第五节 放射性脑损伤模型
放射治疗不仅是大脑（原发性、转移性）和头、颈部恶性肿瘤重要的（有时甚至是唯一的）治疗手段，而且在现代化放射治疗技术与综合治疗被广泛使用的今天，已经转化为癌症患者生存率的提高和存活时间的延长。但是，近十多年来已经有一系列的临床研究报道，与过去“放射脑坏死”的诊断不同，在大脑受到照射的肿瘤患者中，无论放疗后早期（一周至数月内）还是较长期（数年），可以发生严重程度不一、临床表现多样的，以学习、记忆及注意力等下降为特点，部分伴随精神、情绪异常的病症；其发生率在5%~55%之间不等，有2%~10%可发展为痴呆。从临床神经病学的分类可以诊断为渐进性的、海马依赖性的认知功能障碍。对于该类放射性副作用（损伤），虽然目前在国内外还没有统一的临床诊断标准、严重程度分级，但“放射性认知功能障碍”的诊断已经为大家所接受与逐步认识。在患者生活质量已成为仅次于生存率（时间）评价放射治疗疗效的今天，该类放射性损伤愈来愈受到放射肿瘤学家的关注。
根据临床症状出现的时间，放射性脑损伤可以分为以下三类：①急性反应，发生于辐射暴露后2周内，甚至发生于放疗过程中。以头痛、恶心、呕吐、乏力等为主要症状。②早期迟发反应，发生于辐射暴露后2周至6个月之间。患者可出现嗜睡、短暂的认知障碍以及脑干脑炎等症状。③晚期迟发反应，发生于辐射暴露后数月至数年。患者有可能有局灶性脑坏死以及轻中度的认知功能障碍。放射性脑损伤的发生机制目前可以概括为：神经系统的炎性反应、神经营养因子信号通路的改变以及海马神经发生受损、血管受损等，涉及神经干/祖细胞明显减少、氧化应激反应增强、血脑屏障受损等多个过程。
放射性认知功能障碍动物模型的建立多选用大鼠、小鼠等啮齿类动物。但是目前尚无统一的、被广泛接受的实验动物模型。各个实验室所用动物品系、年龄以及照射条件各不相同。放射性脑损伤研究中常用的动物品系有C57BL/6J小鼠、Sprague Dawley大鼠、Fischer大鼠、Long-Evans大鼠等。认知功能障碍的发生呈剂量依赖性，在电离辐射后的数小时至1年都有可能出现认知功能障碍。最常用剂量范围为2Gy/1f（生物有效剂量BED=3.33Gy）至40Gy/1f（BED=573.33Gy）。BED超过100Gy可以造成认知损害，但是绝不能将BED=100Gy作为剂量阈值。值得注意的是，采用分次照射的方法来建立动物模型时需要多次将动物麻醉后固定，而多次使用麻醉剂对中枢神经系统的抑制可能导致研究结果的可靠性降低。因此目前大多数实验室选择单次全脑照射的方式用于研究。由于啮齿类动物体型较小，在全脑照射时建议选择高能电子线进行照射以保证脑组织处于剂量分布均匀且高的剂量深度范围内。
通过模拟人体受照过程，常采用全脑照射方式制作放射性脑损伤模型，探索辐射损伤后神经系统损伤变化规律。将小鼠放入与体型匹配的有机玻璃固定装置内，使其保持清醒状态且固定身体，四肢平铺，呈俯卧位。使用20cm×20cm铅板屏蔽眼睛及颈部等非照射部位，留四个照射孔，孔径1.5cm×4cm，照射上界为双眼后眦连线，下界为双耳后连线。采用医用电子直线加速器全脑照射一次，射线种类为6MeV电子线，剂量为10~20Gy，剂量率为200cGy/min，源皮距为100cm。
照射后每天称量体重，观察脑部皮肤与毛发变化。
在小鼠受照后，按实验所需时间点提前对小鼠进行连续6天的BrdU标记。标记3~4周后，颈椎脱臼处死小鼠，制作脑组织冰冻切片，采用免疫组化分析BrdU+细胞的分化情况，即采用双染的方法同时对BrdU和NeuN进行免疫双染，由此来测定小鼠受照射后新生神经细胞数量的变化。另外，在小鼠受照后对小鼠进行连续3天的BrdU标记。标记后颈椎脱臼处死小鼠，制作脑组织冰冻切片，采用免疫组化分析BrdU+细胞情况，由此来测定小鼠受照射后前体神经细胞数量的变化，见图3-5-1。
在小鼠受照后，按实验所需时间点颈椎脱臼处死小鼠，取出脑组织并提取蛋白，采用western blot或提取RNA、DNA，采用PCR研究神经炎症因子TNF-α、IL-1β等表达水平。
在小鼠受照后，经尾静脉注射荧光染料，按实验所需时间点颈椎脱臼处死小鼠，取出脑组织并制作冰冻切片，显微镜下观察荧光表达水平，荧光染料渗透性增加，提示血脑屏障破坏。同时可使用脑组织切片孵育荧光抗体CD31、CD34等，显微镜下观察皮层、海马部位的血管密度。
旷场实验、Morris水迷宫、新物体和新位置识别实验、主动和被动回避实验是最常用的检测啮齿类动物认知功能障碍的方法。这些认知功能检测试验分别用于评估实验动物的运动能力、焦虑水平、空间学习和参考记忆、再认记忆以及联想记忆。表3-5-1总结了近年来各实验室关于放射性认知功能障碍研究中涉及的行为学检测内容。
在放射性脑损伤动物模型中可以从分子、细胞、组织多层面观察到相应的改变。但目前关于放射性认知功能障碍的发生机制的研究仍是不完全的，需要在合理的动物模型上进一步研究其发生的细胞、分子机制。在综合考虑动物特性、照射条件后建立一个重复性高、被广泛认可的且能真正反映放射性认知功能障碍疾病特征的实验动物模型的工作仍需进行。