第三节　降解法制备

多糖降解产物的相关产品在医药、保健食品、食品添加剂等领域的开发和应用已经比较广泛，产业前景十分广阔。制备低Mr多糖的方法很多，并且各自具有不同的特点。目前降解方法主要有三大类：化学降解法、物理降解法和生物降解法。

一、化学降解法

常用的方法有亚硝酸降解法（nitrite degradation）、酸降解法（acid degradation）、氧化降解法（oxidation degradation）以及 β-消除降解法（β-elimination degradation）。

（一）亚硝酸降解法

亚硝酸（HNO2）是常用的解聚剂，它在酸性溶液中具有强氧化性。一般是将多糖溶解于乙酸溶液中，在搅拌下缓慢滴入一定量的NaNO2溶液，使之发生重氮化反应，脱去一分子N2，引起分子内重排使大分子链断裂，再用NaBH4还原端基，完成降解反应。这是传统的化学降解方法，降解产物的Mr可以通过改变NaNO2的加入量、溶液的pH和反应时间来控制。但HNO2降解法的主要缺陷在于：产品的Mr分布太宽，均一性差；降解过程中破坏了氨基，而有一些多糖良好的生物相容性主要由氨基提供的，氨基数量的减少使其应用受到了限制；生产的废物污染严重。

采用亚硝酸控制解聚制备的一些低分子肝素（LMWH）已经成功商业化，包括达肝素钠、那曲肝素钙等，国内常用此法降解壳聚糖并提取产物中的单糖组分。

（二）酸降解法

酸降解法是降解多糖的传统方法。多糖在酸性溶液中多不稳定，会发生糖苷键的断裂，形成聚合度不等的片段。通常采用硫酸、盐酸、磷酸、三氟乙酸等来降解。

1.盐酸降解法

一般是用浓盐酸在较高的温度下降解，降解得到低聚合度的寡糖。研究表明，盐酸浓度和温度越高，降解速度也越快。盐酸降解法虽然工艺简单易行，但较难控制，得到的寡糖主要为单糖和双糖，四糖以上的寡糖含量非常低，此外，该方法对环境的污染也相当严重。

2.磷酸降解法

鉴于强酸对多糖的降解过于剧烈，有人便提出用较弱的酸来降解。有人对浓磷酸降解植物多糖作了较为深入的研究，所得到的产品分子量分布都比较窄，均一性好，可见，用浓磷酸降解法得到寡糖是可行的。但是，该方法反应周期较长，应用于生产有一定的困难，且产率也不够高。

3.其他酸降解法

三氟乙酸（TFA）降解多糖，降解液经减压蒸发除去TFA，可避免传统的中和步骤。此外，还有乙酸降解法、氟化氢降解法等。

（三）氧化降解法

过氧化氢（H2O2）氧化降解具有反应速度快、产率高、反应物无毒等优点，是一种理想的化学降解方法。该法是将多糖溶解在醋酸溶液中，加入H2O2溶液进行均相降解反应，再用氢氧化钠溶液中和，加入过量无水乙醇沉淀，最后分离得到多糖降解产物。

利用H2O2氧化降解多糖时，H2O2的浓度高有利于降低产物的Mr，提高水溶性多糖的收率。本方法的缺点是：工艺条件较难掌握，反应的稳定性和重复性差；若温度和H2O2浓度过低，则需要延长反应时间，这会影响产品的外观品质。利用H2O2的氧化降解，在Cu2+的催化下，已经成功制备了低分子肝素——帕肝素钠（parnaparin sodium），帕肝素钠是新一代肝素类抗血栓药物的代表产品之一。

除了单纯用H2O2降解之外，还可以在H2O2中混入其他的化学物质以提高降解速率。相对于单一的氧化剂来说，混合氧化剂降解效率更高，同时，降解过程对降解产物中氨基含量的影响很小。

（四）β-消除降解法

糖苷键的β-位有吸电子基团时，使α-位氢活化，在碱液中与糖苷键发生消除反应而开裂，称β-消除反应（β-elimination reaction）。其机制为：在1，3或1，4连接的聚糖中，还原端的游离醛（或酮）邻位氢活化而与3-O-或4-O-苷键起消除反应。这样碱能使多糖还原端的单糖逐个剥落，对非还原端则无影响。最典型的例子是依诺肝素钠的制备方法，制备过程包括肝素的季铵化、酯化和降解3步。肝素中糖醛酸的酯化能够增强α-H原子的酸度，使其在水相或非水相介质中更易与亲核基团发生β-消除反应。肝素的季铵盐和卤代苄基化合物在二氯甲烷或二甲基甲酰胺中可以发生酯化反应，生成的肝素酯可在碱性条件下水解成依诺肝素（图2-50）。

二、物理降解法

物理降解法（physical degradation）主要有超声波法（ultrasonic method）、微波法（microwave method）和辐射法（radiation method），与化学降解和酶降解法相比较，物理降解法操作简单、可控性好，如果将这些物理方法与其他方法结合起来会取得更好的效果。

（一）超声波降解法

超声波对多糖的降解作用十分明显，因此超声波法应用比较广泛。选用适当频率和功率的超声波照射多糖，能有效地将大分子链打断。目前，有两种观点解释声波的降解机制：一种观点认为，在声波的作用下溶剂分子高速运动对键发生剪切作用；另一种观点认为是空腔爆裂时释放的冲击波能量使聚合物降解。与其他方法相比较，超声波降解法表现出节省能源和时间、简化操作程序、减少有机溶剂使用、提高反应速率、显著降低化学反应产生的废弃物对环境造成的危害等优点，但是该法突出的缺点是收率太低，导致生产成本过高，要实现工业化应用还有待于进一步研究。

（二）微波降解法

关于微波加速有机反应的原因目前学术界有两种不同的观点：一种观点认为微波对化学反应的加速主要归结为对极性有机物的选择加热，即微波的致热效应；另一种观点认为，微波对化学反应的作用是非常复杂的，除了具有热效应外还存在一种不是由温度引起的非热效应。有机反应在微波的作用下，改变了反应动力学，降低了反应活化能。

采用微波辐射对多糖进行水解反应已有报道，例如微波降解壳聚糖。有研究发现微波能在较短的时间内、较温和的条件下将植胶降解成单糖或寡糖。郭学平等对微波降解制备低分子透明质酸的方法进行了研究，并进行了降解条件优化，获得了制备中分子透明质酸的最佳反应条件。

（三）辐射降解

辐射降解（radiation degradation）是无须添加物的固相反应，成本低，反应易控，无污染，产品品质高，降解后生物相容性不受影响，具有广阔的发展前景。李治等用γ-射线照射壳聚糖使之发生辐射降解，壳聚糖发生的降解遵循无规降解动力学规律，降解过程中壳聚糖的脱乙酰化度略有升高，反应主要由壳聚糖分子链上的C1-O-C4键断裂引起，在降解过程中生成了δ-内酯结构的端基。红外光谱分析表明，在γ-射线的照射下，壳聚糖主链上的β-（1，4）糖苷键发生断裂，导致Mr下降，辐射降解过程中没有产生羰基，也没有使壳聚糖发生交联形成支链或网状结构。

三、生物降解法

生物降解法主要是酶降解法（enzyme degradation），由于酶降解法可特异性地、选择性地切断糖苷键，与化学降解相比，酶降解反应条件温和、不需要加入大量的反应试剂、降解速度快，克服了化学降解产品分子量分布宽、均一性差的缺点，是一种较为理想的降解方法。但酶对周围环境很敏感，溶液中各种因素如温度、氢离子浓度、酶浓度、底物浓度等都能显著地影响酶的催化反应速度，甚至使酶失去催化能力。目前已发现多种专一性和非专一性酶可用于催化多糖类物质的降解反应。

1.专一性水解酶

（1）壳聚糖酶：

壳聚糖酶（chitosanase）是20世纪70年代初期发现的一种酶，分布于细菌、放线菌、真菌、病毒、植物等广泛的生物群中，其主要作用在β-（1，4）氨基葡萄糖苷键，以内切作用方式催化水解壳聚糖生成聚合度为6～8的低聚糖聚合物。壳聚糖酶的最适pH为4.0～6.8。

（2）溶菌酶：

溶菌酶（lysozyme）广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中可以找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多，植物组织及微生物细胞中也存在。溶菌酶催化壳聚糖降解是以内切方式作用于壳聚糖，断开糖链上的β-（1，4）糖苷键。反应后期，反应速率减慢，可能是由于反应的壳聚糖浓度降低，降解产物的生成减慢而逐渐增大逆反应过程。壳聚糖在相同pH条件下，在醋酸中的降解比在含溶菌酶的醋酸中的降解要慢得多，其原因是壳聚糖在含溶菌酶的醋酸溶液中存在着溶菌酶和醋酸共同的催化降解作用，而在醋酸溶液中只有酸的催化降解作用。

2.非专一性水解酶

近年来发现了多种非专一性水解酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、葡萄糖酶、胰酶等。非专一性酶由于价格便宜且稳定性好、降解效率高，因而很有工业化前景。

（1）淀粉酶：

黄永春等研究了超声波条件下α-淀粉酶（α-amylase）对壳聚糖的降解情况。结果表明，超声波能促进α-淀粉酶对壳聚糖的降解作用，并且超声波未改变α-淀粉酶对壳聚糖作用的最适pH和最适温度。其机制可能是超声使溶液体系产生高频振荡作用，使酶和底物的接触频率大大增加，同时产物的释放也加快，从而使降解速度加快。

（2）脂肪酶：

有研究表明，麦胚脂肪酶（wheat germ lipase）在微酸条件下可有效地降解壳聚糖，并且不改变壳聚糖的脱乙酰化度，但产品的Mr分布很宽。这一酶解反应不遵循普通的酶反应动力学模型，反应速度很快。

（3）蛋白酶：

木瓜蛋白酶（papain）与麦胚脂肪酶相似，也可在微酸条件下有效地降解壳聚糖，同样具有很高的降解速度。进一步研究表明，木瓜蛋白酶倾向于优先降解比较长的分子链，其降解产物Mr分布窄，并且平均Mr低。另外，木瓜蛋白酶只选择性地作用在两端分别连接乙酰胺基葡糖单元和氨基葡萄糖单元的β-（1，4）糖苷键，所以这种降解方法要求壳聚糖的脱乙酰化度不能太高。木瓜蛋白酶价格低廉、容易得到，用它降解壳聚糖，反应中酶的活性不变，经过提取后可重复利用，降低了生产成本，是一种具有工业化潜力的降解方法。

研究证明，海洋多糖及其降解产物具有多种新型的生理活性，在医药、化妆品、食品工业及农业等方面具有重要的应用价值。利用从海洋微生物中分离提取的多糖降解酶对海洋生物多糖进行降解，可得到具有新型生物活性的低聚糖组分。人们从海洋微生物中发现了一些能够降解海洋多糖的酶，如几丁质（壳聚糖）降解酶、褐藻胶降解酶、琼胶降解酶、卡拉胶降解酶、纤维素降解酶、岩藻聚糖降解酶等，然后采用基因工程的方法把这些酶的基因导入到受体菌中进行表达，从而得到适合于工业化生产的菌种，规模化生产可以降解海洋多糖的酶，用于海洋寡糖的制备。