11　蛋白质磷酸化修饰组学在脓毒症研究中的应用前景

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，是一种宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能衰竭。研究指出，全球每年约有3150万人罹患脓毒症，而由其致死的人数高达530万，且其发生率仍在逐年增加，严重威胁人类健康。脓毒症的发病机制复杂，目前尚无有效的治疗方法，是全球学者们共同探究、亟待解决的问题。生物体细胞对蛋白质合成后进行的共价加工（即蛋白质翻译后修饰）与许多重要的生命进程控制相关。磷酸化是蛋白质翻译后修饰技术最为重要的一种形式，也是目前研究最多、理解最为透彻的一种翻译后修饰。在脓毒症相关通路中，磷酸化的蛋白质参与并发挥着重要功能。利用蛋白质组学的理念和分析方法，规模化地研究磷酸化蛋白质及其相互作用，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对研究脓毒症相关分子机制提供了一个全新的视角。

一、蛋白质磷酸化修饰组学技术

蛋白质磷酸化修饰是指在蛋白质激酶催化下，ATP上的磷酸基团转移到蛋白质氨基酸残基上的过程，也是生物体内重要的共价修饰之一。在哺乳动物的细胞生命活动中，30%编码在基因组中的蛋白质可以发生磷酸化。能够发生磷酸化修饰的最主要的三种蛋白质分别是丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr），三者比例为 1800∶200∶1。蛋白质磷酸化不同程度地参与细胞调控的各种信号通路，为揭示人类疾病的具体研究机制提供了重要靶点。蛋白质磷酸化修饰组学技术主要分为蛋白质/肽的富集技术、质谱鉴定技术、生物信息学分析。

由于磷酸化蛋白质/肽丰度低，故与传统的蛋白质组学研究技术相比，蛋白质磷酸化修饰组学技术的特点在于其应用了富集技术。高效而简化的富集技术可以为后续磷酸化蛋白或肽段的鉴定提供纯净的样品，直接影响实验的准确性。针对蛋白质复合物的富集水平，目前主要分为基于蛋白质水平的富集和基于肽段水平的富集两种模式。

蛋白质水平富集最常用的富集方法是免疫富集法，即利用抗体的特异性识别磷酸基团并与之结合，从而得到磷酸化蛋白。但由于抗原抗体结合的特异性，此法对抗体的要求较高，而目前商品化的抗体中，仅抗磷酸酪氨酸抗体富集效果尚佳，丝氨酸、苏氨酸由于其抗原决定簇小、空间位阻大且特异性差较少被应用^[9]。

目前研究中比较广泛应用和认可的是基于肽段水平的磷酸化富集，常用的色谱方法有固定金属离子亲和色谱法和金属氧化物亲和色谱法。固定金属离子亲和色谱法因为其亲和力强、纯化率高、简单易行、价格低廉等优点，近些年已在磷酸化富集中得到广泛的应用，常用的金属离子有Fe³⁺、Ti⁴⁺和Zr⁴⁺等。金属氧化物亲和色谱法的具体机制尚不明确，利用最多最成熟的金属氧化物是TiO₂。Thingholm等根据两种富集方法互补的特点，将两种富集方式创造性的结合起来，建立了SIMAC（sequential elution from IMAC）富集策略：先用固定金属离子亲和色谱法对磷酸化肽段进行富集，再用TiO₂进行二次富集，结果中鉴定到的磷酸化肽段数量明显提高。

质谱技术是对磷酸化蛋白及磷酸化位点进行鉴定的重要手段。常用方法有基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法与液相色谱串联质谱法。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法具有高灵敏度、高通量、样品靶点可多次应用测定的特点，经磷酸酯酶处理的肽段，质荷比会产生变化，通过检测这种变化即可确定磷酸化位点。由于液相色谱出色的分离效果，降低了离子抑制效应，所以有人开始用液相色谱串联质谱法分析磷酸化位点。

通过应用定量标记技术，如稳定核素氨基酸细胞培养技术、核素标记相对和绝对定量技术、串联质量标签技术，结合液相色谱-质谱联用是目前使用较普遍的蛋白质定量分析技术，这种联用技术可以实现更高通量的蛋白质定量分析。

近年来，随着磷酸化蛋白质研究的深入，磷酸化的相关数据也在不断积累，为了使数据更好的整合、储存和应用，一大批磷酸化数据库涌现出来，如表1。

二、蛋白质磷酸化修饰组学在脓毒症研究中的应用

蛋白质磷酸化修饰组学相关技术的飞速发展给各个领域的研究提供了新的思路和方法。蛋白质的磷酸化和去磷酸化调节着细胞信号转导、细胞分化、细胞生长和凋亡的整个生命活动过程。蛋白质在蛋白激酶的作用下发生磷酸化，在磷酸酶的作用下发生去磷酸化，且不同酶可修饰不同蛋白质及其位点，增加了研究的多样性。

磷酸化修饰组学的研究，可以为脓毒症的研究提供新的生物标志物，有利于对脓毒症严重程度及预后的判断。Chiarla等发现脓毒症患者血浆高磷酸丝氨酸与病情的严重程度具有相关性，血浆磷酸丝氨酸浓度越高，疾病严重程度和死亡率越高，对脓毒症患者血浆磷酸丝氨酸浓度的测定将为脓毒症的病情诊断提供帮助。

Wang等利用Ser-313位点突变构建使之不能磷酸化的低磷酸化核因子κB抑制蛋白β（inhabitor of nuclear factor kappaBβ，IκBβ）转基因小鼠，研究低磷酸化 IκBβ 对脓毒症小鼠的保护作用。研究发现，盲肠结扎穿孔造模后，Ser-313低磷酸化的IκBβ转基因小鼠血清促炎细胞因子的表达明显低于野生型小鼠，说明低磷酸化Ser-313的IκBβ能够调控免疫应答和炎症反应，起到保护脓毒症小鼠心脏的作用。Lee等发现α-查茄碱的抗炎作用与抑制活化剂蛋白-1有关，在JUK通路中c-Jun氨基端激酶N端反应结构域中的Ser63和Ser73的磷酸化可增强其转录活性，α-查茄碱则可通过减少c-Jun的磷酸化减低活化剂蛋白-1的转录，从而发挥抗炎作用。以上研究发现可为脓毒症相关治疗作用靶点提供新的参考。

脓毒症的发病机制复杂，涉及机体多组织器官、多系统的病理生理变化。目前，利用磷酸化蛋白质组学技术探究脓毒症发病机制相关研究已取得相关进展。彭娜等在研究乌司他丁对脓毒症大鼠心功能及p38丝裂原活化蛋白激酶（mito-gen-activated protein kinase，MAPK）影响中证实，大剂量乌司他丁可抑制大鼠心肌p38MAPK磷酸化，推测乌司他丁对心功能的保护作用可能与p38MAPK通路磷酸化有关。许磊等通过免疫印迹技术对脓毒症患者及健康人血小板总造血系细胞特异性蛋白-1（hematopoietic lineage cell specific protein-1，HS1）和磷酸化HS1进行定量分析，结果显示脓毒症患者磷酸化HS1含量远高于健康人组，Syk、Src激酶能够使HS1磷酸化，继而使之信号转导，此通路与脓毒症引起的血小板异常活化有关。因此，将磷酸化蛋白质组学技术应用到脓毒症研究中，对于脓毒症研究的发展很具有意义。

三、展望

目前，脓毒症研究中蛋白质磷酸化修饰组学的应用还较为局限，相关文献报道较少。蛋白质磷酸化修饰组学的发展依然存在很多限制，包括磷酸化蛋白质/肽丰度低、富集损害及效率不佳、检测鉴定技术的灵敏度低等问题仍待解决。目前有研究表明，发生磷酸化的位点中，大约65%的无功能的磷酸化位点，如何高效的筛选出功能性修饰位点，也对生物信息学的发展提出的较高的要求。因此，完善和提高磷酸化蛋白质组学的相关研究技术，也将会为脓毒症分子机制的研究提供技术保障，应用前景值得期待。

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