气相色谱法同时测定稻谷中10种有机磷农药残留量方法的探讨
忻雪1，张霞1，李万军1，高虹1，徐波1，李雅莲1，程兴杰1，戴志桐2
（1．沈阳市粮油检验监测所 110021；2．中国物流集团前进国家粮食储备库 110045）
有机磷农药作为一类广谱、高效的杀虫剂、除草剂、杀菌剂，正在广泛用于农业、仓储等领域，虽然具有杀虫、杀菌效率高、易分解、对植物药害小等优点，但大量使用后对人、蓄和环境产生的危害也在日益增加。绝大多数的有机磷农药是剧毒的，经过皮肤、呼吸道及胃肠进入人体后，对体内胆碱酯酶的活性产生抑制，不能催化水解乙酰胆碱，使其在体内蓄积，致使神经处于兴奋而产生中毒。目前各国都在投入大量的人力、物力、财力，加强无公害绿色农药的研制、开发和应用，并且制定愈来愈严格的农药残留限量标准来控制其残留，使粮食及食品的质量安全得到了保证。因此加强对粮食中有机磷农药检测方法的研究，对保护生态环境和人类健康具有重要意义。
国家标准第GB/T5009.20—2003《粮食中有机磷农药残留量的测定》给出了两种方法，都是用气相色谱火焰光度检测器测定，第一种方法主要适用蔬菜水果的检测，第二种方法主要适用谷物的检测，而第二种方法只能检测敌敌畏、乐果、马拉硫磷、对硫磷等8种有机磷农药，还有一些农业上常用的有机磷农药没有包含其中，如沈阳地区农民常用的毒死蜱等有机磷农药不在GB/T 5009.20—2003方法中，如需检测还要采用GB/T5009.145—2003《植物性食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定》，而该方法中使用的是氮磷检测器。由于氮磷检测器调试到稳定状态需要时间较长，虽然其灵敏度较高，但稳定性较差，且检测器主要部件会随时间的增加会钝化，容易产生误差，而且需要不断更换，增加检测成本，因此应用受到限制。在样品的前处理上，由于检验标准出台较早，三种方法检测组分的提取净化也存在许多不足，一是需用较多的有机试剂，对环境和实验操作人员的健康带来危害。二是有机试剂要通过旋转蒸发器蒸发浓缩，浓缩后残留的杂质得到了富集，对组分分析产生干扰较大，色谱图出现杂峰，污染色谱柱，减少色谱柱使用寿命。三是提取净化需要时间较长，处理环节较多，易造成目标物的流失，降低回收率，并增加了检验员的劳动强度较大。
本文研究了用气相色谱火焰光度检测器同时分析10种有机磷农药的方法，样品利用二氯甲烷提取后，采用离心机离心，经过0.45µm有机滤膜过滤，用商品固相萃取小柱（碳铵柱CARB/NH2）进行色谱分离净化，再经氮吹仪浓缩近干，最后用丙酮定容到1ml，选择分离效果最佳的0.32mm×30m，膜厚df=0.25µm的中等极性的毛细管柱进样分析。
1 实验部分
1.1 主要仪器、试剂、实验样品
（1）仪器 气相色谱仪：GC-2010，附带FPD检测器，日本岛津公司；氮吹仪：MultiVap-8平行浓缩仪，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；CARB/NH2固相萃取柱：500mg/500mg/6ml。
（2）试剂 二氯甲烷，正己烷，丙酮，分析纯；丙酮，色谱纯；
农药标准品：敌敌畏、甲拌磷、乐果、甲基嘧啶磷、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟松、对硫磷、喹硫磷、乙硫磷纯度均大于99%，北京坛墨质检科技有限公司。
（3）实验样品 稻谷，沈阳市地产。
1.2 色谱条件
色谱柱：Rtx-1701（长度30m，内径0.32mm，膜厚0.25µm）；进样口温度：240℃；检测器温度：270℃；柱温：初温90℃，保持2min后以15℃/min的程序升温至160℃，保持5min后再以25℃/min的程序升温至270℃，保持6min；载气：高纯氮气；氢气流量：85ml/min；空气流量：90ml/min；进样方式：无分流；进样量：1.0μl。
1.3 样品前处理
将稻谷试样脱壳、磨粉，过20目筛，混匀，备用。称取试样10g置于100ml具塞三角瓶中，加入20ml二氯甲烷，于振荡器上振摇0.5h，将上清液放入离心管中，以10000r/min离心10min。经过0.45µm有机滤膜过滤后，用固相萃取柱进行色谱分离净化，净化前用5ml正己烷活化固相萃取柱，待填料层上方保留约1mm正己烷液层时，再加入2ml二氯甲烷平衡液，待填料层上方保留约1mm二氯甲烷液层时，准确吸取过滤后试样液1ml于小柱中，待填料层上方保留约1mm试样液时，先用1ml丙酮-正己烷（30 : 70）洗脱，洗脱液弃去，再用6ml丙酮-正己烷（30 : 70）继续洗脱，收集6ml的洗脱液于蒸馏瓶中，于氮吹仪上35℃浓缩近干，用色谱纯丙酮定容至1.0ml，待测。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择
色谱柱、温度、载气流量是影响气相色谱分离效果、分析时间及灵敏度的主要因素。为了既能把待测组分完全分离，又能缩短分析时间，提高分析效率，柱温采用程序升温、载气采用恒线速度方式，同时比较了Rtx-1701毛细管色谱柱及HP-1毛细管色谱柱，结果表明Rtx-1701毛细管色谱柱对10种有机磷的分离效果较好，在18min内能有效地分离10种有机磷，且分离效果及峰形均能满足方法要求，结果见图1。
图1 稻谷中10种有机磷分离效果图
1—敌敌畏；2—甲拌磷；3—乐果；4—甲基嘧啶磷；5—毒死蜱；6—马拉硫磷；7—杀螟松；8—对硫磷；9—喹硫磷；10—乙硫磷
2.2 线性方程、相关系数及检出限
按最佳的色谱条件测定含有敌敌畏等10种有机磷的混合标准溶液三个系列，计算峰面积，求得线性回归方程及相关系数。并以大于仪器的3倍噪声计算出该方法的最低检出限。结果见表1。
表1 10种有机磷的线性方程、相关系数及检出限
2.3 净化条件的选择
2.3.1 洗脱液比例的选择
准备5个固相萃取柱，先用5ml正己烷活化固相萃取柱，再用2ml二氯甲烷平衡固相萃取柱，加入1ml的加标试样液（样品提取见1.3），选择10ml丙酮和正己烷比例分别为1 : 9、2 : 8、3 : 7、4 : 6、5 : 5的混合液作为洗脱液，收集洗脱液于浓缩瓶中，于氮吹仪上35℃浓缩近干，用色谱纯丙酮定容至1.0ml，上机测定，色谱结果见图2。
图2 五种不同比例洗脱液洗脱效果色谱图
由上至下，丙酮和正己烷的比例分别为1 : 9、2 : 8、3 : 7、4 : 6、5 : 5
由图2可以看出，从杂峰和已知样品的响应值来看，丙酮和正己烷比例为3 : 7时，洗脱效果最好，回收最佳；丙酮和正己烷比例为4 : 6和5 : 5时，由于洗脱液极性较强，将固相萃取柱上的一部分色素和脂肪洗脱下来，长期实验将会污染毛细管色谱柱，减少毛细管色谱柱使用寿命；当丙酮和正己烷比例为1 : 9和2 : 8时，虽然色素和脂肪基本保留在固相萃取柱上，但是回收效果不佳。所以最后选择丙酮和正己烷比例为3 : 7的洗脱液。
2.3.2 洗脱液体积的确定
在2.3.1节中确定了洗脱液比例的浓度，为了缩短洗脱时间及避免色素和脂肪的流出，对洗脱液的体积进行了试验。将1ml的上样液，及10ml洗脱液每1ml收集在一个浓缩瓶中，共11个浓缩瓶，于氮吹仪上35℃浓缩近干，用色谱纯丙酮定容至1.0ml，上机测定。结果见表2。
表2 洗脱液体积的确定（按峰面积计算）
参照值为样品中添加浓度为系列2（见表1）时的峰面积值
由表2可以看出，当洗脱液体积在2～7ml之间，敌敌畏等10种农药可以完全洗脱下来。色谱和脂肪基本都保留在固相萃取柱上，减少杂峰，缩短洗脱时间。所以在洗脱时，先用1ml的洗脱液洗脱，洗脱液弃去，再用6ml洗脱液洗脱并收集。
2.4 方法回收率测定结果
在未检出有机磷的稻谷样品中添加高、低两种不同浓度的混合有机磷标准溶液，充分混匀后按1.3节中进行样品前处理，上机测定，每个添加浓度测定6次，计算回收率及RSD值。
通过表3可以看出，回收率在75.5%～109.5%，RSD值在1.9%～9.5%，均能满足检验要求。
表3 方法回收率及RSD值（n =6）
2.5 结论
本文采用Rtx-1701毛细管色谱柱及在前处理中通过固相萃取柱对样品进行净化，可以同时测定稻谷中10种有机磷农药，标准曲线线性良好，色谱图的干扰少且分离效果好，方法的最低检出限及较高的回收率，完全能够满足食品中农药残留卫生标准的要求[1]，分析速度快，操作简便，可以适用于粮食中多种有机磷农药残留的同时测定。
参考文献
[1] GB 2763—2014, 食品中农药残留最大限量。