4.5 实验内容
4.5.1 荧光分析法测定水杨酸含量
实验目的
（1）掌握荧光分析法测定水杨酸含量的原理和方法；
（2）进一步熟悉荧光分光光度计的基本操作。
实验原理
邻羟基苯甲酸（亦称水杨酸），含有一个能发射荧光的苯环，在pH=12的碱性溶液和pH=5.5的近中性溶液中，310nm附近紫外光的激发下会发射荧光；而且pH=5.5的近中性溶液中邻羟基苯甲酸因羟基与羧基形成分子内氢键，增加了分子刚性而有较强荧光。利用此性质，在pH=5.5时测定邻羟基苯甲酸的荧光强度，已有研究表明水杨酸的浓度在0～12μg/mL范围内均与其荧光强度呈良好的线性关系。
仪器与试剂
（1）仪器 荧光分光光度计；石英皿；容量瓶；移液管；比色管。
（2）试剂 邻羟基苯甲酸标准溶液［60μg/mL（水溶液）］；HAc-NaAc缓冲溶液（47g NaAc和6g冰醋酸溶于水并稀释至1L得到pH=5.5的缓冲溶液）；0.1mol/L NaOH溶液。
实验步骤
（1）邻羟基苯甲酸标准溶液的配制 分别移取0.40mL、0.80mL、1.20mL、1.60mL、2.00mL邻羟基苯甲酸标准溶液于已编号的10mL比色管中，再分别加入1.0mL pH=5.5的HAc-NaAc缓冲溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。
（2）确定最大发射波长和激发波长 选取羟基苯甲酸标准溶液中浓度适中的溶液来测定其激发光谱和发射光谱。先固定发射波长为400nm，在250～350nm区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长λex；再固定最大激发波长λex，在350～500nm区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长λem。
（3）鉴定未知溶液 确定待测样品的pH值，如pH值不在5.5附近，通过加入适量的酸、碱或缓冲溶液调整溶液的pH值为5.5。根据上述激发光谱和发射光谱的扫描结果，在所确定激发波长和发射波长处，测量待测样品的荧光强度。
（4）标准溶液荧光强度的测定 设置上述实验所确定的最大发射波长λem和最大激发波长λex，在此组波长下测定上述各标准系列溶液的荧光强度。以溶液荧光强度为纵坐标，以溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。根据所测得的未知溶液的荧光强度在标准曲线上确定邻羟基苯甲酸的浓度。
数据处理
（1）最大发射波长和激发波长的确定记录如下。
（2）邻羟基苯甲酸标准溶液和样品荧光强度的测定记录如下。
（3）以各标准溶液的荧光强度为纵坐标，分别以邻羟基苯甲酸的浓度为横坐标作标准曲线。
思考题
（1）pH=5.5时，邻羟基苯甲酸（
=3.00，
=12.83）和间羟基苯甲酸（=4.05，=9.85）水溶液中主要存在的酸、碱形式是什么？为什么二者的荧光性质不同？
（2）从本实验中总结出几条影响物质荧光强度的因素。
4.5.2 荧光法测定复合维生素中维生素B2的含量
实验目的
（1）掌握荧光法测定复合维生素制剂中维生素B2的含量（标准曲线法）。
（2）熟悉荧光光度计的使用方法。
实验原理
维生素B2（C17H20N4O6，分子量376.37，又称核黄素）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：
由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2溶液在400～460nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近维生素B2，在pH为6～7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。而维生素B2在碱性溶液中经光照非常易于分解，故测定维生素B2的荧光强度需在酸性条件下，且避光。
在酸性条件下的维生素B2稀溶液中，荧光强度F与维生素B2的浓度c有以下关系：
F=2.303ΦI0εbc
在一定的实验条件下，当荧光量子产率（Φ）、入射光强度（I0）、物质的摩尔吸光系数（ε）和液层厚度（b）固定不变时，荧光强度（F）与荧光物质的浓度（c）呈如下线性关系：
F=Kc
这是荧光光谱法定量分析的依据。
仪器与试剂
（1）仪器 RF-5301PC型荧光光度计（岛津）；石英皿：1cm；容量瓶：50mL。
（2）试剂 10.0μg/mL维生素B2标准溶液（称取10.00mg维生素B2置100mL烧杯中，加1%乙酸溶液使其溶解，并定量转移1000mL容量瓶中，并用1%乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，将溶液保存在冷暗处）；1%乙酸溶液。
实验步骤
（1）系列标准溶液的制备 取维生素B2标准溶液（10.0μg/mL）1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL及5.00mL，分别置于50mL容量瓶中，各加1%乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，待测。
（2）待测样品溶液的制备 取维生素B2 10片，研细，精密称取适量（约相当维生素B210mg）置于100mL烧杯中，加1%乙酸溶液使其溶解，定量转移至1000mL的容量瓶中，用1%乙酸稀释至刻度，摇匀。过滤，弃去初滤液，吸取续滤液2.0mL于100mL容量瓶中，用1%乙酸溶液稀释至刻度，摇匀，待测。
（3）确定最大激发波长和发射波长 选取维生素B2标准溶液中浓度适中的溶液来测定其激发光谱和发射光谱。先固定发射波长为540nm，在220～500nm区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长λem；再固定最大激发波长440nm，在400～600nm区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长λex。
（4）标准溶液及样品溶液荧光的测定 将激发波长固定在440nm，荧光发射波长为540nm，测量上述系列标准维生素B2溶液的荧光发射强度。以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。
在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度，计算药片中维生素B2的含量。
数据处理
（1）激发光谱和荧光发射光谱绘制过程中实验数据记录。
（2）标准溶液及待测溶液的浓度和荧光强度。
（3）以系列标准溶液的荧光发射强度F为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作维生素B2溶液浓度c的标准曲线，从标准曲线上查得未知维生素B2的质量（μg），然后根据样品称量m，按下式计算复合维生素B中含维生素B2的标示量。
（4-2）
思考题
（1）解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？
（2）维生素B2在pH为6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？
4.5.3 荧光法测定硫酸奎宁的含量
实验目的
（1）掌握荧光法定量测定奎宁含量的原理与方法
（2）探究溶液的pH值和卤化物对奎宁荧光强度的影响。
（3）进一步熟悉荧光分光光度计的基本操作
实验原理
硫酸奎宁［分子式（C20H24N2O2O2）2·H2SO4·2H2O，分子量782.96］为抗疟药，是硫酸奎尼丁的光学异抗体，其结构如下：
奎宁在稀硫酸溶液中是强的荧光物质，它有两个激发波长250nm和350nm，荧光发射峰在450nm。奎宁的荧光强度随着溶液酸度的改变，发生明显改变。除了酸度对它有显著的影响外，卤素等原子也对其荧光强度有明显的猝灭作用。因此，奎宁样品浓度的测定必须固定其他的实验条件，在低浓度时，采用标准曲线法即用已知浓度的标准物质，按试样相同的处理方法，配制成一系列标准溶液。通过测定这些溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据试样溶液的荧光强度，在标准曲线上求出试样中荧光物质的含量。
仪器与试剂
（1）仪器 RF-5301PC型荧光光度计（岛津）；石英比色皿；容量瓶：1000mL 2只，250mL 1只，50mL 6只，移液管1支。
（2）试剂 100.0μg/mL奎宁储备液（120.7mg硫酸奎宁二水合物中加入50mL 1mol/mL的硫酸溶液，并用去离子水定容至1000mL。将此溶液稀释至10倍，得到10.00μg/mL奎宁标准溶液）；0.05mol/L的H2SO4溶液。
实验步骤
（1）系列标准溶液的制备 吸取硫酸奎宁储备液（100μg/mL）5.00mL置50mL容量瓶中，加H2SO4溶液（0.05mol/L）稀释至刻度，摇匀，得到10.00μg/mL的硫酸奎宁标准溶液。
取6只50mL容量瓶，分别加入10.00μg/mL奎宁标准溶液0、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL，用0.05mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，待测。
（2）样品溶液的制备 精密称取硫酸奎宁样品约40mg置于1000mL容量瓶中，用H2SO4溶液（0.05mol/L）溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取此溶液1.00mL，置于100mL容量瓶中，用H2SO4溶液（0.05mol/L）稀释至刻度，摇匀，待测。
（3）测定
①按照仪器说明书接通电源，开机，仪器进行初始化后，设置灵敏度、狭缝、信噪比等参数及打印条件。
②将硫酸奎宁的对照品溶液置于石英池中。
③绘制荧光发射光谱，将激发波长设定为360nm，在400～600m范围扫描荧光发射光谱，确定适合的荧光发射波长。
④绘制激发光谱，将荧光发射波长设定为上述荧光波长（450nm），在200～400nm范围扫描激发光谱，确定适合的激发波长。
注意事项：硫酸奎宁标准溶液必须当天配制，避光保存。
数据处理
（1）最大发射波长和激发波长的确定记录如下。
（2）未知样品溶液荧光强度的测定记录。
（3）样品的测定将激发波长固定在350nm处，荧光波长固定在450nm处，测定H2SO4空白溶液（0.05mol/L）、对照品和样品溶液的荧光强度，按下列关系式计算出样品的浓度及含量
（4-3）
（4-4）
思考题
（1）测量时，为什么要测定硫酸的空白溶液？
（2）能用0.05mol/L的HCl来代替0.05mol/L的H2SO4溶液吗？为什么？