乙醚萃取3次，每次30ml，合并乙醚液，减压浓缩至干，残渣用甲醇-水（1 : 1）溶解，并定容至10ml，该溶液作为阿魏酸供试品溶液。
2.4 标准工作溶液的配制
精密称取胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ和阿魏酸对照品各10mg于10ml容量瓶中，用30%乙腈溶解并定容，配制成浓度均为1.0mg/ml的标准储备液。将标准储备液配制成混合标准溶液后，再用30 %乙腈将胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ稀释成浓度（μg/ml）均分别为5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、200.0，阿魏酸储备液稀释成浓度（μg/ml）为3.0、6.0、12.0、24.0、48.0、120.0的混合标准工作溶液。
2.5 正交试验设计
本实验选用正交试验法，采用L9(34)正交设计表分别以胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、阿魏酸含量为考察指标，对提取溶液浓度，提取次数，提取时间，提取温度4个因素进行考察，每个因素选取3 水平（表1），采用正交试验评价指标优选其最佳提取工艺。综合评分各指标权重见表2。
表1 正交试验因素与水平表
表2 胡黄连提取工艺综合评分指标
3 结果与讨论
3.1 提取方法选择
本实验以胡黄连中胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、阿魏酸含量为考察指标，对加热回流提取法，超声波提取法，ASE法三种提取方法进行比较。结果发现，ASE法提取效率明显高于前两种方法，且该方法提取时间大大缩短，提取过程仅约20min即完成。因此，本实验采用ASE法作为胡黄连药材的提取方法。
3.2 提取条件优化
3.2.1 正交实验分析结果
分别准确称取胡黄连样品9份，每份约0.1g，按表1正交试验设计进行提取，分别以胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ和阿魏酸含量为评价指标，考察各因素对胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ和阿魏酸提取效率的影响，从而筛选出最佳提取工艺。测定结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 正交实验结果表
表4 方差分析结果表
3.2.2 正交实验结果分析
方差分析和直观分析结果表明，以胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ和阿魏酸含量的综合评分作为考察指标，最佳提取条件为A2B2C1D3，各因素作用主次为B＞A＞D＞C。因此，得到最佳提取条件为：提取浓度为50%乙醇，提取2次，提取温度为80℃，提取时间为5min。
3.2.3 最佳条件验证实验
为了验证最佳提取条件，选用平行试验法，做两组平行试验。
验证供试品溶液的制备：分别称取胡黄连样品约0.1g，按上述最佳提取条件，按2.3操作制备得胡黄连供试品溶液。在2.1色谱条件下，进行测定。结果见表5。
表5 验证实验结果表
分别以胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、阿魏酸含量为考察指标，在最佳提取条件下，验证供试品中三指标含量均大于正交实验条件下的测得的样品含量，因此，此条件即为最佳提取条件。
4 结论
ASE法提取时间短，稳定、可行，提取效率高，可作为胡黄连的提取工艺。
参考文献
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