第三节　干细胞与再生医学研究现状

再生医学已引起全世界范围内的高度重视，国际上与再生医学和组织修复有关的重要学术团体和机构就有包括国际再生医学基金会等在内的几十家，相关的实验室和技术公司更是数不胜数。韩国用于干细胞研究和开发的费用已逐步增至每年1亿美元。

一、干细胞研究现状

近几年人们在干细胞发育的基础理论方面进行了深入研究，尤其是决定干细胞命运的分化机制以及细胞在保持和获得干性分子机制方面取得了突破性进展。在对干细胞干性和可塑性研究中发现干细胞之所以具有干性决定于其基因的表达程序，不但植入去核卵细胞的体细胞核能通过改变基因表达程序而变成全能干细胞，而且导入干细胞的标志性转录因子基因到分化的体细胞也能使后者获得干性，即诱导多能干细胞。这一研究成果被Time（《时代周刊》）评为2007年度十大科学发现之一，也是同年Science杂志评选的十大科技成果之首。周琪与曾凡一首次利用iPSC，通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，论文已在Nature发表，在世界上首次证明了iPSC的全能性。而近年来兴起的表观遗传学研究为阐明细胞分化命运的决定因素开辟了新的途径。新近的研究结果表明，基因表达的调节主要在基因转录和翻译两个环节，转录水平的调节受控于基因所在部位的染色质结构，而在翻译水平的调节中近年发现的一些小RNA，特别是微小RNA（micro RNA，miRNA）可能起到了重要作用。

我国在干细胞研究领域也取得了重要的科研成果。在对传统的胚胎干细胞和成体干细胞研究的基础上，有学者提出了亚全能干细胞的概念，认为这种细胞刚脱离了胚胎干细胞的特征，但又不是成体干细胞。通过实验证明，在特定的体内外微环境中，人体亚全能干细胞能够诱导分化为各种组织细胞，通过移植给受者参与组织的再生和修复，并因显著降低移植排斥反应，为恶性血液病、心血管疾病、糖尿病、肝功能衰竭等多种严重疾病拓展了治疗途径。目前，我国已有超过10个实验室宣布获得了具有自主知识产权的人胚胎干细胞系；在国际上率先获得了人孤雌胚胎干细胞系；建立了成熟的恒河猴与人核移植技术体系和iPS体系。

二、再生医学研究现状

尽管组织修复与再生理论和技术的应用在中国涉及的疾病和损伤范围比较广，但总体而言在干细胞生物学、器官构建和复制、组织工程基础研究和产品制造以及创伤治疗本身等方面获得了迅速发展和广泛关注。

在干细胞领域，中国学者在一些基础研究方面取得了重要突破：利用具有发育成各种组织和器官能力的多能细胞和诱导性多能干细胞（iPS）技术复制出全能个体小鼠；通过异种细胞嵌合或转分化技术获得功能器官；iPS大动物模型制备；建立诱导分化体系将体细胞诱导分化为多种组织细胞等。与此同时，在中、重度烧伤、创伤后的皮肤汗腺再生以及由糖尿病与下肢血管疾病导致的下肢血管性疾病等方面，通过诱导分化技术将成体干细胞应用于血管再生治疗已经观察到明显效果，部分病例在3年以上的随访中疗效确切。

作为组织再生的重要手段之一，中国在组织工程等方面的进展也有目共睹。除了在组织工程的三大要素如种子细胞、支架材料和调节因子等方面的进展外，通过创新技术构建的组织工程皮肤、骨、软骨、神经、血管、肌腱等已部分应用于临床试验并获得了显著的修复与再生效果。例如：组织工程脱细胞神经用于修复长8cm、直径5mm的粗大神经效果明显；注射用软骨细胞修复负重区软骨缺损应用300余例患者取得明显疗效。

在组织创伤修复与再生等领域，如何实现在损伤部位多种组织的同步再生是一个重要的研究课题。为此，有学者试图建立一些方法，一方面阻止损伤部位瘢痕的过度形成，另一方面通过诱导技术实现皮肤干细胞跳过iPS阶段直接分化为神经细胞、骨细胞、脂肪细胞等。目前该领域已有初步进展，比如提出真皮模板学说以减少瘢痕形成以及建立训化诱导方法在损伤部位诱导多种组织同步再生等。

总的来讲，中国的组织修复与再生不仅积极与国际主流方向接轨，同时也突出了自己的创新特点和独特的研究思路，这就是将基础研究的成果通过转化医学的理念，在某些关键领域实现理论与技术突破，尽快将相关成果应用到组织修复与再生的各个领域，并希望能够尽快造福于损伤患者。当然，存在的问题也是比较突出的，一方面原创性的东西还不多，特别是一些创新的理念和能够引领潮流的研究方向还不多，另一方面转化的效率还比较低，整体研究的优势还不是很突出，需要进一步关注和加强。

2012年，Science出版了《中国再生医学专刊》（Regenerative Medicine in China），封面上印有中文“再生”二字（图1-2），这是Science首次以专刊形式介绍中国再生医学研究的成就，是对我国再生医学研究成果的高度肯定。专刊共发表论文35篇，分为：①干细胞和再生（8篇）；②组织工程和再生（13篇）；③创伤和再生（10篇）；④组织修复和再生医学基础（4篇）。内容涉及临床内科、外科、口腔科、眼科等学科，它大体上代表了我国再生医学的最高水平。现就其部分内容作一介绍。

1.功能性汗腺再生

付小兵等在功能性汗腺再生方面初步获得成功，但还有很多问题待解决，采用人骨髓间充质干细胞（human bone mesenchymal stem cells，HBMSC）与人汗腺细胞共培养，使BMSC具有汗腺样细胞表型及生理特征，在裸鼠身上验证，已获得初步成效。临床30例小面积创伤试用，显示移植物具有汗腺功能，被国际上认为是“里程碑”（landmark）性研究成果。

2.组织工程

中国再生医学的重要组成部分，由于政府支持，我国组织工程发展很快，其发展经历3个阶段：①可行性研究；②裸鼠构建组织工程器官和组织；③正常免疫动物构成组织工程器官和组织。经中国食品药品监督管理局（SFDA）批准的组织工程皮肤、角膜与周围神经正在临床试用中，其他如软骨、骨、肌腱正在生产或在产品注册过程中。此外，许多组织工程产品标准已经或即将公布。但全国尚缺乏统一的干细胞操作规范，基础到临床转化不够，缺乏可靠的临床安全评价体系，相应的规范和法律制约手段尚在探讨中。

3.多能干细胞的产生与评估

同种或异种干细胞治疗中免疫排斥至今仍未能得到很好解决，应用体细胞核转移技术（somatic cell nuclear transfer，SCNT）将来源于患者自体的细胞制成同种胚胎干细胞系是一项可行的解决办法。将核转移胚胎干细胞（nuclear transfer embryonic stem cell，NT-ESC）产生及分化的细胞用于疾病的治疗称为“治疗性克隆”（therapeutic cloning）。研究人员已经成功地培育出小鼠NT-ESC，未发现与受孕的胚胎有任何显著差异。

4.不同种属动物嵌合子在再生医学中的应用

由于伦理及实际操作的限制，人类ES/iPS（induced pluripotent stem cells）细胞不能常规放在人的胚泡（blastocyst）中。为此，论文作者建立了一种新的方法，把一个种属的胚泡内正常分化的ESC融入另一种属动物的胚泡内，结果显示：①尽管两个动物种系差异很大，姫鼠（apodemus）ES却能成功地融入小鼠胚泡细胞内，产生存活的嵌合子（chimera）；②在被检的小鼠器官内含有嵌合子的细胞从百分之几到30%-40%，精子内有5%，表明已介入到生殖系统内；③正常分化成各种细胞类型的姫鼠干细胞可紧密结合到小鼠的组织中。据此，作者认为不同种属的细胞嵌合后，其多功能干细胞可分化成不同的细胞类型，甚至复杂的组织。

5.真皮多能干细胞在创面修复中的治疗作用

2001年论文作者与其他学者分别发现成年哺乳动物（小鼠、大鼠、人）真皮中存在类似骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的多能干细胞。将标记的真皮多能干细胞静脉注射至受致死性γ射线照射的小鼠体内，发现其存活率提高26%（小鼠模型5Gy γ射线全身照射+2.5%全身皮肤创伤）。此外，还可促进创面愈合，增强骨髓造血能力。

6.通过体外分化和去分化重编程间充质干细胞以提高体内疗效

体外培养成年大鼠BMSC时，观察到去分化间充质干细胞（dedifferentiate mesenchymal stem cell，DeMSC）可进一步扩增，并能再次被诱导分化获得重编程细胞，与未分化的MSC比较，DeMSC有更高的神经元分化率，且保留免疫表型和间充质潜能。

7.表皮基底层细胞：不仅支撑表皮再生

人体皮肤有几种不同类型的干细胞，分别存在于毛囊膨大部（bulge）、皮脂腺（sebaceous gland）和表皮基底层（the basal layer of epidermis），后者参加损伤皮肤的再生。在皮肤有慢性创面的条件下，已分化的表皮基底层细胞可逆转为表型和功能与表皮干细胞相似的细胞，与皮肤中其他类型干细胞相比，来源于表皮基底层的角化细胞（keratinocyte）易于获得，可在体外扩增，因其有可塑性（即多分化潜能），可作为不同组织再生的潜在性细胞来源。

8.组织工程：肌腱再生的希望

作者采用种子细胞和支架材料在体外共培养组织工程肌腱（tissue engineered tendons，TET）用以作为肌腱代替物，为此在裸鼠、大鼠、兔、猕猴（rhesus monkey）试验了此种TET的生物相容性、愈合过程、生物力学强度、排斥反应及TET的整体效果。植入（implantation）实验证实，TET可有效地修复缺损的肌腱，并促进愈合。在18例临床应用中，应用GMP（Goods Manufacture Practice）认定生产的TET无副反应。尽管TET的安全性和有效性尚须进一步确认，但可预期，组织工程肌腱有望代替毁损的肌腱。

9.人类围生期干细胞库

再生医学应用中的经验和前景。间充质干细胞是存在于各种组织中的多能干细胞，但在围生期（perinatal period，开始于妊娠28周，终止于产后1～4周不等）特别多。韩忠朝等人于2006年建立了质量可控的围生期MSC生物库（P-MSC已有10 000例标本），为临床前期和临床研究提供了丰富的来源。文章作者还建立了标准的细胞库方法，可检测细胞表型、纯度、生物性能、遗传稳定性、成瘤性（tumorigenicity）、微生物污染情况等。为测定分离出的MSC安全性，用小鼠和猴作多次实验，观察3个月无致瘤作用。用库存的围生期MSC治疗多发性硬化、2型糖尿病，显示同种围生期MSC安全有效。作者还治疗了1例小儿极重度再生障碍性贫血，应用脐带血造血干细胞（CB-HSC）和脐带间充质干细胞（UC-MSC）治疗后迅速好转。

10.神经再生的一种组织工程策略

神经损伤约占创伤患者3%，损伤导致患肢部分或全部功能丧失，甚至终身残疾。为此，作者采用组织工程方法治疗周围神经缺损，将一种自然的生物降解多糖体脱乙烯几丁质/聚乙醇酸（chitosan/PGA）材料连接到缺损30mm的人前臂正中神经，术后36个月，受伤手的功能恢复，可做各种细致的动作。36个月后的内收肌群肌电恢复正常。

11.自体干细胞治疗慢性下肢缺血

严重肢体缺血通过常规的分流术或血管内治疗，约2/3患者可再血管化，另1/3患者则没有机会治愈，导致截肢、潜在性疾病或致死。作者用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）将骨髓干细胞（含内皮祖细胞，endothelial progenitor cells）动员至周围血中，作者用此法分离出动员至周围血的中单核细胞（PB-MNC），用其治疗周围动脉疾病，效果甚好。但可能因血液黏性（viscosity）增加而对心脏有损害。改用骨髓单核细胞（BM-MNC）治疗后，减少了骨髓用量（由400～500ml减至200ml），获得10倍以上的单核细胞，缩短了动员时间，从而减少了心脏血管并发症，提高了安全度和疗效。

12.同种异体、基因修饰、脂肪源性干细胞和肝素壳聚糖脱细胞骨基质修复骨缺损

同种移植会引起免疫排斥反应，主要由重大组织相容性复合物-Ⅰ（MHC-Ⅰ）表面蛋白引起的（干细胞仅表达很少的MHC-Ⅱ）将人类MHC产物US2、US3转入到来源于脂肪的干细胞（ADSC）中，检测能否下调ADSC中MHC-Ⅰ的表达。结果显示：①US2/US3 ADSC的生物学特征与正常ADSC相似，但MHC-Ⅰ表达水平低很多。用此构建组织工程骨，并将其放至有骨缺损的组织中，显示同种US2/US3 ADSC与自体ADSC间无明显差异；②治疗大块骨缺损时，移植后可因血凝而妨碍血液灌注到移植物处，为抑制凝血机制活化制成无细胞骨基质（ACBM）+肝素/脱乙酰几丁质（Chitosan）可构建组织工程骨，明显提高移植效果。如外加真空封闭引流（VSD）则效果更佳。

13.启动瘢痕形成：真皮“模板效应”学说

真皮缺损及其严重程度会促使增生性瘢痕的形成，组织内不同成分都会影响创面愈合，而这取决于真皮的结构成分。组织结构好似一个模板（template）指导细胞功能，而组织的完整性（integrity）和连续性是进行修复的前提，因创面而失去真皮的完整性和连续性就会出现模板缺乏效应，这正是阻止功能恢复、导致瘢痕形成的重要机制。

14.去分化：一种新的皮肤再生途经

去分化是一种重要的生物学现象，它出现在创面修复和再生阶段，同时决定或影响种系或器官的再生能力。研究显示，在Wnt β-catenin信号通路和ERK通路作用下，已分化或正在分化的表皮细胞对内外信号的反应产生了去分化，如制造一个创面或引入生长因子可使成熟的细胞再度回到细胞周期中增生和分化。当内源性干细胞丧失或耗竭时，去分化可能是组织再生中关键甚至是必需的一个阶段。

综上所述，我国再生医学研究已形成自己的特色和优势，如现已有较好的科学基础；临床转化初见成效；培养和引进了一批优秀的科技人才；建成了一些重要的研究平台和基地。但和先进国家比还有不少差距，如经费投入不足、创新成果和转化力度不够、一些科研生产应用的法规尚不完善等，这些都有待进一步解决。展望今后20～30年，我国再生医学研究和应用将会有较大的突破，整体上将处于国际先进或领先水平，更多的患者将会从中受益。