第六节　转录因子阻断剂

转录因子（transcription factor）是起正调控作用的反式作用因子，是转录起始过程中RNA聚合酶所需的辅助因子。只有当转录因子识别DNA上的特定序列并与之结合，才能启动特定基因的转录。目前研究认为，转录因子在人体各种应答调节机制中广泛存在，也广泛参与人类疾病的发生发展过程，因而也就成为疾病治疗的关键靶点之一。

一、NFAT阻断剂

活化T细胞的核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）是一类参与T细胞活化、细胞因子（如IL-2、IL-4、IFN-γ等）分泌、细胞表面分子（如CD40L等）表达的转录因子，对于机体的免疫应答至关重要。静息状态下，NFAT存在于胞浆内，被NFAT激酶磷酸化，处于无活性状态。当细胞表面受体接收到活化信号，导致PLC-γ活化，PLC-γ催化PIP2分解产生IP3。IP3促进钙库中的钙释放，进而打开胞膜上的钙通道，使胞内钙浓度升高。钙与CaM结合，激活钙调磷酸酶-CaN，可使NFAT去磷酸化，进而进入细胞核，启动基因转录。目前已知的NFAT家族的5个成员包括：NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4和NFAT5，其中NFAT1-4已明确接受CaN的调节，NFAT1、NFAT2和NFAT4表达于淋巴细胞内，对于淋巴细胞的功能调节是至关重要的。

传统的免疫抑制剂如环孢素（CsA）和FK506可作用于NFAT的上游分子CaN，通过抑制CaN的活性，阻断NFAT去磷酸化与活化。CsA的拟似物ISA247是一种新型免疫抑制剂，与CsA作用原理相同，但比CsA的抑制活性更高，毒副作用更小。ISA247治疗银屑病的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验结果显示，该药对于慢性中重度银屑病患者具有良好的治疗效果，毒副作用小，有助于提高患者生存质量。Erdmann F等从众多2，6-双取代-嘧啶衍生物中，筛选得到了新型的CaN抑制剂CN585（图1-15A）。CN585可抑制CaN活性，抑制NFAT活化，抑制T细胞的活化与细胞因子的分泌。CN585可能成为治疗自身免疫性疾病的新方法。

图1-15　NFAT阻断肽

A.CN585；B.RCAN1；C.NFAT

阻断CaN与NFAT结合的分子历来是免疫抑制剂研究的重点。近几年的研究表明，体内存在着多种内源性CaN抑制因子，包括CaN调节蛋白（RCAN）家族，它们能在生理条件下与CaN相互作用，抑制其磷酸酶活性。人类体内目前已知的RCAN包括三个成员：RCAN1、RCAN2、RCAN3。RCAN1具有两个CaN结合区域：CIC（Calcipressin的CaN抑制子）和PxIxIT（图1-15B）。与之不同的是，RCAN3与CaN的结合仅通过CIC区域完成。尽管RCAN蛋白可能具有以上两个CaN结合区域，但是对于T细胞而言，只有CIC区域负责抑制CaN与NFAT的结合及T细胞的活化，且该CIC区域具有如下保守序列：LGPGEKYELHA（G/A）T（D/E）（S/T）TPSVVV HVC（E/D）S。依据RCAN蛋白CIC保守序列，Mulero MC等合成了一系列的多肽，其中包括RCAN1198-218和RCAN3183-203，氨基酸序列分别为KYELHAATDTTPSVVVHVCES和KYELHAGTEST PSVVVHVCES。实验表明，两个多肽均可与CaN的A亚基（CnA）高亲和力结合，抑制NFAT与启动子的结合，发挥免疫抑制活性。但出乎意料的是，RCAN1198-218和RCAN3183-203却不能抑制CaN的磷酸酶活性，这可能是因为两个多肽与CnA的结合位点并非其活性部位，它们可通过其他特殊的机制抑制CaN-NFAT信号传导。

每个NFAT分子的C端或N段都有两个或更多的剪接体和一个保守的中间核心区域。核心区域内包括两个保守的串联结构域，一个调节结构域（又称NFAT同源结构域，NHR）和一个DNA结合结构域。NFAT调节结构域的C段和N段分别具有一个CaN结合区域，是NFAT功能调节的关键部位。N端的CaN结合区域包含一个保守的氨基酸序列PxIxIT（图1-15C），其中x可谓任意氨基酸。根据此保守区域合成的多肽VIVIT（氨基酸序列：MAGPHPVIVITGPHEE）可抑制NFAT与CaN的相互作用，抑制NFAT的去磷酸化和抑制T细胞NFAT依赖的基因转录，如IL-2、IL-13、TNFα等。11R-VIVIT是VIVIT的衍生物，它在VIVIT的C端加上了11个精氨酸残基，以辅助VIVIT进入真核细胞。最近研究表明，11R-VIVIT能够通过抑制NFAT活化，治疗压力诱导的心脏肥大。

除了PxIxIT保守序列外，NFAT调节结构域-C端有另一个CaN结合位点，具有LxVP的保守序列。Martínez-Martínez S等人根据人类NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4的LxVP基序合成了一组多肽，结构依次为：DQYLAVPQHPYQWAK、ESILLVPPTWPKPLV、 DQFLSVPSPFTWSKP、 MDYLAVPSPLAWSKA，依次命名为LxVPc1、LxVPc2、LxVPc3、LxVPc4。同时合成了包含NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4的Px-IxIT基序的一组多肽。试验结果显示，LxVPc1、Lx-VPc3、LxVPc4能取代NFAT与CaN的结合，其活性强于相应的PxIxIT肽，其中LxVPc1可抑制NFAT1和NFAT2两种蛋白与CaN的结合，抑制CaN的催化活性及NFAT的转录活性。出乎意料的是，同样具有LxVP基序的LxVPc2并不能与CaN结合。其原因可能是与LxVP基序中的Leu相连的第三位氨基酸为芳香族氨基酸（Phe和Tyr），对于此类多肽与CaN的结合是很重要的，LxVPc1、LxVPc3、LxVPc4中该位置均为芳香族氨基酸（Phe或Tyr），只有Lx-VPc2为Ile。此外，只有LxVPc2中与LxVP基序Pro相连的8位氨基酸是Pro，这种连续的Pro可能干扰了多肽与CaN的结合。在LxVPc1中，13位的Trp也是不可取代的，若发生W13A的突变则多肽活性消失。因此，若将LxVPc2中的氨基酸作I3Y或P13W的突变，其与CaN的结合能力上升，若同时进行双突变，则活性更高。

二、FoxP3抑制剂

CD4+CD25+调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）是体内具有免疫抑制活性的T细胞亚群，可通过直接接触、分泌细胞因子等方式抑制多种免疫细胞如DC、T细胞、B细胞等的功能。Foxp3对于CD4+CD25+调节性T细胞的发育及功能是至关重要的，Foxp3缺乏的小鼠不能产生CD4+CD25+Treg细胞，且易患头屑状炎性疾病，而将正常CD4+CD25+Treg细胞转移至Foxp3缺乏的小鼠可以预防这种疾病。Casares N等研究者利用GST融合蛋白钓取的方法，从噬菌体展示多肽库中筛选得到了一个能与Foxp3结合的多肽P60（RDFQSFRKMWPFFAM）。P60可进入细胞抑制Foxp3向核内转移，降低其抑制NFκB和NFAT功能的能力，抑制Treg的免疫调节功能。此外，P60还可抑制T效应细胞Foxp3和Il-10mRNA的转录，促进CD3单克隆抗体诱导的IFN-γ的转录，促进效应T细胞的活化。体内注射P60可增强肿瘤肽类疫苗的生物活性，增强其诱导的抗肿瘤免疫应答。该多肽将来有可能成为肿瘤的辅助方法之一。