3　免疫学快速检测技术

3.1　抗原与抗体

3.1.1　抗原

3.1.1.1　抗原的定义和分类

（1）定义　抗原（antigen）是指进入动物体内能刺激其免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内或体外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应的物质。由此可见，抗原具有两种性质：一种是刺激机体产生免疫反应，称为免疫原性（immunogenicity），具有这种能力的物质称为免疫原（immunogen）；另一种是与免疫反应产物发生特异性结合，称为免疫反应性（immunoreactivity）。兼有免疫原性和免疫反应性的抗原是完全抗原（complete antigen）；而有些物质，例如某些激素、药物等，单独存在时只有免疫反应性而无免疫原性，被称为半抗原（hapten）。半抗原必须经过改造后才会具有免疫原性。一般来说，具有免疫原性的物质，必然具有免疫反应性；但具有免疫反应性的物质不一定具有免疫原性。

（2）分类　抗原的种类非常多，可以根据来源、化学成分、理化性质以及亲缘关系等来进行分类。

根据来源，通常可将抗原分成三类：天然抗原、人工抗原和合成抗原。天然抗原是指天然的生物、细胞及天然产物，例如细菌、病毒，以及各种蛋白质、多糖、脂类、核酸等都可以是天然抗原。人工抗原是指经过化学改性的天然抗原，例如碘化蛋白、半抗原结合蛋白等就是人工抗原。合成抗原是指化学合成的具有抗原性质的分子，主要是氨基酸的聚合物，只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽，如由左旋赖氨酸形成的同聚多肽（PLL）。由二种或二种以上氨基酸形成的聚合多肽称为共聚多肽，如由酪氨酸、谷氨酸与多聚丙氨酸和赖氨酸组成的聚合成多肽（T、G）-AL。应用这种人工合成多肽可研究氨基酸种类、序列与蛋白质抗原性及免疫原性的关系，也可研究机体遗传性与免疫性的关系。

根据抗原的化学成分，可分为蛋白质、脂蛋白、多糖体、糖蛋白、多肽以及核蛋白等（见表3-1）。

根据抗原的水溶性，可分为不溶于水的颗粒抗原和可溶性胶体抗原。例如细菌的鞭毛、纤毛和完整的微生物菌体等都是颗粒抗原；而蛋白质、多糖、DNA和真菌毒素等都是可溶性胶体抗原。一般颗粒抗原的免疫原性大于可溶性胶体抗原的免疫原性。在可溶性胶体抗原中以蛋白质的免疫原性最强，其次是多糖和DNA，真菌毒素等小分子物质属于半抗原，没有免疫原性，必须和大分子物质（如蛋白质）结合后才具有全抗原的性质。

根据抗原与机体的亲缘关系还可将抗原分为自身抗原（autoantigen）、同种型抗原（isoantigen）和异种抗原。自身抗原是指抗原来自免疫动物自身。在正常情况下，免疫系统是不会对自身抗原产生免疫应答的，但在病理情况下，由于自身抗原暴露或自身抗原结构发生了改变，或者机体免疫系统本身发生异常，免疫系统将自身物质当作抗原性异物来识别，诱发自身免疫应答，引起自身免疫疾病。同种型抗原是指抗原来自同种动物的不同个体。这些个体在遗传上有所不同，个体间的抗原性存在差异，来自一个个体的抗原能够刺激同种的其他个体产生免疫应答。典型者如ASO血型抗原和组织相容性抗原，后者是引起移植物排斥的主要原因。异种抗原是指来自和免疫动物不同物种的抗原。通常情况下，异种抗原的免疫原性比较强，容易引起较强的免疫应答。前面所述的微生物菌体及其所产生的蛋白质、多糖等都属于异种抗原。

此外，根据抗原物质在激发免疫系统时有不同的淋巴细胞参与，又可分为胸腺依赖性抗原和非胸腺依赖性抗原。

3.1.1.2　抗原的性质

（1）免疫原性　免疫原性是完全抗原的一个非常重要的性质之一。一种抗原的免疫原性一般取决于三个方面的因素：抗原自身的结构与性质、宿主的反应性和免疫的方式与条件。

在抗原的结构和性质方面，包括抗原的异质性、分子量大小、空间结构、分子表面电荷以及光学构型等。抗原的异质性是指在免疫功能正常条件下，只有异种或同种异体的免疫原性物质才能诱导宿主产生正常的免疫应答。一般地，抗原物质的来源和宿主的亲缘关系越远，组织结构差异越大，免疫原性越强。例如，鸭血清蛋白质对鸡是弱抗原，而对家兔则是强抗原。另外应注意的是，在进行半抗原制备完全抗原时，载体（与半抗原结合后形成完全抗原的大分子物质，一般为蛋白质）的选择要有较大的种属差异。例如植物激素分子与兔血清蛋白结合后，再用于免疫兔就很难有免疫原性，因此，一般用牛血清白蛋白（BSA）或人血清白蛋白（HAS）作为载体用于免疫兔或鼠，由于种属差异大，免疫原性就强。

分子质量大小也是影响抗原免疫原性的一个重要因素。具有免疫原性的抗原物质，其分子质量通常在10kDa以上。如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。分子质量越大，其表面积相应增大，接触免疫系统细胞的机会增多，且排除缓慢，故其免疫原性就增强。而分子质量小于10kDa者呈弱免疫原性，低于4kDa者一般不具有免疫原性。分子质量在4～10kDa之间的免疫原性依分子结构的复杂程度而定，这是一般规律。但也有例外，如分子质量高达100kDa的明胶比分子质量仅为5.734kDa的胰岛素的免疫原性还要差。现已知分子质量最小的抗原是人工合成的，其分子质量为400Da。一般来说，分子质量越大，其免疫原性就越强。

抗原的结构，特别是空间结构对免疫原性的影响很大。即使是相同的物质构成或是具有相同的分子质量，但由于其空间结构不一样，其免疫原性都会有很大的差异。直链结构的物质一般缺乏免疫原性，多支链或环状结构的物质容易成为免疫原，球形分子比线性分子的免疫原性强。例如，上述明胶正因为缺乏环状集团和分支的线性分子，所以尽管分子质量大，但是免疫原性微弱。还有实验证明，蛋白质抗原分子中，α-螺旋有利于增强免疫原性，而且，只有当寡聚肽达到足以形成α-螺旋构型时，才有免疫原性。

分子表面电荷对其免疫原性也有一定的影响。实验表明，带正电荷的碱性抗原，是极好的免疫原，而带负电荷的酸性物质则较差。这可能是因为淋巴细胞表面带有负电荷，因此，带正电荷的抗原有利于非特异性地吸附到这些细胞的细胞膜上，从而更好地刺激免疫系统产生抗体。另外，抗原的净电荷与由它引起的抗体的净电荷有相反的关系。因此，若抗原是酸性的，则抗体是碱性的，反之亦然，这样的现象有利于抗原、抗体的紧密结合。

抗原的光学结构对其免疫原性也有很大影响。应用合成多肽抗原来研究光学构型对免疫原性的影响，结果发现D-氨基酸聚合体的免疫原性低于相应的L-异构体。将L-氨基酸连接到由D-氨基酸组成的合成大分子的外部时，它变成了一个很好的免疫原。相反地，以L-氨基酸为主的大分子，在它的侧链末端接有D-氨基酸时，则是一个很弱的免疫原。D-氨基酸聚合体的弱免疫原性，可能与它们的不完全代谢和在动物体内长时间的滞留有关。

宿主的反应性和免疫方式也影响着抗原的免疫原性。宿主的个体发育、生理状态和遗传特性等都对免疫原性有很大影响。所以不同种动物，甚至同种动物的不同个体对同一抗原的免疫均有差异。例如应用人工合成抗原二硝基苯-多聚左旋赖氨酸（DNP-poly-L-L）对荷兰猪品系2（GP strain 2）可以引起应答，而对品系13（GP strain 13）则不能引起应答。这充分证明个体遗传性对免疫应答的控制作用。在20世纪70年代Mc Devitt等应用人工合成抗原在近交系小鼠体内发现了控制免疫应答的基因座（immuneresponslocus）定位于H-2复合体的Ⅰ区，称此基因为免疫应答基因-1（immune response，Ⅰr-1）。另外，免疫方式，即免疫动物的机体与抗原的相互作用方式对抗原的免疫应答也有很大影响，主要包括抗原的进入途径、剂量、次数、时间间隔以及有无佐剂等。

总之，抗原的免疫原性除了取决于自身的结构与组成之外，还与免疫动物的生理状态和免疫方式等有着密切的关系。

（2）特异性　抗原的特异性表现在两个方面：在免疫原性上，一种抗原只能诱发一种特异的免疫应答，结果形成特异性抗体或致敏淋巴细胞。在免疫反应性上，抗原只能与抗原诱导产生的特异性抗体或致敏淋巴细胞进行反应。抗原的这种特异性取决于其自身的抗原决定簇（antigenic determinant）。抗原决定簇，也称表位（epitope），是指抗原性物质表面具有一定组成和结构的特殊化学基团。它能与相应的淋巴细胞结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。同时，抗原也是通过抗原决定簇与相应的抗体进行特异性结合的。因此，抗原决定簇是免疫应答和免疫反应具有特异性的物质基础。

一个抗原分子可以含有一个或多个不同的抗原决定簇。每一个决定簇可刺激机体产生一种对应的特异性抗体。例如，牛血清蛋白分子上含有18个抗原决定簇，其刺激产生的抗血清中应含有针对该抗原18种决定簇的特异性抗体。当抗原与一个抗体分子结合后，该抗原含有的其他决定簇还可以与另外相应的抗体结合。

抗原-抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原-抗体反应具有高度的特异性。但这种特异性也不是绝对的，当两种抗原之间含有相同或相似的抗原决定簇时，可能会发生交叉反应（cross reaction），即抗原（或抗体）除与相应抗体（或抗原）发生特异性反应外，还与其他抗体（或抗原）发生反应。例如：绒毛膜促性腺激素（hCG）和黄体生成激素（LH）均由α和β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体，抗α-hCG抗体将与LH中的α酶发生交叉反应。故交叉反应的强弱严重影响着免疫检测的准确性，应予以重视。

3.1.2　抗体

3.1.2.1　抗体的定义与分类

（1）定义　抗体（antibody）是在抗原刺激下产生的，并能与之特异性结合的免疫球蛋白。抗体在体内存在的形式有许多种。抗体是由B细胞系的细胞所产生的，存在于组织液、淋巴液、血液和脑脊髓液等体液中，另外，抗体还存在于某些细胞，例如B淋巴细胞的膜上。抗体的化学本质是免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。

（2）分类　Ig包括很多种类，根据Ig的理化特性和与抗原结合方式的不同，可以将其分为类和亚类。例如，人类的Ig可以分为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE五大类，其中IgG和IgA分别可进一步分为IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄和IgA₁、IgA₂亚类。IgG是Ig中主要的组成部分，约占血清总蛋白量的15％。应用于免疫学检测中的抗体主要是IgG和IgM，以IgG最为常用。

3.1.2.2　结构

Ig的基本结构是由一对较长的多肽链和一对较短的多肽链组成的。前者称为重链（heavy chain，H链）；后者称为轻链（light chain，L链）。重链约含450个氨基酸，分子质量约为50kDa；轻链约含214个氨基酸，分子质量约为25kDa。Ig除了含氨基酸外，还含有糖类，所以Ig属于糖蛋白。Ig的重链与轻链之间通过二硫键连接，呈Y字形。Ig的轻链是相同的，有κ和λ两种类型。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。

在多肽链的氨基酸（N端），轻链的1/2和重链的1/4或1/5这两段的氨基酸排列顺序随抗体特异性不同而有所变化，因此称为可变区（variable region，V区）近羧基端（C端）轻链的其余1/2和重链的3/4或4/5的氨基酸排列顺序和糖的含量比较稳定，因此称为恒定区（constant region，C区）。在轻链和重链的V区中分别有三个区域的氨基酸种类和排列顺序变化最大，这些区域被称为超变区（hypervariable region）。超变区可形成与所结合抗原结构互补的三维平面，是免疫球蛋白与抗原决定簇特异性结合的关键位置。V区的其余部分相对保守，称为支架区（framework region），其结构较稳定。

另外，不同种类Ig的存在形式不同，如IgG、IgE、IgD以上述抗体单体的形式存在，而IgM和IgA则通常由多个抗体单体组成。IgM是由5个抗体单体通过J链（joining chain）连接在一起的五聚体，而IgA则是二聚体、三聚体甚至四聚体。每个抗体单体有两个抗原结合位点，如果将一个结合位点称为一价，那么IgG、IgE、IgD都是二价抗体，而IgM是十价抗体。