4 分子印迹快速检测技术
4.1 分子印迹技术的原理及其分类
4.1.1 分子印迹技术的原理
分子印迹又称为分子烙印（molecular imprinting），属超分子化学范畴，是源于高分子化学、生物化学、材料科学等学科的一门交叉学科。分子印迹技术（molecular imprinting technique，MIT）是指制备对某一特定的目标分子（模板分子，印迹分子或烙印分子）具有特异选择性的分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）的过程。它的起源可以追溯到20世纪40年代，著名的诺贝尔奖获得者Pauling（1940）提出以抗原为模板来合成抗体理论，为分子印迹发展奠定了一定的理论基础。1949年，Dickey首先实现了染料在硅胶中的印迹并提出“分子印迹”的概念。1972年德国科学家Wulff研究小组首次成功制备出对糖类化合物有较高选择性的共价型的分子印迹聚合物，使这方面的研究产生了突破性进展。随着1993年Mosbach研究小组创立了非共价型分子印迹聚合物制备方法（Vlatakis等，1993），分子印迹技术引起了世界瞩目并迅速发展，成为了化学和生物学交叉的新兴领域之一。
分子印迹技术被形象地描述为“分子钥匙”和“人工锁”的匹配过程，通常分为三个阶段来实现分子的识别过程。第一阶段，在功能单体和模板分子之间制备出共价的配合物或形成非共价的加成产物；第二阶段则是对这种单体-模板配合物进行聚合；第三阶段将模板分子从聚合物中除去。在第一阶段中，功能单体和模板分子之间可通过共价键或通过处于相近位置的非共价键相互结合。第二阶段中，配合物被冻结在高分子的三维网格内，而由功能单体所衍生的功能残基则按与模板互补方式而拓扑地布置于其中。在第三阶段，将模板分子从聚合物中除去，于是在高聚物内，原来由模板分子所占有的空间形成了一个遗留的空腔。在合适的条件下，这一空腔可以满意地“记住”模板的结构﹑尺寸以及其他的物化性质，并能有效而有选择性地去键合模板（或类似物）分子。具体原理如图4-1所示。
图4-1 分子印迹过程的原理（Alexander等，2006）
A是可逆的共价键，B是模板剪切后活化的共价基团，C是静电作用，D为输水作用力或分子间作用力，E为形成的配位键。这些都是与模板的互补的基团或结构形成的作用力，为分子印迹的特异选择性做出贡献（a～e）
4.1.2 分子印迹技术的分类
根据模板分子同聚合物单体的官能团之间作用形式不同，分子印迹技术主要分为共价法、非共价法、半共价法和金属螯合法四类。
4.1.2.1 共价法
共价法又称为预先组织法，其过程是模板分子与功能单体之间通过共价键结合，然后通过交联剂聚合后再用化学方法打断与模板分子连接的共价键，最后将模板分子洗脱出来，即可得到对模板分子具有特异性识别能力的聚合物。共价印迹包括容易发生可逆反应的MIP，通过形成硼酸酯、席夫碱、缩醛、酯或螯合物实现联结。具有强共价印迹作用的MIP要依赖更强的酯键才能获得，需专一试剂处理或通过水解才能除去模板。因此，共价法所得的复合物较稳定，选择性也相对强于非共价法。但由于共价键作用力较强，模板分子自组装和识别过程中结合和解离的速度较慢，难以达到热力学平衡，不适宜快速识别。此外，其烦琐的印迹和浸提过程也制约了它的应用。
硼酸酯联结法是具代表性的共价印迹法。利用硼酸基和邻二醇基能够较快地形成稳定的硼酸酯，这一联结点呈五元环结构，其刚性有利于固定模板-功能单体偶联物的构象；而且，该联结点较易于通过水解来断裂。以4-乙烯基苯硼酸为功能单体，α-D-吡喃甘露糖苷为模板分子，经过缩合反应可形成共价复合物，通过交联聚合得到聚合物，经磨碎后用甲醇和水混合溶剂水解处理以除去模板，获得留有两个硼酸基团的印迹孔穴，形成具有特异性识别模板分子的手性MIP，可用于拆分模板分子的外消旋混合体（郭逸蓉，2010）。
除了硼酸酯类外，目前常用的能进行可逆共价联结体系仅局限于席夫碱（Wulff，1982）、乙缩醛/缩酮（Shea等，1986），但这两个联结体的键合过程都比较缓慢，限制了其适用范围（Marty等，2005）；而且，由于这些模板-功能单体共价复合物对水敏感，不能用悬浮聚合和乳液聚合的方式进行印迹制备。因此，共价型印迹法的应用领域相对狭窄，发展较为缓慢。
4.1.2.2 非共价法
非共价法，也称为自组装法，其过程是模板分子与功能单体和交联剂混合，通过非共价键结合在一起，制成具有多重作用位点的分子印迹聚合物（Mayes等，2005）。这些非共价键包括离子键、氢键、金属配位键电荷转移、疏水作用以及范德华力等，其中以氢键应用最为广泛（Siemann等，1996）。由于非共价作用的多样性，在印迹过程中可同时使用多种功能单体，以及用简单的萃取法便可去除模板分子等特点，使得非共价法比共价法适用性更强。但是该方法也有一些不足之处，比如为了使模板和单体的特异作用最大化，通常实验者要摸索很多条件来减少非特异性作用，且不同的模板需要采用的合成细节不同，使合成变得困难。
4.1.2.3 半共价法
该方法是将共价聚合和非共价聚合的方法结合起来制备分子印迹聚合物的方法，又被称为“牺牲空间法”。该方法中，首先功能单体通过共价键与模板分子形成主客体配合物，然后再通过与交联剂的共聚作用形成的分子印迹聚合物，通过一定方法除去模板分子后，形成的印迹聚合物对模板分子的再次吸附不是通过共价键作用，而是通过非共价键作用，这样就大大提高了印迹聚合物对模板分子的结合和释放速度，同时制备条件也相应放宽，它结合了共价法产物的稳定性和各成分比例的恒定与非共价法印迹的高的动力学特点，应用广泛。
4.1.2.4 金属螯合法
金属螯合作用又称配位作用或络合作用，通过含不饱和轨道的金属（特别是过渡金属）在外部配位层接受配位体上杂原子（如N、O、S）的孤对电子而形成。金属螯合法是利用生物分子与金属离子之间的螯合作用螯合为复合体，通过聚合反应将复合体固定在聚合物中，通过一定条件的抽提将模板分子除去。金属螯合印迹中，金属与配体之间的配位作用相对非共价键有足够的稳定性，同时具有高度的分离因子和立体选择性，可以通过环境条件的改变来控制配位键之间的结合与断裂速度。金属离子一方面可以自身作为模板，利用其与功能单体配位原子之间的配位作用实现金属离子自身的印迹；另一方面，可以利用金属离子作为功能单体的组成部分，促成能与金属离子形成配位键的分子（如生物大分子）的印迹。自20世纪70年代，日本学者Nishide等（1977）首次报道了金属离子印迹的螯合树脂后，已有过渡金属离子、重金属离子以及金属配合物如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Cd2+、Fe3+、Pb2+等（Dhruv等，2009；Singh等，2010；Farid等，2012；Mohammad等，2013；Barciela-Alonso等，2014），被用作为模板分子而成功制备出了金属离子印迹聚合物。以金属离子调控的印迹法是利用金属配位作用同时联结模板分子和功能单体进行印迹聚合物的制备，该印迹的复合体一般包括：模板分子-金属离子-可聚合的配位体。众多研究表明，这类金属配位复合体的引入明显增强了模板分子与功能单体的相互作用，从而提高了有机化合物（特别是多肽类、糖类、血清蛋白等生物分子）MIP的印迹效率和识别选择性（Li等，2009；Chou等，2009）。