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第一节 理化检测技术
化学中毒理化检测样品定量分析过程包括样品采集、保存、前处理、分析方法选择、样品测定、数据处理和结果报告等环节,本节主要介绍了理化检测样品采集、保存、前处理及常用理化分析方法。
一、理化检测样品采集、运输和保存
化学中毒理化检测样品按检测对象分为生物样品和外环境(现场)样品。获得具有代表性的合格样品是化学中毒样品检测成败的关键环节,如果采集的样品不具代表性,或样品在运输及保存过程中损失甚至是污染,就会导致测定结果不可靠,甚至得出错误结果。采样人员应根据中毒患者临床表现、中毒事件现场调查结果及流行病学特点,初步判断中毒原因,有针对性选择采集样品,确定首选样品及其他样品种类,采取相应的样品采集、运输和保存方法。
(一)生物样品采集、运输和保存
化学中毒生物检测样品主要为尿液、血液、毛发、呼出气等。生物样品主要来自人体及人体排泄物,采集样品量有限,且存在个体差异,因此在采集、运输、保存样品时应按照《职业卫生生物监测质量保证规范》(GBZ/T173) [1]要求进行,以保证样品符合检测要求。
1.一般要求
(1)采样时间:
根据毒物在人体的生物半衰期,注意采样时间的选择。
(2)采样环境:
注意周围环境对样品的污染。对作业工人采样应离开工作岗位,清洗取样部位,在清洁无污染环境下采样。
(3)采样容器:
防止采样容器对样品污染,应根据待测毒物、样品种类及保存条件选择容器。用于检测金属时选用一般塑料容器采集,使用前应用3%～10%硝酸浸泡,纯水洗净。用于检测有机物时一般选用玻璃容器采集。
(4)运输和保存:
应防止污染、变质、泄漏等,运输和保存时间不能超过生物样品稳定期。
2.尿液样品
大多数毒物及其代谢物经尿液排出,而且多数毒物在尿中的含量与其在血中的浓度有较大相关,同时尿样收集方便,因此,尿液是最常采集的生物样品。但尿液受饮食、运动和用药的影响较大,也受肾功能的影响,还容易携带干扰物质,所以测定结果需加以校正或综合分析。
尿样采集量通常不少于50ml,未加防腐剂前进行肌酐校正或比重校正,肌酐浓度<0.3g/L或>3g/L、比重<1.010或>1.030的尿样均应弃去重新留样,不能用于检测。
尿样分为24小时尿、晨尿、班前、班后及随机尿。24小时尿代表一天平均水平,结果比较稳定,但收集麻烦,易污染,因此检测多用晨尿。采集尿样后,根据检测要求,加入适当防腐剂,收集容器为聚乙烯瓶或硬质玻璃瓶。
3.血液样品
血液中毒物及其代谢物水平可以反映机体中毒近期情况,常与机体吸收毒物总量正相关,同时血液中成分比较稳定,采样时污染机会少,但由于创伤性采样,采样量和采样次数受限制。通常采集静脉血不少于2ml。检测金属类样品采集时应顺次用0.5%硝酸溶液、去离子水、碘伏消毒采血。样品应注意防止溶血。
(二)空气样品采集、运输和保存
空气样品采集应根据现场调查情况选择采样点,根据待测物在空气中的存在状态及浓度选择适当采样方法,保证采集到足量、合适的样品,以满足检测分析的要求。在样品采集、运输、保存过程中确保待测组分稳定、不受污染。采样应符合《工作场所空气中有害物质监测的采样规范》(GBZ 159)的要求 [2]。
1.直接采样法
适用于浓度较高、气态或蒸气态的化学毒物,常用采样容器包括注射器、采气袋和真空罐。采集的样品一般不需进行样品处理,可直接用于测定,其检测结果反映的是空气中待测物的瞬间浓度。
2.固体吸附管法
适用于现场浓度较低的气态和蒸气态挥发性有机化学毒物,对有毒物质具有富集作用。空气通过装有固体吸附剂的吸收管时待测物被吸附,用适宜溶剂解吸或热解吸处理后检测。常用固体吸附管有活性炭管、硅胶管、Tenax管、XAD树脂等。如空气中的苯用活性炭管采集,二硫化碳解吸后测定。
3.溶液吸收采样法
适用于采集气态、蒸气和气溶胶态化学毒物,具有富集作用。空气通过装有吸收液的吸收管,待测物由于溶解作用或化学反应进入吸收液,达到浓缩目的。如硫化氢、氯气、氨气等可用吸收液采集。常用吸收管有气泡吸收管、多孔玻板吸收管、冲击式吸收管。溶液吸收采集的样品可直接检测或加显色剂后比色测定,也可以通过顶空或萃取方式处理样品。
4.滤膜法
适用于采集空气中气溶胶态(烟、尘、雾)化学毒物,具有富集作用。空气通过滤纸或滤膜,待测物被阻留在膜上,达到浓缩目的。如铅烟(尘)可用醋酸纤维微孔滤膜采集。常用滤膜有超细玻璃纤维滤纸、混合纤维滤膜、聚四氟乙烯滤膜、醋酸纤维微孔滤膜,样品处理的方法有溶液洗脱和样品消化。
5.运输和保存
用固体吸附管采样的样品,采样后,立即封闭固体吸附管两端,置于清洁容器内运输,4℃冰箱保存,不同物质保存期限不一。用滤膜采集的样品,采样后,将滤膜接尘面朝里对折2次,放入清洁塑料袋或纸袋,置于清洁容器内运输,样品在室温下可长期保存。用液体吸收管采集的样品,采样后,应立即密封样品,竖立摆放于流转箱中,平衡运输,并尽快检测分析。
(三)化学中毒现场样品采集、运输和保存
现场样品包括中毒者吃过的食物、水、药物、接触过的化工原料、盛装容器、中毒者呕吐物、胃内容物、洗胃液等。
1.采样原则
注意样品代表性和典型性,尽可能采集含毒物含量最多的部分,不能采用简单混匀的取样方式。
2.有固定包装样品
除采集剩余样品外,还可直接采集原包装产品。
3.散装、均一稳定的液体样品
如水、乳品、酒或其他饮料、植物油等,一般采用密闭性较好的玻璃容器,用虹吸或倾倒方法收集和储存。
4.采样量
尽量多通常采集样品分析量3倍左右,供测定、复核和留样用。
5.样品运输和保存
不同样品选用不同的容器采集,避免毒物分解或挥发损失,通常尽快分析测定,若短时间内不能检测,应低温运输和保存。
二、理化检测样品前处理技术
样品前处理技术(sample pretreatment technology)是指样品制备和对样品采用合适分解和溶解方法以及对待测组分进行提取、净化和浓缩过程,使被测组分转变成可以测定形式,从而进行定性和定量分析的过程。
化学中毒理化检测样品组成比较复杂,待测组分常与其他组分共存,除少数空气和水样外,大多数样品难以直接测定,通常需要对样品进行必要的前处理,通过应用消解、萃取、净化、富集等技术,将样品处理为满足分析方法要求的适当形态才能进行测定。
样品前处理对分析检测来说非常重要,这是因为样品前处理不仅耗费整个分析过程60%以上的时间,而且主要的分析误差也来自样品前处理环节。
(一)无机化处理法(分解法)
样品中无机成分分析的前处理通常要将样品进行无机化处理,破坏样品中的有机物,使有机物分解或呈气体逸出,最终无机待测组分分解为可测定离子状态。前处理方式主要分为湿消化和干灰化两类。
1.湿消化法
通常在适量样品中,加入硝酸、高氯酸、硫酸等氧化性强酸,结合加热来破坏有机物,必要时加入氧化剂(如高锰酸钾、过氧化氢等),或催化剂(如硫酸铜、五氧化二钡等),以加速样品氧化分解,完全破坏样品中原有的有机物,使待测无机成分释放出来,形成各种不挥发性无机化合物,以便进一步分析测定。根据消化的具体操作不同,可分为敞口消化法、回流消化法、冷消化法、密封罐消化法、微波消解法等。
(1)敞口消化法:
这是最常用的消化操作法,通常在凯氏烧瓶或硬质锥形瓶中进行,本法系敞口加热操作,有大量的消化酸雾和消化分解产物产生,故需在通风橱内进行。
(2)回流消化法:
测定挥发性成分时,可在回流消化器中进行。回流消化器上端连接冷凝器,可避免被测定成分挥发损失和烧干。
(3)冷消化法:
又称低温消化法,是将样品与消化酸混合后,置于室温或37～40℃烘箱内,放置过夜。由于是低温消化,可避免极易挥发元素(如汞)的挥发损失,不需特殊设备,较为方便,但仅适用于含有机物较少的样品。
(4)压力罐消化法:
在聚四氟乙烯容器内加入样品和消化试剂,放入压力罐内,置于140～150℃烘箱内消解2～4小时,利用压力提高酸的沸点以加速有机物破坏。与常压下湿消化相比,此法试剂用量少,可有效防止易挥发元素的损失,是较为理想的消化方式,但样品处理量小,通常少于0.5g。
(5)微波消解法:
通常是指利用微波加热封闭容器中的消解液(各种酸、部分碱液以及盐类)和试样,从而在高温增压条件下使各种样品快速溶解的湿法消化法,此法优点与压力罐消化法类似,具有试剂用量少,空白值低,挥发性元素不损失等优点,而且由于微波加热产生高温,比压力罐消化时间短,通常消化时间为10～30分钟,是现在较理想的无机化处理方式,但设备较昂贵。
2.干灰化法
简称灰化法(或灼烧法),亦是破坏有机物质的常规方法。通常将样品放在坩埚内,先在电炉上脱水、炭化,再置于马弗炉高温灼烧灰化,使有机物氧化分解成二氧化碳、水和其他气体而挥发,余下无机物(盐类或氧化物)供分析用。
干灰化法的优点是基本不加(或加很少量)试剂,有较低空白值,能同时处理较多样品,由于灼烧后灰分少,故可加大取样量(在10g左右),从而提高方法灵敏度,适用范围广,操作简单,设备少,过程不需人看守。
干灰化法的缺点是容易造成待测成分挥发损失,特别是As、Sn、Pb、Hg等易挥发元素的损失,其次是高温下坩埚材料对被测定成分的吸留作用,使回收率降低,现在应用较少。
(二)溶剂提取法
用适当溶剂浸泡样品,将目标物转移或溶解到溶剂里,此法对无机物和有机物都适用。
1.水溶法
又称水浸法,可提取水溶性目标物。以纯水做溶剂可提取食品中水溶性色素如柠檬黄、苋菜红等,防腐剂如苯甲酸钠、山梨酸钾,水溶性维生素等。以酸性水溶液做溶剂可浸取在酸性条件下稳定的水溶性目标物,如用4%乙酸或稀硝酸浸泡溶出食品包装材料中的金属元素、血中金属元素可用硝酸溶液洗脱。以碱性水溶液提取酚类、氰化物等目标物。
2.有机溶剂提取法
根据“相似相溶”原理,在样品中提取易溶于有机溶剂的目标物,如用丙酮提取蔬菜水果中的残留农药、提取糕点中的油脂用于酸价检测等。
(三)溶剂萃取法
溶剂萃取法又称液-液萃取法,此法利用样品中不同组分分配在两种不混溶的溶剂中溶解度或分配比不同来达到分离、提取或纯化目的。现在的液-液萃取技术已不只是传统的使用分液漏斗一步液-液萃取,它还包括连续萃取、逆流萃取、微萃取、萃取小柱技术、在线萃取技术、自动液液萃取等方式,其中连续萃取和逆流萃取有利于处理含有低分配系数物质的样品 [3-6];微萃取技术有利于提高灵敏度和减少溶剂用量,但回收率方面还有待提高 [7,8];在线萃取和自动液液萃取等方式能够减少人为误差,有利于处理大体积样品 [9]。
(四)固相萃取法
固相萃取就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附,使其与样品基质和干扰化合物分离,然后再用洗脱液洗脱,达到分离和富集目标化合物的目的。此法现已广泛应用于食品、环境、生物材料等样品的前处理 [10-14],与液-液萃取等传统分离富集方法相比,具有如下优点:
1.高回收率和富集倍数 大多数固相萃取体系回收率较高,可达70%～100%;另外,富集倍数一般很高,多数体系很容易达到几百倍,少数体系甚至能达到几千或几万倍。
2.使用的高纯有毒有机溶剂量很少,减少了对环境污染,是一种对环境友好的分离富集方法。
3.无相分离操作,易于收集分析物组分,能处理小体积试样。
4.操作简便、快速、易于实现自动化 [13]。
固相萃取也存在某些不足,有待于进一步发展和完善。例如一些样品的复杂基质会较大程度降低萃取回收率;污染严重的复杂样品尤其是含有胶体或固体小颗粒的样品会不同程度堵塞固定相的微孔,引起柱容量和穿透体积降低、萃取效率和回收率严重降低;柱体和固定相材料纯度有时仍不够理想,使得测定空白难以进一步降低;固定相选择性有时仍显不足,需进一步提高等。
(五)固相微萃取法
固相微萃取技术是在固相萃取技术基础上发展起来的,与液液萃取或固相萃取相比,操作时间短,样品量少,无需萃取溶剂,适于分析挥发性和非挥发性物质,重现性好。萃取过程使用一支携带方便的萃取器,特别适于野外现场取样分析,也易于进行自动化操作,可在任何型号气相色谱仪上直接进样。研制选择性强、灵敏度高、涂层稳定的新型萃取纤维,开发与多种分析仪器联用的自动操作系统等是固相微萃取技术的发展方向 [15-16]。
(六)顶空法
样品中痕量高挥发性物质分析测定的前处理可使用顶空法。顶空法一般可分为静态顶空法和动态顶空法。静态顶空技术是将样品置于顶空瓶中,样品在恒温条件下,达到气液平衡,取上层气体用气相色谱直接分析。动态顶空法是在样品顶空装置中不断通入惰性气体,使其中的挥发性成分随惰性气体流出,并收集在吸附柱,经热解吸或溶剂解吸后分析。现常与固相微萃取技术联合使用,应用于环境、生物材料、食品等检测领域 [15,17-19],其具有如下特点:
1.操作简便
只需将样品填充到顶空瓶中,再密封保存直至色谱分析;
2.自动化
已有市售的集成化气相色谱仪带有顶空进样器,自动化程度高;
3.可变因素多
静态顶空法只需确定顶空瓶中样品的平衡时间和温度,而动态顶空法还需确定捕集阱中吸附剂种类和填充量;
4.灵敏度高
动态顶空具有较高的灵敏度,检出限可达10 -12水平。
(七)热解吸法
热解吸法通常与前面介绍的固相萃取、吹扫捕集、膜萃取等样品前处理技术配合使用,主要利用热解吸装置升温,从固体吸附剂上将挥发性、半挥发性组分解吸下来。热解吸法与气相色谱或质谱联用,具有广泛的应用范围,在环境样品分析方面,主要用于使用吸附管采集的大气样品中挥发性有机污染物的检测 [20-22]。热解吸进样主要特点是可用于复杂样品分析,无需使用溶剂并可实现自动化。其优点是:
1.可进行100%样品组分色谱分析,而不是一部分,由此使灵敏度大大增加;
2.在色谱分析中没有溶剂峰,可进行宽范围挥发性有机物分析,色谱保留时间短的样品组分不会受溶剂峰干扰;
3.不使用有机溶剂,消除了对环境污染。
其缺点是样品完全解吸可能需要较长的时间,需要考察和计算采样量,样品处理的费用可能较高。如果配备冷捕集和二次冷聚焦设备,样品处理时间和费用将进一步增加。
(八)衍生化技术
衍生化技术就是通过化学反应将样品中难于分析检测的目标化合物定量转化成另一易于分析检测的化合物,通过后者的分析检测对可疑目标化合物进行定性和(或)定量分析 [23-25]。衍生化目的有以下几点:
1.将一些不适合某种分析技术的化合物转化成可以用该技术分析的衍生物;
2.提高检测灵敏度;
3.改变化合物性能,改善灵敏度;
4.有助于化合物结构的鉴定。
三、常用理化检测技术
化学中毒检测的毒物含量往往较低,现代仪器分析技术在化学中毒检测中起到重要作用。仪器分析是利用待测组分或其化学反应物所表现的物理或物理化学特性(光学特性、电化学特性等),用分析仪器进行测定并计算待测物含量的方法。通常分为色谱法、光谱法、电化学法等。下面对常用的仪器分析技术进行介绍。
(一)紫外-可见分光光度法
紫外-可见分光光度法是利用物质分子对紫外-可见光谱区(200～800nm)辐射的吸收进行物质组分分析的仪器分析方法。紫外-可见分光光度法检测灵敏度和准确度高,仪器简单,操作方便,仪器价格低廉,适用性广泛,应用于医学、食品、环境、制药等部门 [26,27]。
1.原理
每种物质都有其特有的、固定的吸收光谱,根据朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律,物质在一定波长的吸光度与它的吸收介质厚度和吸光物质浓度成正比,从而计算出该物质含量。
2.仪器结构
紫外-可见分光光度计分为光源、单色器、吸收池、检测器、显示系统等5个部分。
(1)光源:
必须具有稳定、足够输出功率、能提供仪器使用波段的连续光谱,如用钨灯、卤钨灯(波长范围350～2500nm)作为可见光部分光源,氘灯或氢灯(150～400nm)作为紫外光部分光源。
(2)单色器:
它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件(棱镜或光栅)组成,是用以产生高纯度单色光束的装置,其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需单色光束。单色器核心部件为色散元件,现多用光栅,光栅与棱镜相比其优点在于光栅的色散是线性的,即在不同波段范围,波长差相等的光被分开的距离基本相同,而棱镜的色散是非线性的。
(3)吸收池:
供盛放试液进行吸光度测量之用,也叫比色皿,分为石英池和玻璃池两种,前者适用于紫外到可见区,后者只适用于可见区。容器光程一般为0.5～10cm。在定量分析时,所用吸收池需挑选,在同一型号的一组吸收池装入同一空白溶液于同一测定波长下测定透光度,透光度之差应<0.5%。
(4)检测器:
又称光电转换器。常用光电管和光电倍增管,后者较前者更灵敏,特别适用于检测较弱辐射。近年来仪器上还使用二极管阵列检测器,此检测器具有快速扫描的特点,可获得紫外-可见全光谱,有利于方法开发和辅助定性检测。
(5)显示系统:
将吸光度或透光率结果显示出来,这部分装置发展较快,现在高级的分光光度计常配有电脑及化学工作站,可控制仪器,并可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
3.仪器条件选择
(1)检测波长选择:
根据“吸收大、干扰小”原则选择检测波长。
(2)吸光度读数范围选择:
吸光度一般在0.2～0.8范围内读数,可获得较高的准确度。在分析时可通过控制溶液浓度及改变吸收池厚度等手段尽量使吸光度落在此范围内。精度高的仪器,此范围也可以更宽。
(3)参比溶液选择:
参比溶液也称空白溶液,测量试液吸光度前,需用参比溶液调节透光度 T为100%,吸光度 A为0(双波长分光光度法除外),以消除溶液中其他成分、吸收池、溶剂等对入射光的反射、折射、吸收所带来的影响。常用参比溶液有溶剂参比(溶剂空白)、试剂参比(试剂空白)、试样参比(试样空白)、平行操作参比(平行操作空白)等,应根据不同情况选择。
4.影响显色反应的因素及样品检测注意事项
进行分光光度法测定时,常利用适当试剂与待测物反应使待测物转化为吸光系数较大的化合物进行测定,此反应叫显色反应。影响显色反应的因素较多,如显色剂用量、体系酸度、显色温度、显色时间、干扰物等。因此在样品检测过程中应注意以上影响因素,并在试剂使用方面注意纯度和有效期,在操作过程中注意严格按方法要求,控制试剂用量、反应温度和时间,并在显色稳定期内测定。
5.定量方法
紫外-可见分光光度法定量分析基础是朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律。主要定量方法为标准曲线法,标准曲线浓度点一般要求5点以上,相关系数0.999以上。
(二)原子吸收光谱法
原子吸收光谱法作为测定痕量和超痕量元素分析的有效方法,在地质、冶金、机械、化工、农业、食品、轻工、生物医药、环境保护、材料科学等各个领域有广泛的应用。
1.原理
原子吸收光谱法亦称原子吸收分光光度法,是基于试样蒸气相中被测元素基态原子对由光源发出的该原子特征性窄频辐射产生共振吸收,其吸光度在一定范围内与蒸气相中被测元素基态原子浓度成正比,以此测定试样中该元素含量的一种仪器分析方法。
2.仪器结构
原子吸收光谱仪由光源、原子化器、分光器、检测系统等几部分组成。
(1)光源:
光源的功能是发射被测元素特征共振辐射。对光源的基本要求是:发射的共振辐射半宽度要明显小于吸收线半宽度;辐射强度大、背景低,低于特征共振辐射强度1%;稳定性好,30分钟之内漂移不超过1%;噪声小于0.1%;使用寿命长于5安培小时。空心阴极放电灯是能满足上述各项要求的理想锐线光源,应用最广。
(2)原子化器:
其功能是提供能量,使试样干燥、蒸发和原子化。在原子吸收光谱分析中,试样中被测元素的原子化是整个分析过程关键环节。实现原子化的方法,最常用两种:①火焰原子化法:是原子光谱分析中最早使用的原子化方法,至今仍在广泛地被应用;②非火焰原子化法:其中应用最广的是石墨炉电热原子化法。
(3)分光器:
它由入射和出射狭缝、反射镜和色散元件组成,其作用是将所需要的共振吸收线分离出来。分光器关键部件是色散元件,现在商品仪器都是使用光栅。光栅放置在原子化器之后,以阻止来自原子化器内所有不需要的辐射进入检测器。
(4)检测系统:
原子吸收光谱仪中广泛使用的检测器是光电倍增管,最近一些仪器也采用CCD作为检测器。
3.仪器条件选择
(1)分析线:
通常选择灵敏线或者干扰较小的谱线,如Cu选324.7nm、K选766.5nm;选择分析谱线避免重叠,如Au242.8nm谱线与Co242.5nm线可能重叠;如果样品中待测元素含量较高,可以选择次灵敏线。
(2)灯电流选择:
空心阴极灯在使用前需要预热,一般预热30分钟左右,才可以稳定。对于微量元素分析,应在保证读数稳定前提下,尽量选择小一些的灯电流,以获得足够高的灵敏度;对于高含量元素分析,应该在保证足够灵敏度前提下,尽量选择用大一点的灯电流,以获得足够高的精密度。
(3)火焰类型选择:
贫燃火焰(燃助比约为1∶6),适用于Cu、Ag、Au、Cd、Zn等元素测定,化学计量焰(燃助比为1∶4),适用于Ca、Mg、Fe、Co、Ni、Mn等元素测定,偏富焰火焰(燃助比为1∶3.5),适用于Ca、Sr等元素测定,富焰火焰(燃助比约为1∶3),适用于Cr、Sn、Mo等元素测定,富氧或氧化亚氮-乙炔火焰,必须在富燃空气——乙炔火焰情况下,才能转化为富氧或氧化亚氮-乙炔焰工作,适用于Al、Ba、Ca、Mo、Sn等元素测定,应用氧化亚氮火焰要保持红羽毛焰状态。
(4)燃烧器高度选择:
燃烧器高度影响测定灵敏度、稳定性和干扰程度。火焰中原子密度是不均匀的,燃烧器高度的选择目的是使特征光束通过基态原子最密集区域或中间薄层区,选择原则以光通过中间层为好。
(5)程序升温条件选择:
在石墨炉原子化法中,合理选择干燥、灰化、原子化及除残温度和时间十分重要,干燥应在稍低于溶剂沸点的温度下进行,以防止试剂飞溅。灰化目的是除去基质干扰组分,在保证待测元素不损失前提下应尽可能使用较高的灰化温度。选择达到最大吸收信号的最低温度为原子化温度。原子化时间应以保证完全原子化为准。原子化阶段停止保护气,以延长自由原子在石墨炉内平均停留时间。除残温度应高于原子化温度,以消除残留物记忆效应。
(6)狭缝宽度选择:
在保证只有分析线通过狭缝到达检测器前提下,尽可能选用较宽的光谱带宽,以获得较好的信噪比和稳定的读数。
(7)进样量选择:
进样量过小,吸收信号弱,不利于测量;进样量大,在火焰原子化法中对火焰产生冷却效应,在石墨炉原子化法中会增加除残困难。在实际工作中,应测试吸光度随进样量变化,达到最满意吸光度时的进样量,即为应该选择的进样量。
4.定量方法
原子吸收光谱法定量主要采用标准曲线法,定量基本过程为先将样品制备成溶液形态,并制备样品空白和一系列已知浓度被分析元素的校正溶液(标样),测定空白及标样响应值,绘出校正曲线,测出未知样品响应值;依据校正曲线及未知样品响应值得出样品相应组分的浓度值。
5.注意事项
(1)校正曲线服从郎伯-比尔定律,待测元素浓度高时,会出现校正曲线变弯,样品超出线性范围需稀释样品。
(2)最佳分析范围的吸光度在0.1～0.5之间,校正曲线的点在5个以上。
(3)基质复杂样品需做工作曲线。
6.方法评价
(1)检出限低:火焰原子吸收光谱法检出限可达ng/ml量级,石墨炉原子吸收光谱法检出限可达10 -13～10 -14 g。
(2)选择性好:由光源发出特征性入射光很简单,且基态原子是窄频吸收,元素之间干扰较小,可不经分离在同一溶液中直接测定多种元素。
(3)精密度高:由于温度变化对测定影响较小,该法具有良好稳定性和重现性,精密度好。一般仪器相对标准偏差为1%～2%,性能好的仪器可达0.1%～0.5%。
(4)抗干扰能力强:原子吸收线数目少,一般不存在共存元素的光谱重叠干扰。干扰主要来自化学干扰。
(5)样品用量小:火焰原子吸收光谱法测定的进样量为3～6ml/min,微量进样时甚至可以小至10～50μl,石墨炉原子吸收光谱法测定的液体进样量为10～20μl,固体进样量为mg量级。
(6)分析范围广:原子吸收光谱分析只需要使化合物离解成原子,不必激发,所以测定的是大部分原子。目前应用原子吸收光谱法可测定的元素达73种。就含量而言,既可测定低含量和主量元素,又可测定微量、痕量甚至超痕量元素;就元素性质而言,既可测定金属元素、类金属元素,又可间接测定某些非金属元素,也可间接测定有机物;就样品状态而言,既可测定液态样品,也可测定气态样品,甚至可以直接测定某些固态样品,这是其他分析技术所不能及的。
(7)一般不能多元素同时分析。测定元素不同,必须更换光源灯,这是原子吸收光谱法不便之处。原子吸收光谱法测定难熔元素的灵敏度还不怎么令人满意。在可以进行测定的70多个元素中,比较常用的仅30多个。
(8)标准工作曲线线性范围窄(一般在一个数量级范围),这给实际分析工作带来不便。对于某些基质复杂的样品分析,尚存某些干扰问题需要解决。在高背景低含量样品测定中,精密度下降。
如何进一步提高灵敏度和降低干扰,仍是当前和今后原子吸收光谱分析工作者研究的重要课题。
(三)原子荧光光谱法
原子荧光光谱法是通过测量待测元素原子蒸气在辐射能激发下产生的荧光发射强度,来确定待测元素含量的方法。该方法具有很高的灵敏度、校正曲线线性范围宽、能同时测定多个元素等优点,因此在冶金、地质、石油、农业、生物医学、地球化学、材料科学、环境科学等领域广泛应用。
1.原理
气态自由原子吸收特征波长辐射后,原子外层电子从基态或低能级跃迁到高能级经过约10 -8 s,又跃迁至基态或低能级,同时发射出与原激发波长相同或不同的辐射,称为原子荧光。原子荧光分为共振荧光、直跃荧光、阶跃荧光等。
2.仪器结构
原子荧光光谱仪主要由激发光源、原子化器、光学系统、检测器组成。
(1)激发光源:
可用连续光源或锐线光源。常用连续光源是氙弧灯,常用锐线光源是高强度空心阴极灯、无极放电灯、激光等。连续光源稳定,操作简便,寿命长,能用于多元素同时分析,但检出限较差。锐线光源辐射强度高,稳定,可得到更好的检出限。
(2)原子化器:
原子荧光分析仪对原子化器的要求与原子吸收光谱仪基本相同。
(3)光学系统:
光学系统的作用是充分利用激发光源能量和接收有用荧光信号,减少和除去杂散光。色散系统对分辨能力要求不高,但要求有较大的集光本领,常用色散元件是光栅。非色散型仪器的滤光器用来分离分析线和邻近谱线,降低背景。非色散型仪器具有照明立体角大、光谱通带宽、集光本领大、荧光信号强度大、仪器结构简单、操作方便等优点,但散射光的影响大。
(4)检测器:
常用的是光电倍增管,在多元素原子荧光分析仪中,也用光导摄像管、析像管做检测器。检测器与激发光束成直角配置,以避免激发光源对检测原子荧光信号的影响。
3.原子荧光光谱法特点
(1)有较低检出限,灵敏度高。现已有20多种元素低于原子吸收光谱法检出限。由于原子荧光辐射强度与激发光源成比例,采用新的高强度光源可进一步降低其检出限。
(2)干扰少,谱线单纯,仪器结构简单,价格便宜。
(3)分析校准曲线线性范围宽,可达3～5个数量级。
(4)由于原子荧光是向空间各个方向发射,比较容易制作多道仪器,因而能实现多元素同时测定。
(5)适用元素有限,目前多用于As、Sb、Bi、Hg、Ge、Pb、Sn、Se、Te、Cd、Zn等元素测定。
(四)电感耦合等离子体质谱法
20世纪80年代发展起来的电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass Spectrometry,ICP-MS),将ICP的高温(8000K)电离特性与四极杆质谱仪的灵敏快速扫描相结合而形成一种新型超强有力的元素分析、放射性核素分析和形态分析技术,可分析几乎地球上所有元素(Li～U)。该技术具有极低检出限、极宽动态线性范围、谱线简单、干扰少、分析精密度高、分析速度快以及可提供放射性核素信息等分析特性。自1984年第一台商品仪器问世以来,这项技术已从最初在地质科学研究的应用迅速发展到广泛应用于环境保护、半导体、生物、医学、冶金、石油、核材料分析等领域。
1.原理
样品溶液经过雾化由载气送入ICP炬焰中,经过蒸发、解离、原子化、离子化、电离等过程,转化为带正电荷的正离子,经离子采集系统进入质谱仪,质谱仪根据质荷比进行分离。对于一定质荷比,质谱积分面积与进入质谱仪的离子数成正比,即样品浓度与质谱积分面积成正比,通过质谱积分面积来测定样品中元素浓度。
2.仪器结构
ICP-MS主要由离子源、真空系统、接口、离子透镜、质量分析器、检测器等部分组成。
(1)离子源:
产生等离子体并使样品离子化的部分,主要包括射频(RF)工作线圈、等离子体、进样系统和气路控制四个组成部分。样品通过进样系统导入,溶液样品通过雾化器等设备进入等离子体,气体样品直接导入等离子体,RF工作线圈为等离子体提供所需能量,气路控制不断产生新的等离子体,达到平衡状态,不断电离新的离子。
(2)真空系统:
仪器为达到从常压向真空系统过渡,提供三级真空系统,逐步达到超高真空度,由机械泵和分子涡轮泵完成。
(3)接口:
是常压、高温ICP离子源与真空、室温、洁净环境质谱部分的结合部件。接口部分由两个锥体组成,前面是采样锥(sample cone),后面是截取锥(skimmer cone),用于从常压向真空系统过渡。
(4)离子透镜:
主要目的是去除电子和中性微粒的影响,并对正电子实现聚焦,满足质量分析器的工作要求。
(5)质量分析器:
通常为四极杆分析器,利用四极杆对不同质荷比的元素离子的筛选作用,达到顺序分析离子质量的目的。四极杆有两个工作模式,即顺序扫描方式和跳峰方式。当四极杆工作处于扫描方式,直流电压和射频电压幅度成比例连续变化,每个时刻都选择对应的连续变化的质荷比的离子通过。当工作处于跳峰模式,两个电压也不连续的跳变,每个时刻都选择感兴趣的某个质荷比的离子通过。
(6)检测器:
通常使用的检测器是一种电子倍增器,检测器通过对一定时间内脉冲信号的计数可以得到离子强度相对值。
3.ICP-MS特点
(1)检测模式多样,有定性、半定量、定量、放射性核素分析等,与色谱联用还可以进行元素形态分析,应用范围广。
(2)几乎可以检测所有金属元素和一些非金属元素,并可多元素同时分析,分析速度快。
(3)灵敏度高,检出限可达10 -15级。
(4)动态范围宽,可达9个数量级,从10 -15到10 -6级。
(五)气相色谱法
气相色谱(gas chromatography,GC)是20世纪50年代的一项重大科学技术成就,现已成为实验室挥发、半挥发性有机物检测常规技术,在食品安全、环境监测、疾病诊疗等方面广泛应用。
1.原理
样品在气化室气化后被载气带入气相色谱柱,色谱柱内含有液体或固体固定相,根据样品中各组分沸点、极性或吸附性能不同进行分离,通过检测器进行检测。
2.气相色谱仪基本结构
气相色谱仪由气路系统、进样系统、色谱柱、控温系统、检测器等组成。
(1)气路系统:
包括载气和燃烧气。载气常用惰性气体如氮气、氦气等,要求气体纯度99.99%以上;燃烧气用于检测器,以空气和氢气以一定比例混合,常用电子压力控制系统保持气体流速或压力恒定。
(2)进样系统:
包括进样器和气化室,进样器将样品从进样口注入气化室,常用微量注射器进液体样品,六通阀进样器进气体样品。气化室通过高温将样品瞬间气化,快速定量地转入色谱柱中。
(3)色谱柱:
分填充柱和毛细管柱两类。填充柱由玻璃或不锈钢制成,内装固定相,柱容量高,柱效低,分离效率不高,现在少用。毛细管柱是由石英或玻璃制成的空心柱,内径一般为0.25～0.53mm,长度为15～100m,内壁涂布0.2～3.0μm厚的不同极性固定液,柱效高,分离能力强,分析速度快,通用性强。
(4)控温系统:
主要对气化室、柱温箱、检测器温度进行精密控制,温度直接影响色谱分离、检测灵敏度和重复性。其中柱温箱控制方式为恒温和程序升温两种。对于复杂混合物常用色谱柱程序升温来缩短分析时间,提高分离效率。
(5)检测器:
气相色谱检测器很多,常用以下几种。
1)氢火焰离子化检测器(FID):
质量型检测器,以空气和氢气作为燃烧气,利用有机物在氢火焰的作用下化学电离而形成离子流,通过测定离子流强度进行检测。该检测器灵敏度高、线性范围宽、操作条件不苛刻、噪声小、死体积小,是有机化合物检测常用检测器。但是检测时样品被破坏,一般只能检测在氢火焰中燃烧产生大量碳正离子的有机化合物。
2)电子捕获检测器(ECD):
浓度型检测器,利用电负性物质捕获电子的能力,通过测定电子流检测被检物含量。ECD具有灵敏度高、选择性好的特点。它是一种选择性检测器,是目前分析痕量电负性有机化合物最有效的检测器。元素的电负性越强,检测器灵敏度越高,对含卤素、硫、氧、羰基、氨基等化合物有很高的响应。电子捕获检测器已广泛应用于有机氯和有机磷农药残留量、金属配合物、金属有机多卤或多硫化合物等分析测定。
3)火焰光度检测器(FPD):
质量型检测器,又叫硫磷检测器,对含硫和含磷化合物有比较高的灵敏度和选择性。其检测原理是,当含磷和含硫物质在富氢火焰中燃烧时,分别发射特征光谱,透过干涉滤光片,用光电倍增管测量特征光谱强度。
3.毛细管柱气相色谱法操作条件选择
气相色谱法操作条件选择以快速高效为原则,毛细管柱气相色谱法是当前应用最广泛的气相色谱分析方法,现将毛细管柱气相色谱法操作条件选择介绍如下。
(1)毛细管柱选择:
色谱柱选择是气相色谱分析的关键,分析者需要根据待测物性质选择不同极性、长度、内径、膜厚的毛细管柱,以达到最佳分离效果。通常依据待测物性质,按“相似”原则选择柱子极性。色谱柱长度越长,柱效越高,对分离较多组分和难分离组分有利,但分析时间加长,常规色谱柱为30m。色谱柱内径大,柱容量大,柱效高,有利于分离,分析时间长,常规内径为0.25mm,还有0.32mm、0.53mm大口径柱。液膜厚度受样品挥发性及固定液温度范围的影响,对挥发性低、高沸点物质可选用内径0.25μm薄液膜柱;对挥发性强、高沸点物质可选用1.0μm以上厚液膜柱。
(2)柱温选择:
柱温是气相色谱法重要操作参数,直接影响色谱分离度和分析速度。提高柱温有利于提高柱效,缩短分析时间,但也会使分离度、选择性下降,相反降低柱温可改善选择性和分离度,但会增加分析时间。实际工作中应综合考虑,在难分离组分得到有效分离前提下,尽量缩短分析时间。毛细管柱色谱常用程序升温提高改善分离,缩短分析时间。
(3)载气流速:
毛细管柱为空心柱,增加流速对柱效影响小,在满足组分分离前提下,可增加载气流速,缩短分析时间。
(4)进样方式:
分为分流进样和不分流进样。在满足方法灵敏度要求前提下,最好采用分流进样,以有效减少溶剂效应。不分流进样常用于痕量组分分析,如农药残留、兽药残留等,对检测灵敏度要求高。一般进样量为1μl,高压或脉冲进样不超过4μl。
4.气相色谱法特点
(1)分离效能高:毛细管色谱柱柱效高,一次进样可完成多种组分分离和检测。
(2)灵敏度高:最低检出浓度FID可达10 -9 g/L,FPD、ECD可达10 -12 g/L。
(3)操作简单,分析速度快。
(4)不足之处:定性需要标准物质的保留时间,不能直接从分离峰给出定性结果,不适用于沸点高的难挥发物质和热不稳定物质分析。
(六)高效液相色谱法
高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)是20世纪60年代后期,在经典液相色谱法基础上,引入气相色谱理论而迅速发展起来的以高压输出液体为流动相的色谱技术。HPLC法比气相色谱应用范围更加广泛,约80%有机物都可以采用HPLC法进行分离检测,在医药卫生、生命科学、药物分析及环境保护等领域应用广泛。
1.原理
高压泵将贮液器中经过过滤和脱气的流动相经由进样器送入色谱柱,然后从检测器流出;样品从进样阀进入,被流经进样器的流动相带入色谱柱进行分离;分离后各组分依次进入检测器,检测器将各组分浓度的变化转变为相应的电信号,经色谱工作站处理得到色谱图。
2.仪器结构
HPLC系统一般由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成,其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等,现代HPLC仪还有微机控制系统进行自动化仪器控制和数据处理。
(1)高压输液泵:
驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统,是高效液相色谱仪的关键部件之一。对高压输液泵的要求:耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定,且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类,常使用恒流泵,因其压力随系统阻力改变而流量不变。
(2)进样器:
多使用六通阀进样器或自动进样器。对进样器要求密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力、流量影响小。
六通阀进样器进样,进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置(LOAD),此时进样口只与定量环接通,处于常压状态,用微量注射器(体积应大于定量环体积)注入样品溶液,样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置(INJECT),使定量环接入输液管路,样品由高压流动相带入色谱柱中。采用自动进样器,有利于重复操作,实现自动化。
(3)色谱柱:
承担分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是:柱效高、选择性好,分析速度快。色谱柱由柱管和填充剂组成,柱管多用不锈钢制成,柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。化学键合固定相可分为十八烷基硅烷键合硅胶(又称ODS柱或C18柱)、辛烷基硅烷键合硅胶(C8柱)、氨基或氰基键合硅胶等。常规分析柱规格为内径2～5mm(常用4.6mm),柱长10～30cm,填料粒度5～10μm。
(4)检测器:
将被分析组分在柱流出液中浓度变化转化为光学或电学信号。HPLC检测器要求灵敏度高、噪声低(即对温度、流量等外界变化不敏感)、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
检测器类型包括紫外检测器、示差折光化学检测器、荧光检测器、电化学检测器等。目前主要使用紫外检测器,可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型,以可变波长紫外检测器应用最广泛。
检测器由光源、流通池和记录器组成,其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收,其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。
(5)数据处理和计算机控制系统:
其功能包括:①采集、处理和分析数据;②控制仪器;③色谱系统优化和专家系统。
3.特点
(1)高压:
流动相为液体,流经色谱柱时,所受阻力较大,为能迅速通过色谱柱,必须对载液加高压。
(2)高效:
分离效能高。可选择固定相和流动相达到最佳分离效果,比工业精馏塔和气相色谱分离效能高。
(3)高灵敏度:
紫外检测器检测可达0.01ng,进样量达μl量级。
(4)应用范围广:
80%以上的有机化合物可用高效液相色谱分析,特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物分离分析,更显优势。
(5)分析速度快、载液流速快:
较经典液体色谱法速度快,通常分析一个样品小于1小时,多数15～30分钟,有些样品甚至在5分钟内即可完成。
(七)气相色谱-质谱联用法
气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)是最早实现商品化的色谱联用仪器。目前,小型台式GC-MS已成为很多实验室常规配置。气相色谱(GC)具有极强分离能力,但它对未知化合物定性能力较差;质谱(MS)对未知化合物具有独特鉴定能力,且灵敏度极高,但它要求被检测组分一般是纯化合物。将GC与MS联用,彼此扬长避短,既弥补了GC只凭保留时间难以对复杂化合物中未知组分做出可靠定性鉴定的缺点,又利用了鉴别能力很强且灵敏度极高的MS作为检测器,达到高分辨能力、高灵敏度和分析过程简便快速的特点,使GC-MS在环保、医药、农药和兴奋剂等领域起着越来越重要的作用,是分离和检测复杂化合物的最有力工具之一。
1.原理
质谱法基本原理是将样品分子置于高真空(<10 -3 Pa)离子源中,使其受到高速电子流或强电场等作用,失去外层电子而生成分子离子,或使其化学键断裂生成各种碎片离子,经加速电场的作用形成离子束,进入质量分析器,再利用电场和磁场使其发生色散、聚焦,获得质谱图。根据质谱图提供的信息可进行有机物、无机物定性、定量分析,复杂化合物结构分析,放射性核素测定及固体表面的结构和组成等分析。
2.仪器结构
GC-MS联用仪由图2-1-1所示各部分组成,气相色谱仪分离样品中各组分,起着样品制备的作用;接口把气相色谱流出的各组分送入质谱仪进行检测,起着气相色谱和质谱之间适配器的作用;质谱仪对接口依次引入的各组分进行分析,是气相色谱仪的检测器;计算机系统交互式地控制气相色谱、接口和质谱仪,进行数据采集和处理,是GC-MS中央控制单元。
图2-1-1 GC-MS联用仪的组成示意图
质谱系统一般由真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、检测器和计算机控制与数据处理系统(工作站)等组成。
(1)真空系统:
质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作,以减少本底干扰,避免发生不必要的分子-离子反应。质谱仪的高真空系统一般由机械泵和扩散泵或涡轮分子泵串联组成。机械泵作为前级泵使真空度达到10 -1～10 -2 Pa,然后由扩散泵或涡轮分子泵将真空度继续降至质谱仪的工作要求(10 -4～10 -5 Pa)。虽然涡轮分子泵可在十几分钟内将真空度降至工作范围,但一般仍然需要继续平衡2小时左右,充分排除真空体系内存在的诸如水分、空气等杂质以保证仪器工作正常。
(2)进样系统:
气相色谱-质谱联用仪进样系统由接口和气相色谱组成。接口的作用是使经气相色谱分离出的各组分依次进入质谱仪离子源。接口一般应满足如下要求:①不破坏离子源高真空,也不影响色谱分离的柱效;②使色谱分离后的组分尽可能多的进入离子源,流动相尽可能少进入离子源;③不改变色谱分离后各组分的组成和结构。
(3)离子源:
将被分析样品分子电离成带电离子,并使这些离子在离子光学系统的作用下,汇聚成有一定几何形状和一定能量的离子束,然后进入质量分析器被分离。离子源性能直接影响质谱仪灵敏度和分辨率。离子源的选择主要依据被分析物热稳定性和电离难易程度,以期得到分子离子峰。电子轰击源(EI)是气相色谱-质谱联用仪中最常用的离子源,它要求被分析物能气化且气化时不分解。
(4)质量分析器:
质量分析器是质谱仪的核心,它将离子源产生的离子按质荷比( m/ z)不同,在空间位置、时间先后或轨道稳定与否进行分离,以得到按质荷比大小顺序排列的质谱图。以四极质量分析器(四极杆滤质器)为质量分析器的质谱仪称为四极杆质谱。它具有重量轻、体积小、造价低的特点,是目前台式GC-MS最常用的质量分析器。质量分析器还有磁分析器、飞行时间分析器和离子阱等。
(5)检测器:
将来自质量分析器的离子束进行放大并进行检测,电子倍增检测器是GCMS最常用的检测器。
(6)计算机控制与数据处理系统(工作站):
其功能是:①快速准确地采集和处理数据;②监控质谱及色谱各单元的工作状态;③对化合物进行自动的定性定量分析;④按用户要求自动生成分析报告。
(7)标准质谱库:
标准质谱图是在标准电离条件——70e V电子束轰击已知纯有机化合物得到的质谱图。GC-MS常用定性方法是标准谱库检索,即利用计算机将待分析组分(纯化合物)质谱图与计算机内保存的已知化合物标准质谱图按一定程序进行比较,将匹配度(相似度)最高的若干个化合物的名称、分子量、分子式、识别代号及匹配率等数据列出供用户参考。值得注意的是,匹配率最高的并不一定是最终确定的分析结果。
目前比较常用的通用质谱谱库包括美国国家科学技术研究所的NIST库、NIST/EPA(美国环保局)/NIH(美国卫生研究院)库和Wiley库,这些谱库收录的标准质谱图均在10万张以上。
3.GC-MS联用仪分类
(1)按仪器机械尺寸,可以粗略地分为大型、中型和小型气质联用仪;
(2)按仪器性能,可以粗略地分为高档、中档和低档三类,或研究级和常规检测级两类气质联用仪;
(3)按色谱技术,可分为气相色谱-四极杆质谱、气相色谱-离子阱质谱、气相色谱-飞行时间质谱等;
(4)按质谱仪分辨率,可分为高分辨率(分辨率高于5000)、中分辨率(分辨率在1000～5000之间)、低分辨率(分辨率低于1000)气质联用仪。小型台式四极杆质谱检测器(MSD)的质量范围一般低于1000。四极杆质谱由于其本身固有限制,一般GC-MS分辨率在2000以下。和气相色谱联用的飞行时间质谱(TOF-MS),其分辨率可达5000左右。
4.GC-MS法和GC法比较
(1)GC-MS定性参数增加,定性可靠。GC-MS法不仅与GC法一样能提供保留时间,而且还能提供质谱图、分子离子峰的准确质量、碎片离子峰强比、放射性核素离子峰、选择离子的子离子质谱图等信息,使GC-MS法定性远比GC法可靠。
(2)GC-MS是一种通用的色谱检测方法,但灵敏度却远高于GC法任何一种通用检测器。GC法中FID和TCD是通用检测器,其余都是选择性检测器,与检测样品中的元素或官能团有关。
(3)GC法虽然用选择性检测器,能对一些特殊化合物进行检测,不受复杂基质干扰,但难以用同一检测器同时检测多类不同的化合物,而不受基质干扰。而采用GC-MS提取离子色谱、选择离子检测等技术可降低化学噪声的影响,分离出总离子流图上尚未分离的色谱峰。GC-MS中,高分辨质谱联用仪检测准确质量数、串联质谱(时间串联或空间串联)选择反应检测或选择离子子离子检测等均能在一定程度上降低化学噪音,提高信噪比。
(4)GC-MS采用放射性核素稀释和内标技术,以及不断改进的质谱技术,GC-MS定量分析精度得到极大改善。在一些低浓度定量分析中,接近多数GC检测器检测下限时,GCMS定量精度优于GC。
(5)GC法大多数样品处理方法、分离条件、仪器维护等都可移植为GC-MS的方法。在GC-MS中选择衍生化试剂时,要求衍生化物在一般的离子化条件下能产生稳定的、合适的质量碎片。
(八)液相色谱-质谱联用法
液相色谱-质谱联用法(LC-MS)是以质谱仪为检测手段,集HPLC高分离能力与MS高灵敏度和高选择性于一体的强有力分离分析方法。LC-MS体现了色谱和质谱优势互补,将色谱对复杂样品的高分离能力,与MS高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来,特别是近年来,随着电喷雾、大气压化学电离等软电离技术的成熟,使其定性定量分析结果更加可靠。同时,由于LC-MS对高沸点、难挥发和热不稳定化合物的分离和鉴定具有独特优势,因此,它已成为中药制剂分析、药代动力学、食品安全检测和临床医药学研究不可缺少的手段。
1.原理
LC-MS以液相色谱作为分离系统,质谱为检测系统,样品在质谱部分与流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图。
2.仪器结构
LC-MS仪主要由高效液相色谱、接口装置(也是离子源)、质谱仪和数据处理系统构成。高效液相色谱仪和一般的液相色谱仪基本相同,其作用是将混合物试样分离后进入质谱仪。该仪器关键部分是LC和MS之间的接口装置,其主要作用是出溶剂并使试样离子化。由于接口装置同时就是离子源,因此质谱仪部分只包括质量分析器,对进入的离子进行质量分离,分离后的离子按质量大小先后由收集器收集,并记录质谱图。
3.关键技术
如何将液相色谱过程使用的流动相与样品分开,如何使极性大、难挥发、相对分子质量大的样品完全离子化并引入质谱分析器,这是LC-MS的关键技术,由接口装置完成。
接口技术:LC-MS最重要的位置是接口装置。样品经液相色谱分离,进入质谱,要除去溶剂并使其电离,同时要求液相色谱的高流速与质谱的气相和高真空度条件相匹配。接口的作用就是将被分析样品分子电离成带电离子,并使这些离子在离子光学系统的作用下汇聚成一定几何形状和一定能量的离子束,然后进入质量分析器被分离。
最常用的电离源有大气压电喷雾电离源(ESI)和大气压化学电离源(APCI),两者同属于大气压电离(API)技术,其离子化过程发生在大气压下。
ESI原理:样品溶液在电场及辅助气流的作用下喷成雾状带电液滴,挥发性溶液在高温下逐渐蒸发,液滴表面的电荷体密度随半径减小而增加,当达到雷利极限时,液滴发生库伦爆破现象,产生更小的带电微滴。上述过程不断反复,最终实现样品离子化。由于这一过程没有直接的外界能量作用于分子,因此对分子结构破坏较少,是一种典型的“软电离”方式。ESI过程中大致可以分为液滴形成、去溶剂化、气相离子形成3个阶段。
ESI为电喷雾,即样品先带电再喷雾,带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子,从而被检测,对于极性大的样品效果好一些;APCI为大气压力化学电离源,样品先形成雾,然后电晕放电针对其放电,在高压电弧中,样品被电离,然后去溶剂化形成离子,最后检测,对极性小的样品效果较好。
ESI软电离程度较APCI小,但其应用范围较APCI大,只有少部分ESI检测不出,可以用APCI辅助解决。但是APCI还是不能解决所有ESI解决不了的问题,一般用ESI和APPI搭配使用比ESI和APCI的应用范围更广。
电喷雾电离源是一种软电离方式,即便是分子量大,稳定性差的化合物,也不会在电离过程中发生分解,它适合于分析极性强的大分子有机化合物,如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样,一个分子量为10 000Da的分子若带有10个电荷,则其质荷比只有1000Da,进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点,目前采用电喷雾电离,可以测量分子量在300 000Da以上的蛋白质。
大气压化学电离源主要用来分析中等极性化合物。有些分析物由于结构和极性方面的原因,用ESI不能产生足够强的离子,可以采用APCI方式增加离子产率,可以认为APCI是ESI的补充。APCI主要产生单电荷离子,所以分析的化合物分子量一般小于1000Da。用这种电离源得到的质谱很少有碎片离子,主要是准分子离子。
APCI与ESI都能分析许多样品,而且灵敏度相似,很难说出哪一种更合适。同时至今没有一个确切的准则判断何时使用某一种电离方式更好。但是通常认为电喷雾有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物,而APCI更适合于分析极性较小的化合物。
APCI不能生成一系列多电荷离子,所以不适合分析生物大分子。而ESI由于它能产生一系列多电荷离子,特别适合于蛋白质,多肽类生物分子。
由于LC-MS联用技术具有诸多优点,它愈来愈多地受到人们重视,但其本身所存在缺陷也不容忽视。首先,LC-MS技术虽有较高的检测灵敏度,但对痕量物质的归属和精确定量,仍存在不少困难;其次,LC-MS技术对现有化学计量学方法的处理结果存在明显“假阳性”现象,仅能很好地反映含量较高物质的浓度变化,对低含量代谢物分析的准确性和可靠性,却显著下降;第三,应用LC-MS技术确证化合物结构时,不及NMR技术直接有效;此外,目前LC-MS技术可供搜索用于确定化合物结构的数据库尚有限,不能满足复杂多样代谢物研究的需要。总之,LC-MS技术有待完善,还有很大的发展空间。
(刘奋)
参考文献
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