第2节 磁珠法提取质粒DNA
磁珠分离技术已在生物分子分离纯化领域有较为广泛的应用。单分散磁珠粒子，内核是具有超顺磁性的磁芯，外层包被二氧化硅，有非常好的化学稳定性和机械稳定性，其粒径有纳米级、亚微米级和微米级，比表面积大。磁珠法纯化核酸操作简便、快捷，不需要苯酚、氯仿等有毒有机溶剂抽提，无需离心、沉淀等耗时步骤，可配合自动化仪器进行自动化操作，实现高通量提取。纯化的核酸可以直接应用于PCR、酶切、杂交等后续实验。
一、实验目的
掌握使用磁珠法提取质粒DNA，了解提取原理及各种试剂的作用。
二、实验原理
磁性SiO2复合微球与DNA的吸附机理类似于硅类吸附介质：DNA在低pH 值高盐条件下可以吸附沉积到磁性SiO2复合微球表面，当溶液环境转变为高pH 值溶液时，DNA又可以被成功地从磁性SiO2复合微球表面解吸附。DNA/RNA结合到磁珠上主要靠静电作用、疏水作用和氢键作用。细胞或组织在一定的裂解液（胍盐、去污剂、蛋白酶K等）作用下，核酸从生物样本中释放出来，随后核酸在结合液（聚乙二醇、碘盐、高氯酸盐和醇等）存在的条件下，特异性地与二氧化硅磁珠结合，形成核酸-磁珠复合物，该复合体经过磁场作用，从生物裂解液中分离出来，其后复合体经过盐溶液洗涤后去除非特异性吸附的杂质，醇洗涤去除盐分后，可以用TE缓冲液进行洗脱，将核酸纯化。
三、材料、试剂与仪器
1.实验材料
含pET-28a的E.coli。
2.实验试剂
卡那霉素、LB培养液（配制方法见附录Ⅲ）。
磁珠吸附法试剂盒组分：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ及溶液Ⅲ配制见本章第1节，其中溶液Ⅰ使用前加入RNase A（工作浓度为20μg/mL），TE缓冲液配制见附录Ⅲ，70%乙醇。
DNA结合液配制：20g PEG8000溶解于100mL 2mol/L的NaCl溶液中。
100mg/mL Fe3O4@SiO2亚微球：100mg Fe3O4@SiO2亚微球分散到1mL的TE缓冲液中。
3.实验仪器
磁铁或磁力架，其他同碱裂解法提取质粒DNA。
四、实验步骤
1.Fe3O4@SiO2制备［5］
（1）配制物质的量浓度为0.13mmol/mL的FeCl3·6H2O的无水乙二醇溶液，将一定质量的FeCl3·6H2O加入到无水乙二醇中，室温搅拌，直至成为澄清溶液。接着加入CH3COONa、PEG4000，二者的终质量浓度分别为100mg/mL、25mg/mL，反应液的体积不超过反应釜体积的3/5，剧烈搅拌30min，转移至密封高压反应釜中，200℃反应8h。冷却至室温后，将磁性产物用95%乙醇、纯水交替洗涤3次，无水乙醇洗涤2次，磁性分离，磁性粉末即为Fe3O4亚微米磁球，贮存在无水乙醇中，使用前60℃真空干燥过夜。
（2）称取0.5g Fe3O4多孔亚微球，加入1mol/L的NaOH溶液200mL，加热升温至90℃，400r/mim搅拌10min，再加入6mL油酸，反应30min，磁性分离，无水乙醇洗涤5次，得到油基Fe3O4亚微球。
（3）上述油基Fe3O4亚微球用丙酮、乙醇交替洗涤2次，加入15mL正硅酸乙酯（TEOS）、1.5g表面活性剂Triton X-100，超声5min，加入100mL去离子水，超声混匀20min。将上述分散混合液转移到1000mL圆底烧瓶中，加入80mL氨水、200mL无水乙醇，90℃、800r/min搅拌4h，磁性分离，用乙醇和去离子水交替清洗3次，产物即为SiO2包覆的Fe3O4亚微球，即Fe3O4@SiO2，无水乙醇封存。使用前60℃真空干燥。
2.Fe3O4@SiO2提取质粒DNA
（1）取3mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000r/min离心1min，尽量除净上清液（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
（2）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液Ⅰ（确保已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
（3）向离心管中加入250μL溶液Ⅱ，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解。此时菌液应变得清亮黏稠，否则应减少菌体量，菌体过多裂解不彻底。
（4）向离心管中加入300μL溶液Ⅲ，立即快速地上下颠倒混合10～15次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀，12000r/min离心2min。
（5）将离心管中的上清液用移液器转移到另一新的离心管中，加入50μL的100mg/mL磁球、400μL的DNA结合液，颠倒混匀，室温放置5min，其间颠倒混匀数次，防止磁珠沉淀。
（6）磁分离，弃上清液，70%乙醇洗涤2次，开盖挥发残留的乙醇。
（7）加入50～100μL的TE缓冲液，用移液器吸打混匀，室温放置10min，注意防止磁珠沉降。
（8）磁分离，上清液即为收集到的质粒DNA，将其转移到新的离心管中，-20℃保存。
五、结果与分析
（1）溶剂热法制备Fe3O4亚微米粒子及Fe3O4@SiO2亚微米粒子，扫描电子显微镜（SEM）及透射电子显微镜（TEM）观察粒径均为200nm左右（图1-1），均一性良好。Fe3O4亚微米单个粒子的磁响应性远远强于纳米尺寸的单个粒子，非常适合生物大分子的分离。
图1-1 （a）Fe3O4 SEM；（b）Fe3O4@SiO2 SEM；（c）Fe3O4 TEM；（d）Fe3O4@SiO2TEM
（2）获得的质粒DNA分子进一步做琼脂糖凝胶电泳确定，纯度检测同碱裂解法。
六、注意事项
（1）收集菌体提取质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
（2）在添加溶液Ⅱ后，混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，不要在振荡器上剧烈振荡。加溶液Ⅱ后溶液会变澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后则出现絮状沉淀。
（3）使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
（4）在漂洗和洗脱的过程中，为防止磁珠沉降可反复上下颠倒离心管。
七、思考题
简述Fe3O4@SiO2亚微球分离DNA的原理。
（刘长霞）