必备知识

一、生物制药上游技术

近20年来，以基因工程、细胞工程、酶工程为代表的现代生物技术迅猛发展，人类基因组计划等重大技术相继取得突破，现代生物技术在医学治疗方面广泛应用。生物制药技术是近20年兴起的以基因重组、单克隆技术为代表的新一代制药技术。我国已经把生物制药作为高新技术的支柱产业和经济发展的重点建设行业来发展，在一些经济发达或者科技发达的地区，一批国家级的生物制药产业基地纷纷建立，在上海、北京、江苏、辽宁、湖北、湖南等地，一大批生物制药技术骨干企业已经迅速崛起。在此政策的影响下，未来我国具有自主知识产权的生物制药研发将取得显著的成果，一部分产品会进入国际市场，与国际生物制药企业的差距将进一步缩小。

《中国生物制药行业技术研发与新品上市分析报告》显示，国家加大对生物技术创新和生物产业发展的支持力度，使我国生物制药行业保持快速发展势头。数据显示，随着生物医药产品外包的逐渐兴起，生物医药市场开始茁壮成长。自2003年以来，全球生物医药市场增速在10%以上，而我国的年均增长率更是达到25%以上，处于大规模产业化发展阶段。中国生物医药产业2014年销售收入已达到2469亿元，同比增长7%以上，远高于其他制造业。总体而言，中国生物医药产业发展前景看好，未来5～10年内将保持平稳增长的良好发展势头。另外，中国生物医药产业的快速发展还受国内外多种因素的助推，如国家的支持、国内外风险投资的增长、大量跨国生物制药公司进入中国，这些都为中国生物制药产业的发展提供了强大动力。“十二五”期间，我国已通过发展资源节约、环境友好的生物制药，完成了医药行业的产业升级和占领了生物制药的制高点。

根据生物制药产业发展的特点，将其分为上游和下游两个阶段。

（一）基因操作技术

基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同性状的根本原因，即所谓的“种瓜得瓜，种豆得豆”“一母生九子，九子各不同”。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。

基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于20世纪70年代初期。美国斯坦福大学的P.Berg等于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，S.Cohen等把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。

一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，并依照设计进行目的产物的生产。

1．目的DNA片段的获得

DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA（messenger RNA，信使核糖核酸）反转录合成的双链 cDNA（complementary DNA，与RNA链互补的单链DNA）分子。由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化等。

一般来说，获取目的基因的方法主要有三种，即反向转录法、从细胞基因组直接分离法和人工化学合成法。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）技术可以获得目的基因。化学合成全基因目前是准确率最高、速度最快的方法，同时可以依据密码子在不同宿主细胞的偏爱性和不同的实验需求设计基因序列，提高表达水平。当从组织样品、cDNA文库无法获得已知序列的基因，或需要特定突变（如经过密码子优化，提高外源表达量）时，全基因化学合成将是不错的选择方案。

基因合成是指在体外人工化学合成双链DNA分子的技术，所能合成的长度范围在50bp（bp，base pair，碱基对）～12kb（kb，千碱基对）。这与寡核苷酸的合成不同，寡核苷酸是单链的，所能合成的最长片段为100 nt（nucleotide，核苷酸数）左右。相对于从已有生物中获取基因来说，基因合成无需模板，因此不受基因来源的限制。

全基因合成的适用范围：很难克隆的基因或cDNA；密码子优化以提高基因的表达；重组抗体；预测的基因或cDNA。基因合成有较大的灵活性，可以对基因的酶切位点和多聚接头进行修改和设计，方便下游的克隆和实验。基因合成周期短，可以保证序列100%准确无误。

2．载体的选择

基因工程载体应具有以下基本性质：①在宿主细胞中有独立的复制和表达能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。②分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。③载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如耐药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。④载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。

DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosmid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。

3．体外重组

体外重组即在体外将目的片段和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。当目的DNA片段为平端时，可以直接与带有平端的载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏末端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰，如同聚物加尾、加衔接物或人工接头、PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。

4．导入受体细胞

载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此，可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。

将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化（transformation）、转染（transfection）和转导（transduction）。重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中，同样重组噬菌体DNA可以通过转染技术导入。转染效率不高，因此将重组噬菌体 DNA或柯斯质粒体外包装成有侵染性的噬菌体颗粒，借助这些噬菌体颗粒将重组DNA分子导入到宿主细胞转导的技术，这种转导技术的导入效率要比转染的导入效率高。

5．重组子的筛选

从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子（即阳性克隆）的过程就是筛选。目前发展起来的成熟筛选方法如下所述。

（1）插入失活法　外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些表现可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。目前常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。

（2）PCR筛选和限制酶酶切法　提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。

（3）核酸分子杂交法　制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段，或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸，或其他物种的同源基因。

（4）免疫学筛选法　获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体既可以是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可以是从目的基因部分开放阅读框（ORF，open reading frame）片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。

由上述方法获得的阳性克隆最后要进行DNA测序分析，以最终确认目的基因。

（二）细胞培养技术

1．细胞培养简介

细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞。不论是对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养，既包括微生物细胞的培养，还包括动物和植物细胞的培养。通过细胞培养，可以得到大量的细胞或其代谢产物。生物产品都是从细胞得来，所以，可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术之一。

2．细胞培养技术的优点

细胞培养技术的优点有：①直接观察活细胞的形态结构和生命活动，可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究。②直接观察细胞的变化，便于摄影。③研究细胞种类，如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。④便于使用各种技术和方法，如相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等观察和研究细胞状况。⑤是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。⑥易于实用物理、化学、生物的实验研究。⑦易于提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，比较经济。⑧成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。

3．细胞培养技术的缺点

细胞培养技术的不足之处主要有：①组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然是模拟体内环境，但仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为与体内细胞完全相同，而把实验结果推测于体内，轻易得出与体内等同的结论。②当原代细胞培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养不足和代谢物积累而不利于细胞生长或发生中毒。

4．一般培养方法

一般培养方法有悬浮生长细胞传代培养方法、半悬浮生长细胞传代培养方法和贴壁生长细胞传代培养方法。悬浮生长细胞常采用离心法传代，即以1000r/min（转/分钟）离心5min去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代；半悬浮生长细胞（如Hela细胞）虽呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代；而贴壁生长细胞传代又主要采用酶消化法进行，常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为贴附型或附着型和悬浮型。贴附型，即细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞，这种现象与细胞分化过程有关。

5．培养步骤

（1）附着型细胞（adherent cell） 附着型细胞的培养步骤为：首先，吸掉旧培养液，用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）洗涤细胞1～2次，然后加入trypsin（胰蛋白酶）-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液（1mL/25cm²，2mL/75cm²），37℃作用数分钟，于倒置显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液（若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清的新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液）。最后，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

（2）悬浮型细胞（suspension cell）　悬浮型细胞的培养过程为：吸出细胞培养液，放入离心管中，以1000r/min离心5min；吸掉上清液，加入适量新鲜培养基，混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

为方便描述细胞在培养过程中的形态变化，培养条件合适时，细胞相对稳定，可反映出起源、正常和异常的区别，方可作为判定细胞生物学性状的指标。需要注意的是，一般形态并不是一项可靠指标，要受各方面因素的影响，如反复开关温箱、温度、CO₂浓度、培养基pH值、支原体等。

6．细胞计数

在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别、冻存细胞复苏后的活力检测等。细胞悬液制备后，常用活体染料台盼蓝对细胞染色，进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，而死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞内而使细胞着色（蓝色）。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数，便于确定细胞的生活状况。

细胞计数操作如下：

（1）制备动物细胞悬液　将动物细胞用生理盐水制备成适当浓度的细胞悬液备用。

（2）具体细胞计数　用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭计数板并用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖玻片覆在计数板上面；用滴管吸取0.4%台盼蓝染液，按1∶1比例加入细胞悬液中，从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。稍候片刻，将计数板放在低倍镜下（10×10倍）观察计数；按图1-2-1计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线细胞不计下线细胞、计左线细胞不计右线细胞。两次重复计数误差不应超过±5%。镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。

计完数后，需换算出每毫升悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0.01cm²，高为0.01cm，这样它的体积为0.0001cm³，即0.1mm³。由于1mL＝1000mm³，所以每一大方格内细胞数×10000＝细胞数/mL，故可按下式计算：

细胞悬液细胞数/mL＝（4个大格细胞总数/4）×10000

如计数前已稀释，可再乘稀释倍数。计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。

需注意的是，向计数板中滴细胞悬液时要干净利落，加量要适当，过多易使盖玻片漂移，或淹过盖玻片则失败，过少易出现气泡；镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。

7．细胞活力检测

在细胞培养过程中，细胞活性的检测至关重要，主要检测方法有：形态学法、MTT（噻唑蓝）法、荧光染色法等。

（1）形态学法　根据细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞生长过程中形态学检测的方法。

① 光学显微镜和倒置显微镜

对于未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

对于染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

② 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。这三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区，紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，其储存液用蒸馏水配成1mg/mL的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为0.5～1mg/mL。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色，其储存液用蒸馏水配成1mg/mL的浓度，使用终浓度一般为0.5～1mg/mL。

结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期，即Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（图1-2-2）。

③ 透射电子显微镜观察　结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构图（图1-2-3）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

（2）MTT法　MTT法即噻唑蓝比色法，是通过快速简便的颜色反应来检测细胞存活数量。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物，当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT（噻唑蓝）还原成蓝紫色的针状甲瓒（Formazan）结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸光度值，该值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。目前MTT法常用于以下几个方面的研究：①检测细胞活性。常作为细胞毒性试验的一种方法。②体外药物敏感实验。该方法简便、经济、快速，重复性好，所需的细胞数较少，没有放射性，目前广泛地用于临床前的抗癌药物的筛选研究。③一些细胞因子活性的研究。

MTT法的基本步骤为：首先，将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成浓度为（1～10）×10⁴个/L的细胞悬液，按1000～10000个细胞/孔接种于96孔板，每孔加100μL；然后，将平板置37℃、5% CO₂湿度培养箱中24h后，加入含有不同浓度受试样本的培养液100μL，每个样本不同浓度设平行的三个孔，对照组加不含样本的培养液100μL，再放入培养箱中孵育24～72h；最后，用快速翻板法倒掉培养液，每孔加入新鲜配制的、用无血清1640培养基稀释剂5mg/mL的MTT溶液100μL，温育4h，使MTT还原为甲瓒。再次倒掉上清液，每孔加DMSO 200μL，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪测定光密度值（OD）（检测波长570nm），以溶剂对照处理细胞为对照组，计算化合物对细胞的抑制率和半数抑制浓度（IC₅₀）。

（3）荧光染色法　将细胞悬液与能与细胞DNA结合的荧光染料混合，应用荧光显微镜观察以显示和计数伴有异常染色质的组织细胞。常用染料为吖啶橙，染色后可以检测整个细胞群中有多少细胞发生了凋亡，但不能区别活细胞和死细胞。因此，将吖啶橙和溴化乙锭混合使用，根据两种染料的吸收情况可鉴定死、活细胞。

荧光染色法操作步骤为：向分装有1μL染液的试管内加入25μL细胞悬液，轻轻摇匀（所加溶液均置管底），置室温5～10min；将此混悬液取出10μL置于洁净载玻片上，加盖玻片，用荧光显微镜观察。若用吖啶橙作细胞染色，计数200个细胞总数，并记录与凋亡细胞的核不同的正常细胞数。吖啶橙插入DNA使之呈现绿色荧光，吖啶橙亦能结合至RNA，但不能插入，使RNA呈现红橙色荧光，如此细胞核呈绿色荧光而胞浆呈红橙色荧光。非凋亡细胞（活细胞或死亡细胞）由于活细胞和死亡细胞的细胞核中DNA含量不同，与吖啶橙结合量亦不同，导致绿色荧光的强弱也不同，且常染色质与异染色质的荧光密度不同；而凋亡的细胞核则呈均匀密度的荧光，染色质高度浓缩，核外周形成“新月状”，系核本身的荧光染色呈现的明亮球状小体。当细胞的程序性死亡进一步发展后，细胞失去DNA，或DNA断裂包入“凋亡小体”，此时与正常细胞相比失去明亮度。凋亡细胞百分率计算：

凋亡细胞（%）＝具有凋亡核的细胞数/计数的细胞总数×100%

若用吖啶橙和溴化乙锭混合液染色，计数200个细胞总数，并分别计数下列4种细胞状态的各自数目：①具有正常核的活细胞（VN，明亮的绿色染色质，且具正常的结构）；②含有凋亡核的活细胞（VA，明亮的绿色荧光，且呈高度聚集或断裂）；③具有正常核的死细胞（NVN，明亮的染色质，具有正常结构）；④具有凋亡核的死细胞（NVA，明亮的染色质，高度聚集或断裂）。

与单独吖啶橙染色一样，活细胞和死细胞的细胞核均被染成绿色（DNA着色），而RNA呈红色。因此活细胞被染成绿色的核和红色的胞浆，而死细胞则无红色胞浆。溴化乙锭仅着染死细胞，可使DNA染成橘红色，而仅很弱地结合RNA使之呈红色。两种染料混合着染后，死细胞将呈现明亮的橘红色染色质（溴化乙锭覆盖吖啶橙所致），且胞浆若有内容物残留可呈暗红色。应用此法，活细胞内正常的或凋亡的核都可呈现绿色，而死细胞中正常或凋亡的核均为鲜橘红色。按下式计算凋亡指数和坏死细胞百分率：

凋亡细胞百分率（凋亡指数）＝（VA＋NVA）/（VN＋VA＋NVN＋NVA）×100%

坏死细胞百分率＝NVN /（VN＋VA＋NVN＋NVA）×100%

死细胞百分率＝（NVN＋NVA）/（VN＋VA＋NVN＋NVA）×100%

式中，VN为具有正常核的活细胞；VA为含有凋亡核的活细胞；NVN为具有正常核的死细胞；NVA为具有凋亡核的死细胞。

假如细胞已经死亡一定时间，或DNA已经进入凋亡小体，此时细胞可以失去染色质而导致不能精确地检测细胞活性。

8．细胞冻存与复苏

细胞冻存是长期保存细胞的一种方法，是将细胞放在低温环境中，使细胞进入休眠状态，减少细胞代谢。目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新进入细胞周期，进而分裂产生子细胞，重新获得生物学功能。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶而对细胞造成损伤。

细胞冻存和复苏的原则是慢冻快融。当细胞冷却到0℃以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

（1）细胞慢冻的一般程序　细胞慢冻程序分为标准程序、简易程序和传统程序。

标准程序采用细胞冻存器，当温度在－25℃以上时，每分钟温度下降1～2℃，当温度达－25℃以下时，每分钟温度下降5～10℃，当温度达－100℃时，可迅速放入液氮中；而简易程序为：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋口系上线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40min内降至－80℃左右，放置于液氮表面过夜，次晨投入液氮中；传统程序是将冷冻管置于4℃ 10min→－20℃ 30min→－80℃ 16～18min（或隔夜）→ 液氮罐长期储存。

（2）细胞冻存方法　细胞冻存的方法为：首先，预先配制细胞冻存液，其配方为10%DMSO＋细胞生长液（20%血清＋基础培养液）和10%甘油＋细胞生长液（20%血清＋基础培养液）；然后，取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×10⁶～5×10⁶细胞/mL）；最后，加入1mL细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和日期，液氮长期保存。

（3）细胞复苏方法　细胞复苏的方法为：首先，将冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1min内全部融化（不要超过3min），实现快速解冻；然后，将解冻后的细胞直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中进行培养，24h后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。

（三）微生物发酵技术

1．发酵概述

发酵指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身或直接代谢产物或次级代谢产物的过程。通常所说的发酵，多是指生物体对于有机物的某种分解过程，也称发酵工程。

2．微生物菌种的选育

微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备来获得理想的发酵产品，因此在发酵前期必须进行菌种选育工作。菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进了微生物发酵工业的迅速发展。通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等产物的发酵产量提高了几十倍、几百倍甚至几千倍。菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件和生产菌的遗传学研究等方面也发挥重大作用。菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。 微生物育种技术经历了自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种五个阶段。

（1）自然选育　在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变（亦称自然突变）而进行菌种筛选的过程，称为自然选育。由于野生菌株生产能力低，往往不能满足工业上的需要。因为在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统趋向于快速生长和繁殖。但是，发酵工业生产需要培养微生物使之积累大量的代谢产物。为此，采用种种措施来打破菌的正常代谢，对代谢流进行调节控制，从而大量积累人们所需要的代谢产物。例如青霉素的原始生产菌种产生黄色色素，使成品带黄色，经过菌种选育，生产菌不再分泌黄色色素；土霉素产生菌在培养过程中产生大量泡沫，经诱变处理后改变了遗传特性，发酵泡沫减少，可节省大量消泡剂并增加培养液的装量。

自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种两种方法。

① 从自然界分离获得菌株　从自然界分离新菌种一般步骤为：采样增殖培养纯种分离性能测定。

ⅰ.采样。采样地点的确定要根据筛选目的、微生物分布概况及菌种主要特征与外界环境关系等进行综合、具体分析。若不了解生产菌具体来源，一般可从土壤中分离。选好地点后，用小铲去除表土，取离地面5～15cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好口并记录采样时间、地点、环境情况等，以备考查。

ⅱ.增殖培养。收集到的样品若含目标菌株较多，可直接进行分离；如含目标菌株很少，则需要进行增殖（富集）培养。增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。例如筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳源进行增殖培养，使得不能分解纤维素的菌不能生长；除碳源外，微生物对氮源、维生素及金属离子的要求也是不同的，适当地控制这些营养条件对提高分离效果是有好处的。另外，控制增殖培养基pH值，有利于排除不需要的、对酸碱敏感的微生物；添加一些专一性的抑制剂，可提高分离效率，例如在分离放线菌时，可先在土壤样品悬液中加10%的酚液数滴，以抑制霉菌和细菌的生长；适当控制增殖培养的温度，也是提高分离效率的一条途径。

ⅲ.纯种分离。生产菌自然条件下常与各种菌混杂在一起，需进行分离纯化才能获得纯种，常用方法为单菌落分离法，即把菌种制备成单孢子或单细胞悬浮液，经过适当稀释后，在琼脂平板上进行划线分离。划线法是将含菌样品在固体培养基表面做有规则的划线（有扇形划线法、方格划线法及平行划线法等），菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落；也可以采用稀释法，该法是通过不断地稀释，使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远离其他微生物而单独生长成为菌落，从而得到纯种。划线法简单且较快；稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的概率大，特别适宜于分离具有蔓延性的微生物。

ⅳ.生产性能的测定。纯种分离后得到菌株数量非常大，若做全面或精确的性能测定，工作量十分巨大，且不必要。一般采用初筛和复筛进行反复筛选，直到获得1～3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，进而作为育种的出发菌株。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株，以区别于用人工育种方法得到的变异菌株（亦称突变株）。

② 从自发突变体中获得菌株　一般微生物可遗传的特性发生变化称为变异，又称突变，是微生物产生变种的根源，同时也是育种的基础。自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。目前，发酵工业中使用的生产菌种，几乎都是经过人工诱变处理后获得的突变株。这些突变株是以大量生成某种代谢产物（发酵产物）为目的筛选出来的，属于代谢调节失控菌株。微生物代谢调节系统趋向于最有效地利用环境中的营养物质，优先进行生长和繁殖，而生产菌种常常是打破了原有的代谢调节系统的突变株，常常表现出生活力比野生菌株弱的特点。此外，生产菌种是经人工诱变处理而筛选获得的突变株，其遗传特性往往不够稳定，容易继续发生变异，使得生产菌株呈现出自然变异的特性，如果不及时进行自然选育，通常会导致菌种性能变化，使发酵产量降低，但也有变异使菌种获得优良性能的情况。

（2）诱变育种　自发突变频率较低，经自然选育筛选出来的菌种不能满足育种需要，也不能完全符合工业生产要求，如产量低、副产物多、生长周期长等。因而不能仅停留在“选”种上，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株，这种方法就称为诱变育种。通过人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法。但诱发突变随机性大，因此必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。如果筛选方法得当，也有可能定向地获得好的变异株。

诱变育种的主要环节是：首先，以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子），在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高；然后，用合适的方法淘汰负变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。

（3）杂交育种　微生物杂交育种最主要的目的在于把不同菌株的优良性状集中于重组体中，克服长期使用诱变剂出现的“疲劳效应”；杂交育种选用已知性状的供体菌和受体菌为亲本，在方向性和自觉性上均比诱变育种前进了一大步。杂交育种包括常规杂交和原生质体融合技术，其中原生质体融合技术近年来发展较为活跃。原生质体融合技术由于可在种内、种间甚至属间进行，不受亲缘关系的影响，遗传信息传递量大，不需了解双亲详细的遗传背景，因而便于操作。

原生质体融合技术起源于1960年，当时法国Barski研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象；1978年，在国际工业微生物遗传学讨论会上提出了原生质体的融合问题，使这一技术扩展到了育种领域。1979年，匈牙利Pesti首先采用该技术提高青霉素的产量，使得该技术在工业微生物育种实际工作中得到了应用；日本味之素公司应用该技术使产生氨基酸的短杆菌杂交，获得比原产量高3 倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高产新菌株；酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交，获得了具有糖化和发酵双重能力的菌株；我国上海第三制药厂自1980年开始摸索红霉素产生菌的选育，通过诱变、细胞融合、再诱变等几种育种方法相结合，获得了有效成分产量提高25%的菌株，且由于该菌株发酵液中所含有碍提纯的成分下降至5%以下，使得得率提高了13%。近年来，灭活原生质体融合、离子束细胞融合、非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法相继提出并应用于微生物育种中，这是原生质体融合技术的新发展。

（4）代谢控制育种　代谢控制育种兴起于20世纪50年代末，以1957年谷氨酸代谢控制发酵成功为标志，并促使发酵工业进入代谢控制发酵时期。代谢控制育种的活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量生成积累，打破了微生物调节这一障碍。从微生物育种史中可以看出，经典的诱变育种是最主要的育种手段，也是最基础的手段，但它具有一定的盲目性。代谢控制育种的崛起标志着育种发展到理性阶段，作为微生物育种最为活跃的领域而得到广泛的应用，它与杂交育种结合在一起，反映了当代微生物育种的主要趋势。代谢育种在工业上应用的例子很多，它提供了大量工业发酵生产菌种，使得氨基酸、核苷酸、抗生素等次级代谢产物产量成倍提高，大大促进了相关产业的发展。

（5）基因工程育种　基因工程育种是指利用基因工程方法对生产菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。基因工程育种是真正意义上的理性选育，按照人们事先设计和控制的方法进行育种，是当前最先进的育种技术。基因工程菌的构建和应用，已在多方面显示出巨大的生命力。通过基因工程方法生产的药物、疫苗、单克隆抗体及诊断试剂等已有几十种产品批准上市；通过基因工程方法已获得氨基酸类（苏氨酸、精氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸等）、工业用酶制剂（脂肪酶、纤维素酶、乙酰乳酸脱羧酶及淀粉酶等）以及头孢菌素C等的工程菌，大幅度提高了生产能力。

3．微生物菌种的保藏

菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技术。其目的是在人工创造的条件下尽量减慢或停止菌种的生长繁殖，使其处于休眠状态，减低菌种的变异率，在较长时期内保持着生活能力，以便为扩大微生物育种及微生物学研究提供大量可靠的优质菌种。菌种的妥善保藏是良好的实验室管理和实验质量的重要保证。各种微生物菌种保藏方法的主要原理是根据不同微生物的生理生化特点，人为创造缺氧、低温或者干燥的条件，降低微生物的新陈代谢，使其生命活动基本处于停滞或者休眠状态。停止生长繁殖的微生物，其遗传物质自然会更加稳定，因此微生物的性状在这种条件下保持稳定，可达到维持种系的目的。

菌种保藏方法大致可以分为两类：①在基质中的低温保藏方法，包括斜面、半固体穿刺、石蜡、沙土管保藏法。这类保藏方法通过稍降低温度辅以缺氧及减少养分供给等方式，以降低微生物的新陈代谢，从而达到较长时间保藏菌种的目的。②在保护剂中超低温保藏，也包括真空干燥冻存法。通过保护剂减少溶液结晶，平衡微生物细胞内外渗透压，保证微生物的生存，同时把温度降低到冰点以下使微生物的新陈代谢完全停止。这类方法虽然操作复杂，要求的硬件条件较高，但可以实现很长时间内保持菌种稳定的目的。

（1）斜面低温保藏法　将待保藏的菌种接种在合适的斜面培养基上，在相应的条件下培养至得到充足的菌体或者孢子，随后密封试管置于4℃左右保存，具体保存温度按照保存菌种设定，保藏时间依微生物的种类从1～4个月不等。此法适用范围广（细菌、霉菌、放线菌、酵母菌均适用），操作简便，成本低廉，恢复方便，人员能随时对微生物的状态进行观察；缺点是保藏时间较短，需要经常传代处理，因连续传代而容易引入基因突变或者杂菌，培养基的理化性质变化及微生物代谢产物等原因还会导致微生物性状发生改变。因此，该法适于短期保存常用菌株。

（2）液体石蜡保藏法　此法是斜面低温保藏法的一种改进，只需将无菌干燥的液体石蜡注入上述培养好的斜面至高于斜面顶端1cm处，再将试管密封，直立于4℃左右冷藏保存，具体保存温度随菌种而变。注意要定期添加石蜡保证斜面处于液面以下。保藏时间至少可达1年（无芽孢细菌、酵母菌）或更长。液体石蜡保藏法基本上克服了斜面低温保藏法保存时间短的缺点，然而液体石蜡保藏法由于要使试管直立保存，因此比较耗费空间，不便于携带。

（3）半固体穿刺保藏法　配制半固体培养基，高压湿热灭菌后倒于无菌试管中至约1/3，待培养基凝固，用接种环从平面培养基上挑取单菌落，穿入培养基若干次。在合适的条件下培养至菌体旺盛生长，之后密封试管，根据菌种特点在4℃左右或者凉爽干燥处保存。保存时间至少可以达到1年，对于有些菌种甚至能达到20年之久。此方法主要适用于大肠杆菌等细菌，操作简便，保存时间较长，适用于实验室使用，保存时注意培养基的营养不宜过于丰富，以进一步降低细菌的代谢。此法也可以用石蜡对培养基进行液封从而延长保藏时间。

（4）沙土管保藏法　用40目筛去除河砂粗粒，用10%盐酸浸泡2～4h以除去有机质，再用自来水冲洗至中性后烘干备用。另取非耕作层的无腐殖质的瘦黄土或者红土，以自来水洗至中性烘干，碾碎过100目筛。将上述沙与土以（2～4）∶1的比例混匀，分装于小试管内，每管1g左右，灭菌后烘干备用。将培养成熟、孢子层生长丰富的菌种用无菌水洗下制成孢子悬液，每支沙土管加入0.5mL左右悬液，以沙土刚刚湿润为宜，塞好棉塞置于真空干燥器内，用真空泵抽干水分。沙土管密封后放入冰箱或干燥阴凉处保存。这种方法适用于能产生孢子的微生物，如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广。其保藏效果亦较好，可以达到2年左右。但是此法对于营养细胞效果不好。操作的时候应注意抽干操作务必要快，尽量在12h内完成，以防止孢子萌发，降低保藏效果。

（5）加入保护剂冻存保藏法　体积分数10%～20%甘油是最常见的菌种冻存保护剂。将成熟期菌种培养物制成悬浊液置于冻存管中，加入一定体积的无菌甘油，使甘油的最终体积分数为10%～20%，密封。可根据实验室条件将菌种置于液氮、干冰、－70℃冰箱或者－20℃冰箱中保存，温度越低保存时间越长。脱脂牛乳也可以作为某些菌株的冻存保护剂，用经过脱脂灭菌工序后的鲜牛乳洗去固体培养基上的菌苔，制成菌种悬浊液，于冻存管密封后冷冻保存。加入保护剂冻存的方法操作比较麻烦，对设备要求相对较高，然而此法应用范围极广，除适用于一般微生物菌种保藏外，还适用于一些难以保存的微生物，如支原体、衣原体、氢细菌、噬菌体以及难以形成孢子的霉菌。在低温条件下微生物的代谢完全停滞，因此此法保存时间长，可以使微生物的遗传物质以及表观性状较为稳定。

（6）冷冻真空干燥保藏法　将处于成熟期的微生物培养物（若微生物可以产生孢子，则应尽量使微生物大量产生孢子）悬浮于无菌的血清、卵白、脱脂乳或者海藻糖等保护剂中制成浓菌液，分装到无菌的安瓿中，于低温冰箱中冷冻，达到预定温度后对浓菌液进行冷冻干燥处理，之后在真空状态下熔封安瓿，于－20℃保藏。冷冻真空干燥法虽然操作复杂，需要使用冷冻干燥以及抽真空的设备，然而一旦保存好，则可以最大程度地减少微生物的改变、死亡和泄漏扩散，因此适用于大批量菌种的长期保存，特别是一些致病微生物的保存。该法是各种保存方法中最为有效的方法之一，对于大多数微生物都适用，包括一些难以保存的致病菌，如脑膜炎球菌和淋病球菌。

除了上述各种微生物菌种保藏方法外，还有其他如生理盐水、蒸馏水、自然基质等菌种保藏方法。每种方法都有各自的适用范围和优缺点，也有一些共同点，如保藏菌种的生长状态至关重要（一般都要求微生物培养物达到成熟期，或者产生大量孢子），并且在操作过程中无菌操作都要严格规范地进行。若需要长期保藏菌种，则要在开始保藏时抽取菌种检验菌种质量，如冷冻真空保藏法，要在保藏菌株的安瓿制好后立即随机抽取样品开启检测，确定菌种存活情况良好、无变异、无污染后才能开始长期保存。在实践过程中，根据现有条件、实验需要以及微生物的特性应选择至少两种保藏方法，并且要定期复苏保藏的菌种进行质量检验，以确定菌种没有污染、变异或者死亡。

4．微生物的培养、发酵工程的控制

（1）发酵类型　根据发酵原料不同，可分为糖类物质发酵、石油发酵及废水发酵等类型；按发酵产物不同，可分为氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发酵等；按发酵形式不同，可分为固态发酵和液体深层发酵；按发酵工艺流程不同，可分为分批发酵、连续发酵和流加发酵；按发酵过程中对氧的需求不同，可分为厌氧发酵和通风发酵两大类型。

（2）发酵过程　对于所有的发酵类型（除一些转化过程外），一个确定的发酵过程基本上由六个部分组成：菌种以及确定的种子培养基和发酵培养基的组成；培养基、发酵罐和辅助设备的灭菌；大规模的有活性、纯种的种子培养物的生产；发酵罐中微生物最优的生长条件下产物的大规模生产；产物的提取、纯化；发酵废液的处理。

（3）发酵工程的控制　发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单；发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这一特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新；发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物；由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位的氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物；一般情况下，发酵过程中需要特别控制杂菌的产生。通常控制杂菌的方法是对设备进行严格消毒处理，对空气进行加热灭菌操作以及尽可能地采用自动化的方式进行发酵。通常，如果发酵过程中污染了杂菌或者噬菌体，会影响发酵过程的进行，导致发酵产品的产量减少，严重的甚至会导致整个发酵过程失败，发酵产品全部作废；微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，甚至可以获得按常规方法难以生产的产品；工业发酵与普通发酵相比，对于发酵过程的控制更为严格，对发酵技术要求更为成熟，并且能够实现大规模生产。

与传统发酵工艺相比，现代发酵工程除上述发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌”来进行反应，反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器代之，自动化、连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和创新。

（四）酶工程技术

1．酶工程概述

人们将来源于生物体的具有催化功能的物质称为“酶”，其本质是蛋白质，但有些酶是由蛋白质和核酸构成的，个别酶则仅仅是一种有催化作用的核酸。研究酶基本属性的学科称为“酶学”，将对酶的应用研究称为“酶工程”。酶工程就是将酶或者微生物细胞、动植物细胞或细胞器等在一定的生物反应装置中，将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术，包括酶制剂制备、酶固定化、酶修饰与改造及酶反应器等内容。酶催化效率一般比非酶催化反应高10⁷～10¹³倍；专一性强；反应条件温和。酶工程是生命技术的重要组成部分，也在医药开发、环保和食品等行业发挥着日益重要的作用。

（1）酶的分子改造　分子生物学技术将酶工程带入一个高速发展的阶段。在正常的生物细胞中，由于其内在的活动机制，酶产量的积累是十分有限的。基因工程可以通过对已知相关的酶进行分析，定向地改变酶的性能，比如提高酶的产量、扩大酶的适用范围以及增强酶的活性等。目前国际上知名的工业酶制剂生产商生产的酶制剂的菌株绝大部分都是由基因工程改造而来的。

基因工程虽然能够定向改造酶的活性，但是由于基因工程改变的是酶的核酸序列，对酶的蛋白质结构改变有限，因此对酶的活性提高是有限的。不过随着蛋白质工程进入酶学领域，与基因工程相辅相成地对酶进行改造，提出了蛋白质全新设计的概念。首先根据基因工程分析酶的核酸初始序列，通过三维结构建模分析反馈、调整和修改，最后通过质谱仪等分析设备分析蛋白质产物。蛋白质工程在酶学应用研究的前景十分广阔和诱人。

除了基因工程定向改造和蛋白质全新设计方法以外，酶的分子改造还可以通过人工模拟来完成。将酶的催化活性中心和底物结合位点结合起来组成简单的化合物，这类化合物不含有氨基酸，所以能够比天然酶更能适合环境。固氮酶、过氧化氢酶等已经通过此种方法合成。

（2）酶工程技术在医药开发中的应用　在开发新药方面，除了第四代头孢菌素、脱乙酰头孢菌素以及各种氨基酸和有机酸等传统酶工程药物以外，近年来科学家通过黄青霉素细菌固定化，用来生成头孢菌素前体物和青霉素。核苷酸类药物中的腺嘌呤核苷酸可以通过热水处理产蛋白假丝酵母菌体得到核酸，再经过核酸酶的处理得到。在医疗研究方面，由于人体对外源性酶产生的免疫排斥反应会导致酶的稳定性变差，难以达到病灶部位，固定化酶及人工细胞等技术在临床的治疗中能起到很关键的作用，如将酶固定在生物膜上组装成生物反应器，病人血液通过生物反应器来消除致病因子，从而达到治疗效果。苯丙酮尿症可间接导致儿童智力障碍，该病主要是苯丙氨酸脱氨酶的缺乏造成，如将该酶基因从植物中克隆到乳酸菌中，通过日常食用基因重组的乳酸菌在病患儿童的肠道中发挥治疗作用。由于酶的高效性，可在胰岛素泵中安装含酶的血糖传感器，通过检测血液中的血糖及时调整胰岛素含量来达到治疗目的。

（3）酶工程的发展前景　酶工程是生物技术的一个重要组成部分，研究酶分子机理用于开发新酶是酶工程发展的重要方向。如何让酶的功能充分发挥、如何提高酶的催化效率和适用范围一直是酶工程研究的重要课题。与此同时，利用新技术降低酶的使用价格以便推广这项环保节能的新技术，也是酶工程研究要考虑的重要因素。随着国家大力支持生物产业，酶工程产业获得了极大的发展，人们对酶工程的认识加深，都将对当前酶工程的发展起到巨大的推动作用。

2．酶的活力测定

酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度越大，酶活力越高，反之活力越低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此，一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。

不同酶的测定原理不尽相同。如Folin-酚法测定蛋白酶是利用在碱性条件下Folin-酚试剂可被酚类化合物还原成蓝色的钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活力。

考马斯亮蓝法是利用考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm处，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm处测定的吸光度值（A₅₉₅）与蛋白质浓度成正比。

甲醛滴定法测定蛋白酶活性是利用蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/L NaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活力。

DHT-酪蛋白法测定蛋白酶是利用5-氨基四唑重氮盐可将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价镍离子可与DHT-蛋白或DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活力。

DNA-溴化乙锭荧光分析法测定蛋白酶是利用溴化乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。当蛋白质（如组蛋白）与DNA 结合时，阻止了溴化乙锭的插入，结果荧光消失。组蛋白与DNA 有非常高的亲和力，组蛋白加入双链DNA 溶液时，全部结合到DNA 双链上，溶液中没有游离的组蛋白存在，直到所有结合部位都饱和。接近饱和的溴化乙锭（0.5μg/mL）与DNA 混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴化乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴化乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。据此，通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。

X射线胶片法测定蛋白酶的活力是利用酶的底物明胶涂抹在X射线胶片上，当待测酶液滴加到X射线胶片上时，酶将X射线胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方出现透明的圆圈。酶活性的高低与透明圆圈的面积成正比。通过测定圆圈的面积可以测定蛋白酶的活性。此法最显著的特点是操作简便、费用低廉，不需价格昂贵的仪器设备；1盒50张（20cm×25cm）的胶片，可作250次分析，每次可测定40个样品；同时测定速度快，1h左右即可测得满意的结果；一次可同时测定若干个样品，而且有较好的重复性。使用X射线胶片法时，待测酶液中不能含有胍或硫氰酸钾，因为3mol/L胍或1mol/L硫氰酸钾缓冲液也能使X射线胶片产生透明圈。若待测液中含有这些物质，测得的结果比实际的酶活力高。

流动注射分析（flow injection analysis，FIA）是近年发展起来的又一项应用广泛的分析测试新技术，具有重复性好、反应迅速、省时、试剂消耗少、适应性广等特点，已广泛用于分析化学、生物化学、临床检验及食品分析等多个领域。该法基本原理是用荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记蛋白酶底物牛血清白蛋白（BSA），然后将标记的BSA 偶联到2-氟-1-甲基吡啶（FMP）活化的分离胶上，制成分析柱。当含有蛋白酶的溶液流过分析柱时，蛋白酶将标记在BSA 上的荧光基团解离下来，通过荧光光度计检测酶解流出液的荧光强度来测定蛋白酶的活性。为了消除样品中可能存在的荧光物质对测定结果的影响，在分析系统中设置一个与分析柱完全一样的对照柱，仅以分离胶代替FITC-BSA-分离胶。待测酶液通过分析柱测得的荧光强度减去待测酶液通过对照柱所测得的荧光强度，即为酶实际水解的荧光素的荧光强度。本法精确度高、结果可靠。因为酶解反应在恒温条件下进行，并设置了对照柱，排除了其他因素的干扰。本法还有自动化程度高、操作简便以及测试费用低等特点。

3．酶的固定化技术

酶的最大缺点是不稳定，在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性，活性降低或丧失，而且酶反应后，会在溶液中残留，造成酶反应难以连续化、自动化，同时也不利于终产品的分离提纯。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联，酶被限定在一定区域内，但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能。通常酶是游离的，而经固定化后，酶被束缚在一定区域内，因而这样的酶被称为固定化酶，其在生物、医药等方面得到了广泛应用，是酶工程的核心，有利于实现酶的重复利用及产物与酶的分离。

（1）固定化酶的制备方法

① 吸附法　吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。吸附法较简便，酶活力损失小，但酶与载体作用力小，易脱落。物理吸附法是通过非特异性物理吸附作用，将酶固定到载体表面。载体主要有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、高岭土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、陶瓷、金属氧化物、淀粉、白蛋白、大孔树脂、丁基或己基葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体通过静电作用相结合的一种固定化方法。载体包括阴离子交换剂（如DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、TEAE-葡聚糖凝胶以及Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等）和阳离子交换剂（如CM-纤维素和Amberlite CG-50、IRC-50、IR-45、IR-120、IR-200、XE-97以及Dowex-50等）两大类。

② 包埋法　包埋法可分为网格型包埋和微囊型包埋。包埋法较简单，酶活力回收率较高，但发生化学反应时，酶易失活，所以常采用惰性材料作载体；另外，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶。网格型包埋是将酶包埋在高分子凝胶细微网格中，载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂、淀粉、明胶、卡拉胶、火棉胶、胶原、大豆蛋白、壳聚糖、海藻酸钠和角叉菜胶等；微囊型包埋是将酶包埋在高分子半透膜中，载体材料有硝酸纤维素、乙基纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙膜、聚酰胺、聚脲等。

③ 共价结合法　共价结合法包括载体共价结合和非载体共价结合。共价结合法具有酶与载体结合牢固、不易脱落的优点，但反应条件苛刻、操作复杂、酶活力回收率低，甚至酶的底物专一性有时也会发生变化。载体共价结合是先将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生共价偶联反应，常用的载体有多糖类衍生物、氨基酸的共聚体、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、多孔玻璃、陶瓷、卤乙酰、二嗪基或卤异丁烯基衍生物等；另一种是先在载体上共价连接一个双功能试剂，然后将酶共价偶联到双功能试剂上去，常用的载体有氨基乙基纤维素、DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、壳聚糖、氨基乙基聚丙烯酰胺、多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。非载体共价结合（也称交联法）是通过双功能或多功能试剂，使酶与酶之间相交联的一种方法。此法不使用载体，作为交联剂的双功能或多功能试剂有戊二醛、甲苯-2，4-二异氰酸酯、双重氮联苯胺、Tris等，其中最常用的是戊二醛。

④ 结晶法　结晶法是利用酶结晶而实现酶的固定化的方法。对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。结晶法提供了非常高的酶浓度，因此提高了单位体积的酶活力，对于活力较低的酶更具优越性；但在循环使用过程中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度逐渐降低。

⑤ 分散法　分散法是使酶分散于水不溶相中，从而实现酶的固定化。对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将酶的干粉悬浮于溶剂中；但如果酶分布得不好，则会引起传质现象，导致酶活力降低。

⑥ 热处理法　热处理法是将含有酶的细胞在一定的温度下加热一段时间，使酶固定在菌体内的固定化方法。热处理法只适合热稳定性较好的酶。在加热处理时，要掌握好温度和时间，以免引起酶的变性失活。

⑦ 其他方法　除上述介绍的几类方法外，还有纳米技术处理法、超声波处理法、磁处理法、电处理法、辐射处理法和等离子体处理法等。纳米技术处理法是将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。由于纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和生产效率。超声波处理法是利用超声波使高分子主链均裂，产生自由引发功能性单体，再聚合成嵌段共聚物载体来固定酶。磁处理法是利用磁性体Fe₃O₄与聚苯乙烯、含醛基聚合物等载体一起溶解混合后，再除去溶剂，可获得磁性载体。磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物（如铁、钴、镍及其氧化物）而具有磁响应性的超细粉末，也可作为磁性载体。磁性载体固定化酶具有磁响应性，可借助外部磁场简便地进行酶回收。电处理法是利用电聚合物作为酶固定化载体，特别有利于酶电极类生物传感器的制备，这方面的应用目标主要是生物医学检测。辐射处理法是利用γ射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶。 ⁶⁰Co辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时，将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时，因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散，并可提高酶的活性。等离子体处理法是用等离子体活化处理聚丙烯膜接枝丙烯酸后，可用于固定化胰蛋白酶，等离子体引发的丙烯酰胺聚合可包埋固定葡萄糖氧化酶。此外，还有制备光敏载体、温敏载体、阵列式微囊载体等固定化酶的方法。上述各种方法各有其优缺点，实际应用时，常将两种或多种方法结合使用，例如吸附-交联法、包埋-交联法等。

（2）固定化酶的优缺点　与游离酶相比，固定化酶具有以下优点：酶的稳定性提高，对温度和pH的适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低；酶反应条件容易控制，反应完成后，酶回收较简单，可重复使用，同时便于产品的分离和纯化，提高产物质量；可实现批量或连续操作，适于产业化、连续化、自动化生产。但固定化酶也存在以下局限性：酶活力有所损失；较适合于小分子底物，大分子底物基本无法进行反应；不适于多酶反应体系等。

（3）固定化酶的发展方向　固定化酶在工业中的应用日益广泛，它简化了工艺、降低了成本、减少了污染，特别是用化学工艺很难进行的操作，用固定化酶较容易解决，它的应用前景很好。酶固定化的发展方向主要有：①建立多酶固定化系统。一种固定化酶只能用于特定的单步反应，采用固定化细胞技术可省去酶分离纯化的时间和费用，并可同时进行多酶反应，可保持酶在细胞中的原始形态，增加了酶的稳定性。②探索新型载体。进一步对天然高分子载体的不断挖掘和探究，对其进行改性，或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶，解决固定化酶的稳定性和高效性。③开发新型、高效的固定化酶反应器。一方面反应器还应该包括酶辅因子再生系统，保证需要辅酶的酶正常发挥作用；另一方面直接将使用遗传工程技术培养的优良菌株、固定化技术和连续反应器巧妙结合，简化生产过程。

二、生物制药下游技术

（一）生物制药原料的选择、处理与有效成分提取

1．原料的来源

生物制药原料主要源于动物、海洋生物、植物和微生物等。

2．生物药物原料的选择、预处理与保存方法

原材料和药物种类及性质各不相同，提取和分离方法也有很大差异。

（1）原料选择原则　生物制药原料的选择原则主要有：有效成分含量高，原料新鲜，来源丰富、易得，产地较近，原料杂质含量少，成本低。

（2）预处理与保存　生物制药原料在进行药物分离纯化前要进行适当的预处理，如动物原料在采集后要立即去除结缔组织、脂肪组织等不用的成分，将有用成分保鲜处理；微生物原料要及时将菌体与培养液分开，进行保鲜处理。 预处理后将新鲜的原料进行保存，常见的保存方法有冷冻法、有机溶剂脱水法和防腐剂保鲜法等，冷冻法适用于所有生物原料，保存温度为－40℃；有机溶剂脱水法常用有机溶剂为丙酮，适用于原料少而价值高、有机溶剂对原料生物活性无影响的原料；防腐剂保鲜法，常用乙醇、苯酚等防腐剂，适用于液体原料，如发酵液、提取液等。

3．组织与细胞的破碎及其原料的提取

提取方法选择的原则有：针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件；同时要有生物活性物质的保护措施：采用缓冲系统，添加保护剂，抑制水解酶的作用，其他措施如避免紫外光、强烈搅拌、过酸、过碱或高温等。

（1）组织与细胞的破碎　若有效成分存在于细胞内部，则要将细胞破碎释放出有效成分到水相中。常用破碎方法有：珠磨法、撞击破碎法、高压匀浆法、反复冻融法、超声波破碎法、酶解法、渗透压冲击法、化学试剂法、干燥法等。若有效成分为胞外产物，则跳过此步骤。

（2）原料的提取　根据目的产物的理化性质选择提取方法，如用酸、碱、盐水溶液提取；用表面活性剂提取；有机溶剂提取（固-液提取、液-液萃取）；双水相萃取；超临界萃取，试剂常用水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、有机溶剂（氯仿、丙酮）等。

各种提取方法的原理和适用情况各不相同，这里以表面活性剂法为例进行简单介绍。表面活性剂提取法中表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，在分布于水-油界面时有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂可分为阴离子型、阳离子型、中性与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但易引起蛋白质等生物大分子的变性；非离子型表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取。阴离子表面活性剂SDS（十二烷基磺酸钠）可以破坏核酸与蛋白质的离子键合，对核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。

此外，提取剂的用量、提取次数、生产周期、产品回收率、产品活性等工业指标也是选择提取方法时的重要因素。

4．细胞破碎技术

某些目的药物，如胞外酶、青霉素等物质代谢后存在于细胞外的液相中称为胞外产物，这种情况容易获得含目的产物的澄清溶液，便于提取，节约成本。但还有很多动植物提取物如胰岛素、干扰素等存在于细胞内，若分离提取这些胞内产物，必须先破碎细胞，使目的产物释放到液相，再后继处理。不同生物体或同一生物体不同组织破碎方法不完全相同，动物的脏器组织常用机械法破碎；植物肉质组织可以磨碎；许多微生物具有坚韧的细胞壁，常用自溶、反复冻融、加砂研磨、超声波、加压处理等破碎方法。

（1）机械法　主要通过机械力的作用使组织粉碎。粉碎少量原料时，可使用高速组织捣碎机（10000r/min）、匀浆器、研钵、研船等。工业生产上常用的粉碎设备有电磨机、珠磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机等。一般脏器组织的粉碎多用绞肉机，冰冻状态绞碎效果更好。达到要求的破碎细胞程度时，可换用匀浆机。目前生化药厂破碎胰脏采用刨胰机，将冷冻胰脏切成薄片进行提取，对于获得较高的胰岛素收率有良好效果。

（2）物理法　物理法有超声波处理法、反复冻融法、干燥法和渗透压冲击法等。

当通过超声探头向悬浮液输入声能，大量声能转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度，使细胞破碎。为避免破碎过程中高温致生物产品失活，在破碎池中设计了冷却水夹套，并在开始时先把悬浮液冷却至0～5℃，且不断将冷却液连续通过夹套。为提高破碎效率，在破碎池中可添加细小的球粒（可以是钢制的或玻璃的），以产生“研磨”效应，提高细胞破碎率。

反复冻融法是将待破碎细胞在－20～－15℃条件下冷冻，然后放于室温或40℃迅速融化，反复冻融几次。该法的工作原理是：冷冻融化过程会使细胞膜的疏水键遭到破坏，从而使膜的疏水性增强，当胞内水形成冰晶粒后，会造成细胞内盐分浓度加大，引起细胞溶胀，反复多次冻融后，会致细胞破碎，细胞内产物流出。

干燥法是将待破碎细胞用不同方法进行干燥，菌体细胞失水，细胞内盐分浓度增大，细胞渗透性发生变化，然后用丙酮、乙醇或缓冲溶液等溶剂抽提胞内物质。干燥的方法有空气干燥、真空干燥、冷冻干燥等。对不稳定生化物质进行干燥时，常加入半胱氨酸、巯基乙醇和亚硫酸钠等还原剂进行保护。

菌体细胞膜是天然半透膜，把待破碎细胞经一定浓度甘油或蔗糖溶液处理，在高渗透压溶液中细胞脱水，细胞质变稠，发生质壁分离。然后转入低渗透压溶液中或缓冲溶液中，细胞快速吸水膨胀而破裂，使胞内物质释放到溶液中。用渗透压冲击法处理大肠杆菌时，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶等释放至溶液中。蛋白质释放量一般为菌体蛋白总量的4%～7%。但此法对革兰阳性菌不适用。

（3）化学与生物学方法　化学与生物学方法主要有酶溶法和化学渗透法。

酶溶法是利用细胞壁水解酶使细胞壁溶解，释放出胞内物质的方法。根据菌体不同的细胞壁结构选用特定的溶解酶。针对细菌细胞壁的结构和组成，使用酶溶解细菌细胞壁时，通常选用两种以上的酶协同作用，使溶解作用增强。酶溶法的优点有：对设备的要求低，能耗小；抽提的速率和收率高；产品的完整性好；对pH值和温度等外界条件要求低；由于细胞壁被溶解，不残留碎片，有利于提纯。但是酶溶法受酶的费用限制。

化学渗透法的应用也较为广泛，例如在发酵液中添加酸碱、脂溶性有机溶剂（甲苯、丁醇、丙酮、氯仿等）和某些表面活性剂，改变菌体细胞壁或膜的通透性，使细胞壁破裂，胞内物质释放出来。酸碱用来调节溶液的pH值，改变细胞所处的环境，从而改变蛋白质的电荷性质，使蛋白质和蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的作用力降低而溶解到液相中去，便于后面的提取。有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把胞内产物释放到水相中去。选用溶剂的基本原则是“相似相溶”，即选用与细胞壁中脂质溶解度参数相似的溶剂作为细胞破碎的溶剂。

5．液-固分离技术

生物制药产品的固-液分离方法与化工单元操作中的非均相物系分离方法基本相同，但由于发酵液或细胞培养液种类多、黏度大和成分复杂，其固液分离又很困难。特别是当固体微粒主要是细胞、细胞碎片及沉淀蛋白类物质时，由于这些物质具有可压缩性，给固液分离增加了困难。固液分离的好坏将影响料液的进一步处理。生物制药产品通常利用机械方法进行固液分离。

（1）过滤　实现过滤操作的外力是过滤介质两侧的压力差，压差可以通过重力、加压、抽真空来获得。依据过滤介质所起主要作用不同可分为饼层过滤或深床过滤；依据提供外力方式不同又可分为常压过滤和真空抽滤；依据过滤时外加压力和流速的不同，可分为恒压过滤（用压缩空气或真空作为推动力）、恒速过滤（常用定容泵来输送料液）和变速-变压过滤操作方式（用离心泵）3种。在生化产品生产中，真空抽滤应用较多。常用过滤设备有板框过滤机、真空转鼓过滤机等。

（2）沉降　沉降在实现固液分离时，不需要过滤介质，离心机的转鼓上不开设小孔，在离心力的作用下，物料按密度的大小不同分层沉降而得以分离，可用于液-固、液-液、液-液-固物料的分离。工业上较为常用的离心沉降设备有管式离心机和倾析式离心机。管式离心机除可用于微生物细胞的分离外，还可用于细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等的分离。倾析式离心机一般适合于处理含固形物较多的悬浮液的分离，不适合于细菌、酵母菌等微小微生物悬浮液的分离。

（3）离心过滤　离心过滤在实现固液分离时需要过滤介质，离心机的转鼓上开有小孔，在离心力的作用下，液体穿过过滤介质经转鼓上的小孔流出，固体则吸附在滤布上形成滤饼层，从而实现固液分离。以后液体要依次流经饼层、滤布再经小孔排出，滤饼层随过滤时间的延长而逐渐加厚，至一定厚度后停止过滤，进行卸料处理后再转入过滤操作。工业上较为常见的离心过滤设备是碟片式离心机，适用于含细菌、酵母菌、放线菌等多种微生物细胞的悬浮液及细胞碎片悬浮液的分离。

（二）萃取技术

1．概述

萃取是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作，其中至少有一相为流体，一般称该流体为萃取剂。以液体为萃取剂时，如果含有目标产物的原料也为液体，则称此操作为液-液萃取；如果含有目标产物的原料为固体，则称此操作为液-固萃取或浸取。以超临界流体为萃取剂时，含有目标产物的原料可以是液体，也可以是固体，称此操作为超临界流体萃取。

萃取可分为物理萃取和化学萃取两大类。溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应的过程叫做物理萃取。例如，利用乙酸丁酯萃取发酵液中的青霉素即属于此类，它广泛应用于石油化工和抗生素及天然植物中有效成分的提取过程。化学萃取主要用于金属的提取，也可用于氨基酸、抗生素和有机酸等生物产物的分离回收。它是利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子，实现溶质向有机相的分配。萃取剂与溶质之间的化学反应包括离子交换和络合反应等。化学萃取中通常用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有机溶剂溶解萃取剂，改善萃取相的物理性质，此时的有机溶剂称为稀释剂。

2．溶剂萃取法

溶剂萃取法又称为液-液萃取，它是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响液-液萃取的因素主要有目的物在两相的分配比（分配系数K）和有机溶剂的用量等。分配系数K值增大，提取效率也增大，萃取就易于进行完全。当K值较小时，可以适当增加有机溶剂用量来提高萃取率，但有机溶剂用量增加会增加后处理的工作量，因此在实际工作中，常常采取分次加入溶剂、连续多次提取来提高萃取率。

溶剂萃取要注意pH、中性盐、温度、乳化以及萃取溶剂等因素的影响。

在萃取操作中正确选择pH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。所以萃取具有酸、碱基团的物质时，酸性物质在酸性条件下萃取，碱性物质在碱性条件下萃取，对氨基酸等两性电解质，则采用pH值在等电点（pI）时进行提取较好；加入中性盐如硫酸铵、氯化钠等可以使一些生化物质溶解度减小。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。盐析作用也能减小有机溶剂在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少；温度升高可使生化物质不稳定，又易使有机溶剂挥发，所以一般在室温或低温下进行萃取操作。在溶剂萃取过程中，两相界面上经常会产生乳化现象。乳化是指液体以细小液滴的形式分散在另一不相溶的液体中，例如水以细小液滴的形式分散在有机相中，或有机溶剂以细小液滴的形式分散在水相中。在发酵液的溶剂萃取中产生乳化现象后，使水相和有机相分层困难，影响萃取分离操作的进行，它可能产生两种夹带：萃余相中夹带溶剂，目标产物的收益率降低；萃取相中夹带发酵液，给分离提纯制造困难。选用溶剂必须具有较高选择性，各种溶质在所选溶剂中的分配系数差异愈大愈好；选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收；两种溶剂密度相差不大时，易形成乳化，不利于萃取液的分离，选用溶剂时应注意；要选用无毒、不易燃烧的价廉易得的溶剂。

3．双水相萃取法

双水相萃取是新型的分离技术之一，其特点是能够保持生物物质的活性和构象，蛋白质的提取率提高2～5倍，设备需要量是原分离技术的～。双水相萃取技术在生物分离过程中的应用为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离开辟了新途径。

（1）双水相萃取原理　双水相系统是指某些亲水性聚合物之间或亲水性聚合物与无机盐之间，在水中超过一定的浓度溶解后形成不相溶的两相，并且两相中水分均占很大比例。典型的例子是聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dx）形成的双水相系统。在聚乙二醇和葡聚糖溶解过程中，当各种溶质均在低浓度时，可得到单相均质液体，超过一定浓度后，溶液会变混浊，静置后可形成两个液层，上层富集了PEG、下层富集了Dx，两个不相混合的液相达到平衡。典型双水相系统示意见图1-2-4。这两个亲水成分的非互溶性，是它们各自有不同的分子结构而产生的相互排斥来决定的。Dx是一种几乎不能形成偶极现象的球形分子，而PEG是一种共享电子对的高密度聚合物。一种聚合物的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。

这种聚合物分子的溶液发生分相的现象，称为聚合物的不相容性。高聚物-高聚物双水相萃取系统的形成就是依据这一特性。可形成高聚物-高聚物双水相的物质很多，表1-2-1列出了常见的双水相系统。其中最常用的是PEG-Dx系统。除高聚物-高聚物双水相系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相；其成相机理大多数学者认为是盐析作用；最常用的是PEG-无机盐系统，其上相富含PEG、下相富含无机盐。

在双水相系统中，两相的水分都在85%～95%，且成相的高聚物与无机盐都是生物相容的，生物活性物质或细胞在这种环境下不仅不会丧失活性，而且还会提高它们的稳定性，因此双水相系统在生物技术领域得到越来越多的应用。

（2）影响双水相萃取的因素　影响双水相萃取的因素很多，主要有组成双水相系统的高聚物平均分子量和浓度、成相盐的种类和浓度、pH值以及体系的温度等。

① 分子量与浓度　组成双水相系统高聚物的平均分子量和浓度是影响双水相萃取分配系数的最重要因素，在成相高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的分子量，则可溶性大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细胞或细胞器易分配于富含该高聚物的相中。对PEG-Dx系统而言，上相富含PEG，若降低PEG的分子量，则分配系数增大；下相富含Dx，若降低Dx的分子量，则分配系数减小，这是一条普遍规律。

② 临界点　当成相系统的总浓度增大时，系统远离临界点。蛋白质分子的分配系数在临界点处的值为1，偏离临界点时的值大于1或小于1。因此成相系统的总浓度越高，偏离临界点越远，蛋白质越容易分配于其中的某一相。细胞等颗粒在临界点附近，大多分配于一相中，而不吸附于界面。随着成相系统的总浓度增大，界面张力增大，细胞或固体颗粒容易吸附在界面上，给萃取操作带来困难，但对于可溶性蛋白质，这种界面吸附现象很少发生。

盐的种类和浓度对双水相萃取的影响主要反映在两个方面，一方面由于盐的正负离子在两相间的分配系数不同，两相间形成电势差，从而影响带电生物大分子在两相中的分配。例如在8%聚乙二醇-8%葡聚糖、0.5mmol/L磷酸钠、pH6.9的体系中，溶菌酶带正电荷分配在上相，卵蛋白带负电荷分配在下相。当加入浓度低于50mmol/L的NaCl时，上相电位低于下相电位，使溶菌酶的分配系数增大、卵蛋白的分配系数减小。另一方面，当盐的浓度很大时，由于强烈的盐析作用，蛋白质易分配于上相，分配系数几乎随盐浓度成指数增加，此时分配系数与蛋白质浓度有关。不同的蛋白质随盐的浓度增加分配系数增大程度各不相同，利用此性质可有效地萃取分离不同的蛋白质。

③ pH值　pH值会影响蛋白质分子中可离解基团的离解度，调节pH值可改变蛋白质分子的表面电荷数，电荷数的改变必然改变蛋白质在两相中的分配。另外，pH值影响磷酸盐的解离，改变磷酸二氢根离子和磷酸氢根离子之间的比例，从而影响聚乙二醇-磷酸钾系统的相间电位和蛋白质的分配系数。对某些蛋白质，pH值的微小变化会使蛋白质的分配系数改变2～3个数量级。

④ 温度　温度会影响双组分系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。特别是在临界点附近，即使系统温度较小的变化，也可以强烈影响临界点附近相的组成。当双水相系统离临界点足够远时，温度的影响很小。由于双水相系统中成相聚合物对生物活性物质有稳定作用，常温下蛋白质不会失活或变性，活性效率依然很高。因此大规模双水相萃取一般在室温下操作，节约了冷却费用，同时室温下溶液黏度较低，有利于相分离。

（三）固相析出分离技术

固相析出分离技术又称为沉淀法，它是通过改变条件或加入某种试剂，使发酵溶液中的溶质由液相转变为固相的过程。生物制药分离纯化中最常用的几种固相析出分离方法是：盐析、结晶、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、亲和沉淀、表面活性剂沉淀。

1．盐析技术

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，称为“盐溶”；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度呈不同程度下降并先后析出，这种现象称“盐析”。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，可恢复蛋白质的活性。除蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20%～40%饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43%饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清液中。盐析法突出的优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。常用于各种蛋白质和酶的分离纯化。盐析法中常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸二氢钠等。

（1）基本原理　蛋白质和酶均易溶于水，因为它们分子中的—COOH、—NH₂和—OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成水化层厚度为1～100nm的颗粒状的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。蛋白质盐析原理示意如图1-2-5所示。

（2）中性盐的选择　常用的中性盐中最重要的是硫酸铵，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：溶解度大，尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的；由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行；不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用；价格便宜，废液可以作为农田肥料，且不污染环境。

（3）盐析的影响因素　影响盐析效果的因素有：蛋白质的浓度、pH值、温度。

2．结晶法

（1）结晶的原理　将一种可溶性固体溶质加入某恒温溶剂如水中，会发生两个可逆的过程：固体的溶解，即溶质分子扩散进入液体内部；物质的沉积，即溶质分子从液体中扩散到固体表面进行沉积，因此结晶过程是一个动态平衡过程。当溶解作用和沉积作用达到动态平衡时，此时溶液称为该溶质在该温度下的饱和溶液。当压力一定时，溶解度是温度的函数，用温度-浓度图来表示，就是一条饱和曲线（如图1-2-6曲线AB）。

实际工作中，过饱和状态下溶液是不稳定的，也可称为“介稳状态”。如果没有其他外界条件影响，过饱和溶液的浓度只有达到一定值时，才会有结晶析出。有结晶析出时的过饱和浓度和温度的关系可以用过饱和曲线表示（如图1-2-6曲线CD）。过饱和曲线，即无晶种无搅拌时自发产生晶核的浓度曲线。饱和曲线AB和过饱和曲线CD大致平行。两条曲线把浓度-温度图分为三个区域：稳定区、介稳区、不稳区。需要指出的是，介稳区又被曲线C′D′（此线以上区域，溶液极易受刺激而结晶，以下区域溶液不会自发成核）细分为两个区，习惯上也将第一介稳区（ABC′D′）称为养晶区，第二介稳区（C′D′CD）称为刺激结晶区。

在上述三个区域中，稳定区内溶液处于不饱和状态，没有结晶；不稳区内晶核形成的速率较大，产生的结晶量大，晶粒小，质量难以控制；介稳区内，晶核形成速率较慢，生产中常采用加入晶种的方法，并把溶液浓度控制在介稳区内的养晶区，让晶体逐渐长大。

（2）工业结晶手段

① 将热饱和溶液冷却　冷却法的结晶过程中基本上不去除溶剂，而是使溶液冷却降温，成为过饱和溶液，如图1-2-6中直线EFG所代表的过程。此法适用于溶解度随温度降低而显著减小的场合。例如冷却L-脯氨酸的浓缩液至4℃左右，放置4h，L-脯氨酸就会大量结晶析出。反之，如果溶解度随温度升高而降低，则采用升温结晶法。例如将红霉素的缓冲提取液pH调整至9.8～10.2，再加温至45～55℃，红霉素碱即析出。根据冷却的方法不同，可分为自然冷却、强制冷却和直接冷却。在生产中运用较多的是强制冷却，其冷却过程易于控制，冷却速率快。

② 将部分溶剂蒸发　此种方法也称等温结晶，是借蒸发除去部分溶剂，而使溶液达到过饱和的方法。如图1-2-6中直线EF′G′所表示的过程。适用于溶解度随温度变化不大的场合。例如真空浓缩赤霉素的乙酸乙酯萃取液，除去部分乙酸乙酯后，赤霉素即结晶析出。蒸发法的不足之处在于能耗较高，加热面容易结垢。生产上常采用多效蒸发，以提高热能利用率。

③ 化学反应结晶　通过加入反应剂或调节pH，使体系发生化学反应产生一个可溶性更低的物质，当其浓度超过其溶解度时，就有结晶析出。例如红霉素乙酸丁酯提取液中加入硫氰酸盐并调节溶液pH为5.0左右，可生成红霉素硫氰酸盐结晶而析出。

④ 盐析反应结晶　加入一种物质（另一种溶剂或另一种溶质）于溶液中，使溶质的溶解度降低，形成过饱和溶液而结晶析出的办法，称为盐析反应结晶。加入的溶剂必须能和原溶剂互溶，例如利用卡那霉素易溶于水、不溶于乙醇的性质，在卡那霉素脱色的水溶液中，加入95%乙醇，加入量为脱色液的60%～80%，搅拌6h，卡那霉素硫酸盐即成结晶析出。再如普鲁卡因青霉素结晶时，加入一定量的食盐，可以使结晶体容易析出。

工业上，除单独使用上述四种方法外，还常将以上几种方法结合使用。例如，制霉菌素的乙醇提取液真空浓缩10倍冷至5℃，放置2h，即可得到制霉菌素结晶，就是采用第①种和第②种方法结合使用。而将青霉素钾盐溶于缓冲液中，冷至3～5℃，滴加盐酸普鲁卡因，得到普鲁卡因青霉素结晶，则是采用第①、③种方法结合使用。

（3）结晶产品的处理　为得到合乎质量标准的晶体产品，结晶后的产品还需经过固-液分离、晶体的洗涤或重结晶、干燥等操作，其中晶体的分离与洗涤对产品质量的影响很大。

3．有机溶剂沉淀法

（1）基本原理　有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，所以有机溶剂沉淀法是较早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。溶液介电常数的减小就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。

（2）有机溶剂沉淀法的优缺点　该法分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀；沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋除掉有机溶剂）。因而该法在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。

（3）注意事项　有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、pH值和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉淀所得的固体样品，如果不需立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如有必要可以装透析袋透析除掉有机溶剂，以免影响样品的生物活性。

4．等电点沉淀法

该法用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，一般多与其他方法结合使用。 等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。

5．选择性沉淀法

这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而达到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等，多用于除去某些不耐热的和在一定pH下易变性的杂蛋白。

（1）热变性　利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。

（2）表面活性剂　不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那些敏感性强的杂蛋白变性沉淀，而目的物仍留在溶液中。使用此法时通常都在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物活性。

（3）选择性酸碱变性　利用蛋白质和酶等在不同pH值条件下的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。

（四）色谱技术

1．色谱原理、特点与分类

（1）原理　色谱技术也称层析技术，是一种高效的物理分离方法，它是利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。其中一相是固定相，通常为表面积很大的或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离。

（2）特点　与其他分离纯化方法相比，色谱分离具有如下基本特点：分离效率高，色谱分离的效率是所有分离纯化技术中最高的；应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，都可用色谱法进行分离；选择性强，色谱分离可变参数之多也是其他分离技术无法相比的，因而具有很强的选择性；方便快捷，设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件，因而不容易使物质变性，特别适用于稳定的大分子有机化合物。

（3）色谱方法分类　色谱操作依操作形式分类或根据固定相基质的形式分类，可分为纸色谱、薄层色谱和柱色谱。纸色谱是指以滤纸作为基质的色谱分离技术；薄层色谱是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行的色谱分离技术；柱色谱则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行的色谱分离技术。纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物制药中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。

依分离机理分类，色谱技术可以分为吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子交换色谱和亲和色谱。吸附色谱是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种色谱技术；分配色谱是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种色谱技术，如液相色谱、气相色谱等；凝胶色谱是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种色谱技术；离子交换色谱是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种色谱技术；亲和色谱是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种色谱技术，它是分离生物大分子最为有效的色谱技术，具有很高的分辨率。

依流动相分类，色谱技术可以分为气相色谱和液相色谱。气相色谱是指流动相为气体的色谱分离技术；液相色谱是指流动相为液体的色谱分离技术。气相色谱测定样品时需要气化，大大限制了其在生物制药领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相色谱是生物制药领域最常用的色谱形式，适于生物样品的分析、分离。

（4）柱色谱基本操作技术

① 装柱　首先选好柱子，根据色谱的基质和分离目的而定。将色谱用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5～1.0mol/L）、碱（0.5～1.0mol/L）、盐（0.5～1.0mol/L）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。并将处理好的吸附剂缓慢地倒入柱中。

② 平衡　柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。

③ 加样。

④ 洗脱　洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱3种。

⑤ 流速控制　只有多次试验才会得到合适的流速。总之，须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。

⑥ 分部收集　基本上采用部分收集器来收集分离纯化的样品。

⑦ 洗脱峰检测、合并收集　由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般为1～5mL/管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5mL/管，需要视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。

⑧ 色谱介质的再生　恢复色谱介质分离能力的操作，不同介质有不同的再生方法。

2．吸附色谱

吸附是指流体（液体或气体）与固体多孔物质接触时，流体中的一种或多种组分传递到多孔物质的外表面和微孔内表面并附着的过程。被吸附的流体称为吸附质，多孔的固体物质称为吸附剂。吸附分离技术是利用适当的吸附剂，将生物样品中某些组分选择性吸附，再用适当的洗脱剂将被吸附的物质从吸附剂上解吸下来，从而达到浓缩和提纯的分离方法。

（1）吸附的基本原理

① 吸附的类型　根据吸附剂与吸附质之间存在的吸附力性质的不同，可将吸附分成物理吸附、化学吸附和交换吸附三种类型。物理吸附其吸附剂和吸附质之间的作用力是分子间引力（范德华力）。由于范德华力普遍存在于吸附剂与吸附质之间，所以整个自由界面都起吸附作用，故物理吸附无选择性。而化学吸附则是利用吸附剂与吸附质之间的电子转移，生成化学键而实现物质的吸附。化学吸附需要很高的活化能，需要在较高的温度下进行。交换吸附其吸附表面如为极性分子或离子所组成，则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层，这种吸附称为极性吸附，同时在吸附剂与溶液间发生离子交换。就吸附而言，各种类型的吸附之间不可能有明确的界限，有时几种吸附同时发生，很难区别。溶液中的吸附现象较为复杂。

② 影响吸附的因素　固体在溶液中的吸附比较复杂，影响因素也较多，主要有吸附剂、吸附质、溶剂的性质以及吸附过程的具体操作条件等。对于吸附剂性质来说，吸附剂表面积越大，孔隙度越大，则吸附容量越大；吸附剂的孔径越大、颗粒度越小，则吸附速度越大。吸附质的性质也是影响吸附的因素之一。对于吸附质性质来说，一般溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，吸附量较少；极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。如活性炭是非极性的，在水溶液中是一些有机化合物的良好吸附剂；硅胶是极性的，其在有机溶剂中吸附极性物质较为适宜。对蛋白质或酶类的分子进行吸附时，温度升高会增加吸附量，但生化物质吸附温度的选择还要考虑它的热稳定性，如果是热不稳定的，一般在0℃左右进行吸附；如果比较稳定，则可在室温操作。pH值也是影响吸附的重要因素，对蛋白质或酶类等两性物质，一般在等电点附近吸附量最大。各种溶质吸附的最佳pH值需通过实验确定。如有机酸类溶于碱，胺类物质溶于酸，所以有机酸在酸性条件下、胺类在碱性条件下较易为非极性吸附剂所吸附。

（2）常用的试剂

① 吸附剂　吸附剂的吸附力强弱，是由能否有效地接受或供给电子，或提供和接受活泼氢来决定。被吸附物的化学结构如与吸附剂有相似的电子特性，吸附就更加牢固。常用吸附剂吸附力的强弱顺序为：活性炭>氧化铝>硅胶>氧化镁>碳酸钙>磷酸钙>石膏>纤维素>淀粉和糖，以活性炭的吸附力最强。吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化。大多数吸附剂遇水即钝化，因此吸附色谱大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离，较少用于无机化合物。

② 洗脱溶剂　洗脱溶剂解析能力的强弱顺序是：乙酸>水>甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯>醚>氯仿>苯>四氯化碳和己烷。为了能达到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得最佳分离效果。

（3）吸附色谱的应用　吸附根据采用的操作方式不同，可分为静态吸附分离与动态吸附分离。静态吸附分离是在带有搅拌的反应罐中，依次将吸附剂加入到生物分子溶液中搅拌或振荡达到吸附平衡后，用沉降、过滤或离心的方法逐个分离。静态吸附分离具有处理量大、速度快的优点；一般吸附剂只用一次就废弃，料液有一些损失是不可避免的；另外，静态吸附分离即使对目的物完全不吸附，却可以有效去除其他杂质。因此，即使纯化程度不大，但是在大规模生产时，杂蛋白等严重的污染物却可被有效除去。采用静态吸附工艺主要有两方面的作用：一是吸附杂质，使杂质浓集于吸附剂界面；另一种是吸附所需物质，使要提取的物质浓集。当吸附剂对杂质的吸附能力较强，而对所提取的物质基本无影响时，可用吸附剂除去杂质。如果提取液中所需的物质能被吸附剂大量吸附，再结合洗脱，即可达到分离纯化的目的。吸附杂质常用活性炭；吸附目的物常用磷酸钙凝胶离子交换剂（特别是磷酸纤维素）、亲和吸附剂、染料配位体吸附剂、疏水吸附剂和免疫吸附剂等。对吸附剂的要求应是能很快地回收并用絮凝沉降或过滤的方法洗涤；在规模小时，可采用离心法。

动态吸附分离是使含目标产物的溶液连续通过一根或多根填充有吸附剂的柱，流出液用一个分部收集器收集，或者将一定流量和浓度的料液恒定地连续送入放置有纯溶剂和定量的新鲜吸附剂的连续搅拌罐式反应器中，经吸附后，以同样流量排出残液。该法比较适用于产品的大规模分离。

3．凝胶色谱

凝胶色谱法是20世纪60年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法，它主要用于高聚物的分子量分级分析以及分子量分布测试，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地应用于工业生产中。

（1）凝胶色谱的分类　根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡聚糖系列，洗脱溶剂主要是水。凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 （聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等）分子量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但分子量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全分离纯化的目的。

（2）工作原理　一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种按照分子量大小排队依次流出的现象叫分子筛效应。

各种分子筛孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙，如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。

（3）凝胶的种类

① 聚丙烯酰胺凝胶　聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，其商品为生物胶-P（Bio-Gel P），常用的是日本TOSOH公司的TSK-gel PW系列，适合蛋白质和多糖的纯化。它可储存于阴凉、通风、干燥的库房内，防潮、避光、防热，存放时间不宜过长。

② 交联葡聚糖凝胶（Sephadex） 不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5g，同样G-200为每克干胶吸水20g。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150和G-200。因此，“G”反映凝胶交联程度、膨胀程度及分布范围。Sephadex LH-20是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。

③ 琼脂糖凝胶　琼脂糖 Agarose，缩写为 AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成分，也译为琼胶素或琼胶糖。适于用Sephadex不能分级分离的大分子的凝胶过滤，若使用5%以下浓度的凝胶，也能够分级分离细胞颗粒、病毒等。利用其吸附性小的特点，有时用它代替琼脂作为免疫电泳或凝胶内沉降反应的支持物。

④ 聚苯乙烯凝胶　商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量在1600～4×10⁷ Da（道尔顿）的生物大分子，适用于有机多聚物的分子量测定和脂溶性天然物质的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用二甲基亚砜。

4．离子交换色谱

离子交换色谱是利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。离子交换技术最早应用于制备软水和无盐水，药品生产用水多采用此法。在生化制品领域中，离子交换技术也逐渐应用于蛋白质、核酸等物质的分离、提取和除杂等。

离子交换分离技术与其他分离技术相比有如下特点：①离子交换操作属于液-固非均相扩散传质过程。所处理的溶液一般为水溶液，多相操作使分离变得容易。②离子交换可看作是溶液中的被分离组分与离子交换剂中可交换离子进行离子置换反应的过程。其选择性高，而且离子交换反应是定量进行的，即离子交换树脂吸附和释放的离子物质的量（mol）相等。③离子交换剂在使用后，其性能逐渐消失，需用酸、碱、盐再生而恢复使用。④离子交换技术具有很高的浓缩倍数，操作方便，效果突出。

（1）离子交换原理　离子交换过程包括外部扩散、内部扩散和离子交换反应。离子交换反应过程可用以下方程式表示（以阳离子交换反应为例）：

R-B^＋＋A^＋R-A^＋＋B^＋

式中，R-表示阳离子交换剂的活性基团和载体；B^＋为平衡离子；A^＋为交换离子。

离子交换过程应包括下列五个步骤：①A^＋从溶液扩散到树脂表面②A^＋从树脂表面扩散到树脂内部的交换中心③在树脂内部的交换中心处，A^＋与B^＋发生交换反应④B^＋从树脂内部交换中心处扩散到树脂表面⑤B^＋再从树脂表面扩散到溶液中。

上述五个步骤中，①和⑤在树脂表面的液膜内进行，互为可逆过程，称为膜扩散或外部扩散过程；②和④发生在树脂颗粒内部，互为可逆过程，称为粒扩散或内部扩散过程；③为离子交换反应过程。因此离子交换过程实际上只有三个步骤：外部扩散、内部扩散和离子交换反应（图1-2-7）。

离子交换速率究竟取决于内部扩散速率还是外部扩散速率，要视具体情况而定。一般情况下，离子交换反应的速率极快，不是速度控制步骤。离子在颗粒内的扩散速率与树脂结构、颗粒大小、离子特性等因素有关；而外扩散速率与溶液的性质、浓度、流动状态等因素有关。

（2）离子交换树脂　离子交换树脂的单元结构由三部分构成：惰性不溶性的高分子固定骨架，又称载体；与载体以共价键联结的不能移动的活性基团，又称功能基团；与功能基团以离子键联结的可移动的平衡离子，亦称活性离子。如聚苯乙烯磺酸型钠树脂，其骨架是聚苯乙烯高分子塑料，活性基团是磺酸基，平衡离子为钠离子。离子交换树脂的活性基团是决定其交换特点的主要物质基础，它决定了树脂是酸性的阳离子交换剂还是碱性的阴离子交换剂以及交换能力等诸多因素，同时也是离子交换树脂分类的主要依据。

离子交换树脂可依据不同的分类方法进行分类，按树脂骨架的主要成分不同可分为苯乙烯型树脂，如001×7；丙烯酸型树脂，如112×4；环氧型树脂，如330；酚醛型树脂，如122等。按制备树脂的聚合反应类型不同可划分为共聚型树脂，如001×7；缩聚型树脂，如122。按树脂骨架的物理结构不同可分为凝胶型树脂，如201×7，也称微孔树脂；大网格树脂，如D-152，也称大孔树脂；均孔树脂，如Zeolitep，也称等孔树脂。按活性基团的性质不同可分为含酸性基团的阳离子交换树脂和含碱性基团的阴离子交换树脂，阳离子交换树脂可分为强酸性和弱酸性两种，阴离子交换树脂可分为强碱性和弱碱性两种。

强酸性阳离子交换树脂活性基团为磺酸基团和次甲基磺酸基团。它们都是强酸性基团，其电离程度大而不受溶液pH变化的影响，在pH 1.0～14.0范围内均能进行离子交换反应。强酸性树脂常应用于水处理和氨基糖苷类抗生素提取中。如纯化水的制备，链霉素、卡那霉素、庆大霉素、巴龙霉素、新霉素、去甲基万古霉素以及杆菌肽等抗生素制备中的分离。

弱酸性阳离子交换树脂活性基团为羧基、酚羟基及β-双酮基等。弱酸性树脂的电离程度受溶液pH变化的影响很大，在酸性溶液中几乎不发生交换反应，其交换能力随溶液pH的下降而减少、随pH的升高而递增。弱酸性树脂与H^＋结合力强，故易再生成氢型，耗酸量较少。

强碱性阴离子交换树脂活性基团是季铵基团，有三甲氨基（强碱Ⅰ型）和二甲基-β-羟基乙基氨基（强碱Ⅱ型）。其活性基团电离程度较强，不受溶液pH变化的影响，在pH 1.0～14.0范围内均可使用。这类树脂制成氯型时较羟型稳定，耐热性亦较好，主要用于制备无盐水及抗生素生产中，如用于卡那霉素、巴龙霉素、新霉素的精制。

弱碱性阴离子交换树脂活性基团有伯氨基、仲氨基、叔氨基等基团。由于基团的电离程度弱，交换能力受溶液pH变化的影响很大，pH越低，交换能力越高，反之则小。生产上常用330树脂吸附分离头孢菌素C，并用于博来霉素、链霉素等的精制。

此外，还有含其他功能基团的螯合树脂、氧化还原树脂以及两性树脂等。

（3）离子交换工艺过程　离子交换过程是指被交换物质从料液中交换到树脂上的过程，分正交换法和反交换法两种。正交换是指料液自上而下流经树脂，这种交换方法有清晰的离子交换层，交换饱和度高，洗脱液质量好，但交换周期长，交换后树脂阻力大，影响交换速度。反交换的料液是自下而上流经树脂层，树脂呈沸腾状，所以对交换设备要求比较高。生产中应根据料液的黏度及工艺条件选择，大多采用正交换法。当交换层较宽时，为了保证分离效果，可采用多罐串联正交换法。

① 离子交换　在操作时须注意，树脂层之上应保持有液层，处理液的温度应在树脂耐热性允许的最高温度以下，树脂层中不能有气泡。离子交换过程可以是将目标产物离子化后交换到介质上，而杂质不被吸附，从交换柱中流出，这种交换操作，目标产物需经洗脱收集，树脂使用一段时间后吸附的杂质接近饱和状态，就要进行再生处理。为了避免在交换过程中造成交换柱的堵塞和偏流，样品溶液须经过滤或离心分离处理。交换至穿透点时，应停止交换，进行洗脱或再生。

② 洗涤　离子交换完成后，洗脱前树脂的洗涤工作相当重要，其对分离质量影响很大。洗涤的目的是将树脂上吸附的废液及夹带的大量色素和杂质除去。适宜的洗涤剂应能使杂质从树脂上洗脱下来，还不应和有效组分发生化学反应。如链霉素被交换到树脂上后，不能用氨水洗涤，因NH与链霉素反应生成毒性很大的二链霉胺，也不能用硬水洗涤，因为水中的Ca^2＋、Mg^2＋等可将链霉素交换下来，造成收率降低，目前生产中使用软水进行洗涤。常用的洗涤剂有软化水、无盐水、稀酸、稀碱、盐类溶液或其他络合剂等。

③ 洗脱　离子交换完成后，将树脂吸附的物质释放出来重新转入溶液的过程称作洗脱。洗脱是用亲和力更强的同性离子取代树脂上吸附的目的产物。洗脱剂可选用酸、碱、盐、溶剂等。其中酸、碱洗脱剂是通过改变吸附物的电荷或改变树脂活性基团的解离状态，以消除静电结合力，迫使目的物被释放出来。盐类洗脱剂是通过高浓度的带同种电荷的离子与目的产物竞争树脂上的活性基团，并取而代之，使吸附物游离出来。

④ 再生　树脂的再生就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程，包括除去其中的杂质和转型，需要再生的树脂首先要去除杂质，即用大量的水冲洗，以去除树脂表面和孔隙内部物理吸附的各种杂质，然后再用酸、碱、盐进行转型处理，除去与功能基团结合的杂质，使其恢复原有的静电吸附及交换能力，最后用清水洗至所需的pH。如果树脂暂时不用则应浸泡于水中保存，以免树脂干裂而造成破损。

5．亲和色谱

亲和色谱（AFC）是根据生物大分子间高亲和力与高专一性可逆结合而设计的一种独特的色谱分离方法，它是利用偶联了亲和配基的亲和吸附介质为固定相来亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化。目前已经广泛应用于生物分子的分离和纯化中，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。

（1）工作原理　将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。具体工作原理如图1-2-8所示。

（2）亲和色谱分类　 亲和色谱可以分为免疫亲和色谱、金属离子亲和色谱和生物亲和色谱等。

免疫亲和色谱（IAFC）是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分离、分析方法，它是利用抗原与抗体结合的专一性来实现样本提取液中的目标组分的分离与富集，具有选择性强、结合容量大、富集效率高、可重复应用等特点，大大简化了样品的前处理过程，提高了分析方法的灵敏度和可靠性，在残留分析领域中处于越来越重要的地位。随着人们对蛋白质分子结构的深入研究和单克隆技术的成熟应用，以单克隆抗体为亲和配基去分离对应的目标蛋白质，可以实现各种天然、重组蛋白质的高效、快速分离纯化。

金属离子亲和色谱是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力来吸附蛋白质的分离系统。目的蛋白表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合。锌和铜已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。

生物亲和色谱（BAFC）是指利用自然界中存在的某些生物分子对能够相互识别并特异性结合的能力而建立起来的分离纯化系统，通常具有很高的选择性，代表性物质有酶-底物、激素-受体等。可用于以天冬酰胺为配基进行天冬酰胺酶纯化的分离过程。明胶-琼脂糖柱可纯化与细胞黏附有关的糖蛋白纤维连接蛋白（FN），FN与明胶的作用较强，洗脱时使用与FN相互作用更强的精氨酸可使洗脱更有效。将单克隆抗体IgM利用甘露聚糖结合蛋白亲和色谱技术可纯化至95%以上纯度。

（3）载体的选择　理想的载体应具有下列基本条件：不溶于水，但高度亲水；惰性物质，非特异性吸附少；具有相当量的化学基团可供活化；理化性质稳定；机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；能抵抗微生物和醇的作用。可作为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖等，在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附；纤维素的非特异性吸附强；聚丙烯酰胺凝胶是目前的首选优良载体。

6．制备型高效液相色谱法

制备型高效液相色谱（Prep-HPLC）是一种使用高压、大流量液体输送系统在高分辨率、大内径、高载量分离柱上进行样品高纯度分离的液相色谱制备方法。应用该方法分离的产品在纯度、回收率、分离效率等方面远远优于传统的制备方法，因此在生物制品和药物研究与生产领域得到广泛应用。

（1）高效液相色谱（HPLC）中制备型与分析型的区别　同为高效液相色谱，两者的区别主要体现在用途上，分析型的样品通量很小，主要是用来分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量，也就是做样品定性、纯度检测的；制备型是从混合物中得到纯物质，通量是分析型的几百倍、上千倍，也就是满足以较低的成本从混合物中得到纯净物的生产需要，进行快速分离纯化的过程。制备型的高效液相色谱为了达到这个效果，往往要选用大流速的泵（每分钟几十毫升甚至上百毫升）、粗粒径填料、粗管径的色谱柱以提高柱子的载样量。制备型一次可以制备毫克级的样品，甚至大型的专用制备仪器可以制备克级的样品。当色谱柱上样品负载加大的时候，往往导致柱分离效率急剧下降而产品纯度下降。因此制备型HPLC，要解决容量与柱子效果之间的矛盾。从经济上来说，制备色谱要争取少用填料、少用溶剂，要尽可能多地得到产品。

（2）制备型HPLC的应用

① 在蛋白质和多肽分离制备中的应用　蛋白质和肽类药物活性强，生物功能明确，特异性高，但这些产品无论是来自于生物体内还是由化学合成，往往都带有复杂的混合成分，而总目的蛋白或肽类的丰度又低，给分离纯化带来困难。Prep-HPLC通常在分离的最后阶段被用作获得高纯度产品的关键方法，使用Prep-HPLC制备前，蛋白质和肽类样品一般先经过传统分离纯化方法，如盐析、超滤法、凝胶过滤、等电点沉淀、离子交换色谱及亲和色谱等，预先提高纯度，然后再进行高纯度制备。使用比较普遍的色谱柱是烷基反相键合柱，如C₁₈、C₈及C₄等，具体选择时因蛋白质分子量或疏水性而定。流动相大多为甲醇或乙腈等有机相与水的混合体系，通常还添加三氟乙酸，以增加样品的溶解度。

② 在生物碱制备分离中的应用　生物碱是自然界中广泛存在的一大类碱性含氮化合物，是许多中草药的重要有效成分，在中性或酸性条件下以正离子形式存在。通常，人们用阳离子交换树脂从其提取液中富集分离生物碱。但是由于植物中所含的生物碱成分复杂、含量低，因此分离比较困难。Prep-HPLC在生物碱分离制备中应用最普遍的是反相制备方法，流动相根据样品的不同而有很大差异。例如，紫杉醇是从短叶红豆杉中提取或半合成的具有抗癌活性的二萜生物碱，属于广谱抗肿瘤药物，临床应用广泛。但短叶红豆杉资源珍贵，其提取物中紫杉醇的含量极低且含有大量的植物蜡质、色素和树胶等杂质，因而无论是从天然植物红豆杉中还是从培养的植物细胞组织及微生物发酵液中提取紫杉醇，都涉及如何分离并去除与紫杉醇结构相似的其他紫杉烷类化合物的问题。制备液相是紫杉醇纯化应用中的重要手段，并有专用于制备紫杉醇的紫杉醇专用柱。

③ 在糖及其衍生物制备分离中的应用　糖及其衍生物在生物的发育、分化、衰老、免疫调控、病原体识别和防御等方面发挥重要作用。许多药物，如糖苷类抗生素、酶、激素、载体蛋白等的作用活性与糖链紧密相关。分离得到高纯度糖类成分，对研究糖链的结构性质、生产糖类生物制品具有重要的意义。然而糖类分子的化学性质相近，不易分离，而液相色谱的高分辨率特点在糖类分离时具有优势。目前Prep-HPLC用于糖类化合物分离制备的方法主要有分子排阻分离、分配分离和离子交换分离。

（五）膜分离技术

在一定压力下，使小分子溶质和溶剂穿过具有一定孔径的特制薄膜，而使大分子溶质不能透过而留在膜的一侧，从而使大分子溶质得到部分纯化的过程叫做膜分离技术，又称为加压膜技术，如微滤、超滤、反渗透、电渗析、渗透汽化、透析等。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜，有时也采用动物膜等。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。在实际应用中，对膜的选择要符合如下要求：耐压；耐温；耐酸碱性；化学相容性；生物相容性；低成本。

1．膜组件

由膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这些部件的容器构成的一个单元，称膜组件或膜装置。膜组件的结构根据膜的形式而异，目前市售的有四种型式：平板式、管式、中空纤维式和螺旋卷式，如图1-2-9～图1-2-12所示。

2．膜技术分类

根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同，可以分为以下几类。

（1）微滤　微滤是以微滤膜（也可以用非膜材料）作为过滤介质的膜分离技术。微滤膜所截留的颗粒直径为0.2～2μm。微滤过程所使用的操作压力一般在0.1MPa以下。用户收到新膜时，膜被保存在含有微量保湿剂和灭菌剂的环境中，而使用过的膜，则被保存在NaOH的稀溶液中，在以上两种情况中，膜都必须在生物溶液流经以前彻底地冲洗干净。清洗用水最好为干净的去离子水或注射用水。微滤、纳滤和反渗透技术在生化分离工业中也有广泛应用，它们的工作原理与超滤技术相同，区别在于所能截留的小分子物质的粒径大小、操作压力等方面。

（2）超滤　超滤技术是最近几十年迅速发展起来的一项分子级薄膜分离手段，它以特殊的超滤膜为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力，将不同分子量的物质进行选择性分离。超滤膜截留的颗粒直径为20～2000Å（1Å＝0.1nm），相当于分子量为1×10³～5×10⁵ Da，最小截留分子量为500Da，在生化产品生产中可用来分离蛋白质、酶、核酸、多糖、抗生素、病毒等。超滤的优点是没有相的转移，无需添加任何强烈化学物质，可以在低温下操作，过滤速度较快，便于做无菌处理等。所有这些都能使分离操作简化，避免了生物活性物质的活力损失和变性。该法主要用于分离病毒和各种生物大分子。在正式超滤前为了保证整个系统（包括膜、管道、泵等）均处于合适的状态，将该系统充满与生物分子相同的缓冲或生理溶液是非常重要的。通过这一步骤可以达到以下重要目的：pH和离子强度的稳定与一致；温度的稳定；去除空气及气泡。

超滤膜在使用后进行有效的清洗是非常重要的，它可以保证处理各批物料的效果可靠与稳定，延长膜的使用寿命，降低运行成本，对某些重要因素需认真考虑才可以保证适宜的清洗得以实现，如超滤料液性质和污染物种类，而清洗剂的选择必须综合考虑有效性、与膜的化学兼容性和价格便宜以及操作易行等因素。

（3）反渗透　渗透膜的孔径小于20Å，被截留的物质分子量小于1000Da，操作压力为0.7～13MPa，主要用于分离各种离子和小分子物质。其在无离子水的制备、海水淡化等方面广泛应用。

（4）纳米过滤　纳米过滤介于超滤和反渗透之间，它也以压力差为推动力，但所需外加压力比反渗透低得多，能从溶液中分离出分子量为300～1000Da的物质而允许盐类透出，是集浓缩与透析为一体的节能膜分离方法，已在许多工业中得到有效应用。

（5）电渗析　两块半透膜将透析槽分隔成3个室，在两块膜之间的中心室加入待分离的混合溶液，在两侧室中装入水或缓冲液并分别接上正、负电极，接正电极的称为阳极槽，接负电极的称为阴极槽。接通直流电源后，中心室混合溶液中的阳离子向负极移动，透过半透膜到达阴极槽，而阴离子则向正极移动，透过半透膜移向阳极槽，大于半透膜孔径的物质分子则被截留在中心室中，从而达到分离。实际应用时，通常由上述相同的多个透析槽联在一起组成一个透析系统（图1-2-13）。

（6）透析　它是利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜扩散到膜外，而大分子被截留，从而达到分离效果，也称为扩散膜分离。

3. 膜在生物制药技术中的应用

膜的种类不同，所应用对象也有所不同，如表1-2-2所示。由于膜分离技术具有防止杂菌污染和热敏性物质失活等优点，所以在生物制药中应用极为广泛，主要表现如下所述。

（1）细胞循环发酵　如用酿酒酵母进行乙醇发酵时，使发酵液连续通过膜，膜将细胞截留而让乙醇及起抑制作用的副产物连续排至系统外，从而促进菌体的增殖，提高乙醇的生产能力，使发酵操作连续化。

（2）除菌和纯化产品　采用超滤或反渗透方法除去医药用水中的热原，比传统的蒸馏方法更节能、更方便，如英国于1981年初建设的带有反渗透法去热原的游离水生产装置要比传统的蒸馏法优越得多，盐的去除率也在95%以上。同样在氨基酸生产工艺中，使用超滤法能除菌或去热原。

（3）酶、蛋白质等大分子物质的浓缩和精制　采用超滤技术将粗酶液进行处理，低分子和盐类可以与水一起从膜孔渗除，酶被浓缩和精制，目前已达实用化分离的酶有细菌蛋白酶、戊基葡糖苷酶、粗制凝乳酶、凝乳酶、果胶酶、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶、肝素以及β-半乳糖苷酶等，采用超滤法后可大大简化工序，不仅可节能、降低操作成本，还可防止酶的失活，从而大大提高了酶的收率。

（4）膜反应器　可利用膜制作成不同类型的膜反应器，有的用来使酶循环使用而合成甘油酯，有的进行DL-氨基酸的拆分，如使N-乙酰基-DL-蛋氨酸拆分获得L-蛋氨酸。也可进行淀粉酶转化葡萄糖并进一步用酵母转为乙醇，此外也可用膜反应器来生产单克隆抗体等。

（六）蒸馏、蒸发与干燥技术

蒸馏、蒸发与干燥都是生物制药工艺中常用的精制纯化手段，依靠热能进行。例如黄酮类物质的提纯、乙醇的回收、中草药浸出物的浓缩、颗粒的干燥等。

1．蒸馏

蒸馏是一种热力学的分离工艺，它是利用混合液体或液-固体系中各组分沸点不同，使低沸点组分蒸发，再冷凝以分离整个组分的单元操作过程，是蒸发和冷凝两种单元操作的联合。与其他的分离手段，如萃取、吸附等相比，它的优点在于不需使用系统组分以外的其他溶剂，从而保证不会引入新的杂质。常用的蒸馏方法有常压蒸馏和减压蒸馏。

常压蒸馏系指在常压下将溶液加热，变成蒸汽，然后经冷凝器冷却后收集蒸馏液的蒸馏方法，如蒸馏水的制取及药液中水的回收。此法虽然易于操作，但由于受热面积小，液体表面压力大，表面分子必须获得较高温度才能汽化，因此效率较低。减压蒸馏是分离提纯有机化合物的常用方法之一。它特别适用于那些在常压蒸馏时未达沸点即已受热分解、氧化或聚合的物质。有些富含不饱和烯烃类成分的精油，如柑橘类精油，因温度高，易引起“热聚”，减压蒸馏就能降低蒸馏温度，以减轻因热而聚合的现象。所以此法在天然产物有效成分提取、浓缩中常用，可避免高温导致的有效成分活力降低。此外也用于有机溶剂（乙醇等）的回收等中。

2．蒸发

蒸发系指加热溶液使溶剂部分汽化而被除去，从而提高溶液浓度的操作过程。蒸发的条件是溶液不断获得热能，从而不断排除挥发出的蒸气。影响蒸发的因素是温度差、蒸发面积、蒸汽浓度（蒸汽浓度大，分子不易逸出，蒸发慢）、搅拌及液面压力等。减压蒸发、薄膜蒸发因能使蒸发面积增大或减低液面压力等，故蒸发效率较高。

蒸发操作中的热源常采用新鲜的饱和水蒸气，又称生蒸汽。从溶液中蒸出的蒸汽称为二次蒸汽，以区别于生蒸汽。在操作中一般用冷凝方法将二次蒸汽直接冷凝，而不利用其冷凝热的操作称为单效蒸发。若将二次蒸汽引到下一效蒸发器作为加热蒸汽，以利用其冷凝热，这种串联蒸发操作称为多效蒸发。

蒸发操作可以在加压、常压或减压下进行，生物制药工业上的蒸发操作经常在减压下进行，这种操作称为真空蒸发。真空蒸发的优点在于：减压下溶液的沸点下降，有利于处理热敏性物料，且可利用低压力的蒸汽或废蒸汽作为热源。

目前较先进的蒸发方法是使液体形成薄膜而进行蒸发的薄膜蒸发。液体形成薄膜后，具有极大的汽化表面，热的传播快而均匀。该法具有使药液受热温度低、时间短、蒸发速度快、可连续操作和缩短生产周期等优点。

3．干燥

干燥是指从湿物料中除去水分的操作。干燥的方法很多，除用过滤、离心等机械去湿法外，还可用石灰、硅胶剂等物理化学法除湿。这里重点讨论通过汽化作用除去物料中水分的热能去湿法，如真空干燥、红外线干燥、沸腾干燥、气流干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。应注意的是，干燥过程中物料温度升高，操作时需注意酶、蛋白质等热敏性物质的变性。干燥方法的选择应根据物料性质、物料状况及当时的具体条件而定。

（1）气流干燥　被加热以后的空气在管道内快速流动，湿物料进入管道后被高速气流带走向管道出口运行；这个过程中由于对流传热传质的作用使水蒸气被蒸发。由于物料进入管道后被高速气流冲散使二者充分混合，通常在管道出口使用旋风分离器进行气固两相的分离。气流干燥一般干燥的时间在1s左右。

（2）真空干燥　真空干燥的过程就是将干燥物料置放在密闭的干燥室内，用真空系统抽真空的同时对被干燥物料不断加热，使物料内部的水分通过压力差或浓度差扩散到表面，水分子在物料表面获得足够的动能，在克服分子间的相互吸引力后，逃逸到真空室的低压空间，从而被真空泵抽走的过程。

在真空干燥过程中，干燥室内的压力始终低于大气压力，气体分子数少、密度低、含氧量低，因而能干燥容易氧化变质的物料、易燃易爆的危险品等，对药品、食品和生物制品能起到一定的消毒灭菌作用，可减少物料染菌的机会或者抑制某些细菌的生长。较难干燥的膏料可用此法。由于加热温度较低，干燥速率快，故该法在中药制剂中应用较多。经真空干燥后的浸膏呈疏松海绵状，易于热粉碎。

（3）沸腾干燥　又称流化床干燥，是利用热气使湿颗粒悬浮，在“沸腾状态”下热气流在悬浮的颗粒间通过，在动态下进行热交换，带走水分，达到干燥目的。沸腾干燥主要用于湿粒状物料的干燥，如片剂、颗粒剂等的干燥。该法具有干燥效率高，干燥均匀，产量高，适用于同一品种的连续生产，而且温度较低、操作方便、占地面积小等优点。

（4）喷雾干燥　喷雾干燥是系统化技术应用于物料干燥的一种方法。于干燥室中将稀物料经雾化后，在与热空气的接触中，水分迅速汽化，即得到干燥产品。该法能直接使溶液、乳浊液干燥成粉状或颗粒状制品，可省去蒸发、粉碎等工序，适用于热敏性药物，可用于制备微胶囊。

（5）冷冻干燥　在冷冻干燥过程中，需要先对被干燥的药品进行预冻，然后在真空状态下，使水分直接由冰变为汽而使药品干燥。在整个升华阶段，药品必须保持在冻结状态，否则就不能得到性状良好的产品。在药品预冻阶段，要严格控制预冻温度（通常比药品的共熔点低几摄氏度）。如果预冻温度不够低，则药品可能没有完全冻结，在抽真空升华时会膨胀起泡；若预冻温度太低，不仅会增加不必要的能量消耗，而且对于某些生物药品，会降低其冻干后的成活率。

（七）电泳技术

电泳技术，是指在电场作用下，带电颗粒由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为，从而彼此分离开来的一种实验技术。电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐，也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。电泳技术与其他分离技术（如色谱法）结合，可用于蛋白质结构的分析，“指纹法”就是电泳法与色谱法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果，提高了对蛋白质的鉴别能力。所以电泳技术是生物制药中的重要研究技术。

1．电泳的原理

许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子结构及所在介质的pH值和组成。由于混合物中各种组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速率也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离也不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。

2．纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳

纸电泳用于血清蛋白质分离已有相当长的历史，在实验室和临床检验中都曾经广泛应用。自从1957年Kohn首先将醋酸纤维素薄膜用作电泳支持物以来，纸电泳已被醋酸纤维素薄膜电泳所取代。

醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜作固体支持物的电泳技术。醋酸纤维素薄膜具有均一的泡沫状结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，用样量少，分离清晰，无吸附作用，且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。由于操作简单，目前该法已经广泛用于血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇激素及同工酶等的分离分析中（图1-2-14）。

3．琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网格结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

因此，该法适用于大分子物质的分离，如核酸、蛋白质；兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用；且琼脂糖凝胶制备容易，分离范围广。 琼脂糖凝胶电泳使用时，注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象；注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带；对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5%～2%，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析；低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

4. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠（SDS）是常用的表面活性剂，又是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白质- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，使电泳结果只与蛋白质的分子量有关。

聚丙烯酰胺（PAGE）是由丙烯酰胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙烯酰胺，使多聚链交叉互联成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

SDS-PAGE法的优点是：可以把目标分子按分子量大小分开，可以通过调整胶浓度调节迁移速率，可以方便地染色、转印，干胶保存。

5．等电聚焦电泳技术

等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是20世纪60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01 pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。 其原理即利用蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点；在酸性区域的蛋白质分子与此同理，会向阴极移动，至等电点处停止。在操作时可将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。

常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶最常应用。 电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在5%的三氯乙酸中去除两性电解质，然后再以适当的方法染色。