第一节　生化鉴定

一、分枝杆菌菌种（菌群）鉴定实验流程

1.经抗酸染色镜检确定是抗酸菌的培养阳性菌株，必须首先接种改良罗氏（L－J）培养基进行增菌传代。

2.进行分枝杆菌菌种鉴定，首先经对硝基苯甲酸（PNB）生长试验、28℃生长试验、耐热触酶试验、观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是非结核分枝杆菌（NTM）（图6－1）。

3.经菌群鉴定试验确定属于结核分枝杆菌复合群的菌株，需进行噻吩－2－羧酸肼（TCH）生长试验、硝酸还原试验和烟酸试验进行菌种鉴定（图6－1）。

4.属于NTM的菌株，首先根据生长速度的快慢确定属于快速生长还是缓慢生长的分枝杆菌。快速生长的分枝杆菌可通过生长特征和生化实验进行菌种鉴定；缓慢生长的分枝杆菌经色素产生试验确定菌株的产色特征后，再通过生长特征和生化试验确定菌株的种类（图6－1）。

5.由于临床分离的菌株生物特性不稳定，故对结核分枝杆菌菌群的分枝杆菌进行菌种鉴定时应至少同时使用以下三个鉴定实验中的两个，以便对结果进行综合判定。

二、分枝杆菌菌种（菌群）鉴定试验

主要用于区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群。

结核分枝杆菌复合群在含有对硝基苯甲酸（PNB）的培养基中生长受到抑制；大多数非结核分枝杆菌（NTM）菌种对一定浓度的PNB有耐受性，利用PNB培养基可以区分结核分枝杆菌复合群与其他非结核分枝杆菌。

非结核分枝杆菌（NTM）指除结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌外的所有分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

Ⅱ级生物安全柜、恒温培养箱、涡旋振荡器。

含PNB（500μg／ml）的改良罗氏培养基、中性改良罗氏培养基、生理盐水。

堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）ATCC　12478CMCC（B）95013、结核分枝杆菌H37Rv ATCC　27294CMCC（B）95053。

磨菌瓶（内含2mm无菌玻璃铺满一层瓶底，螺旋盖）、麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）、22SWG标准接种环、无菌吸管、无菌吸头、移液器、无菌试管。

临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长1～2周）无需传代即可做PNB试验，初生长4周后和贮存培养物须在中性改良罗氏培养基上传代，取2～3周的亚培养物进行试验。

1）在磨菌瓶上标记样本编号，使用无菌吸管吸取生理盐水加2～3滴到磨菌瓶中，用接种环刮取1～2周的新鲜菌落放入磨菌瓶中。旋紧磨菌瓶盖，在涡旋振荡器上震荡1～2分钟，静置15分钟。

2）向磨菌瓶中加入1～2ml生理盐水，轻轻混匀后静置15分钟，使菌液中的大块物质沉淀。

3）用无菌吸管轻轻吸取磨菌瓶中上部菌液加入到一个新的无菌试管中，并通过加生理盐水与麦氏1号标准浊度进行比较，调节浊度，直至与标准麦氏比浊管一致，即为1mg／ml的菌液。

取无菌试管，标记好样品编号、稀释浓度，使用移液器加入4.5ml无菌生理盐水，使用移液器取0.5ml的1mg／ml菌液加入含4.5ml无菌生理盐水的试管中，终浓度到10^－1　mg／ml。

取1管中性改良罗氏培养基和1管含PNB的改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期，用22SWG标准接种环分别沾取1环（即0.01ml）10^－1　mg／ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10^－3毫克／管。接种后的培养基置于培养架上，置于恒温培养箱37℃培养。

（1）刮取菌落时尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑选1～2个单独菌落进行试验。

（2）所有操作步骤严格在生物安全柜内进行。

（3）使用过的试管、磨菌管、吸头、吸管、消毒缸等废弃物品均要高压灭菌，确保无菌后再处理。

（4）生物安全柜台面要使用5%苯酚或75%乙醇进行消毒严格按照消毒，柜内紫外照射2小时，对分离培养实验室紫外照射2小时消毒。

（1）试验必须有阳性对照菌株堪萨斯结核分枝杆菌和阴性对照菌株结核分枝杆菌H₃₇RV。

（2）有进行菌种鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为1～2周且生长良好。

（3）有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限。

（4）有标明有对照的鉴别实验，在实验时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果。

（5）如阳性对照不生长或阴性对照生长，本次实验结果为无效。

主要用于区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群。

分枝杆菌的纯分离培养物。

Ⅱ级生物安全柜、恒温培养箱、涡旋振荡器。

中性改良罗氏培养基、生理盐水。

堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）ATCC　12478CMCC（B）95013、结核分枝杆菌H37Rv ATCC　27294CMCC（B）95053。

磨菌瓶（内含2mm无菌玻璃铺满一层瓶底，螺旋盖）、麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）、22SWG标准接种环、无菌吸管、无菌吸头、移液器、无菌试管。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

取2管中性改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期，用22 SWG标准接种环分别沾取1环（即0.01ml）10^－1　mg／ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10^－3　mg／管。接种后的培养基置于培养架上，一管置于恒温培养箱28℃培养，一管置于37℃培养。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

主要用于区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群。

分枝杆菌的纯分离培养物。

Ⅱ级生物安全柜、恒温水浴锅、涡旋振荡器。

生理盐水、磷酸盐缓冲液（pH＝7.0、0.067M）、15%H₂O₂（双氧水）。

堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）ATCC　12478CMCC（B）95013；结核分枝杆菌H₃₇Rv ATCC　27294CMCC（B）95053。

磨菌瓶（内含2mm无菌玻璃铺满一层瓶底，螺旋盖）、麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）、22SWG标准接种环、无菌吸管、无菌吸头、移液器、无菌试管。

临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长1～2周）无需传代即可做PNB试验，初生长4周后和贮存培养物须在中性改良罗氏培养基上传代，取2～3周的亚培养物进行试验。

1）在磨菌瓶上标记样本编号，使用无菌吸管吸取生理盐水加2～3滴到磨菌瓶中，用接种环刮取1～2周的新鲜菌落放入磨菌瓶中。旋紧磨菌瓶盖，在涡旋振荡器上震荡1～2分钟，静置15分钟。

2）向磨菌瓶中加入1～2ml生理盐水，轻轻混匀后静置15分钟，使菌液中的大块物质沉淀。

3）用无菌吸管轻轻吸取磨菌瓶中上部菌液加入到一个新的无菌试管中。

将装有菌悬液的试管放于68℃水浴20分钟，取出后立即冷却，缓缓加入0.5ml　15%的双氧水。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

三、结核分枝杆菌复合群菌种鉴定试验

主要用于区分牛核分枝杆菌和结核分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

Ⅱ级生物安全柜、恒温培养箱、涡旋振荡器。

含TCH（5μg／ml）的改良罗氏培养基、中性改良罗氏培养基、生理盐水。

牛分枝杆菌（M.boive）CMCC（B）93006；结核分枝杆菌H₃₇Rv ATCC　27294CMCC （B）95053。

磨菌瓶（内含2mm无菌玻璃铺满一层瓶底，螺旋盖）、麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）、22SWG标准接种环、无菌吸管、无菌吸头、移液器、无菌试管。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

取1管中性改良罗氏培养基和1管含TCH的改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期，用22SWG标准接种环分别沾取1环（即0.01ml）10^－1　mg／ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10^－3毫克／管。接种后的培养基置于培养架上，置于恒温培养箱37℃培养。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

主要用于区分牛核分枝杆菌和结核分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

Ⅱ级生物安全柜、恒温水浴锅、涡旋振荡器。

A试剂：硝酸盐溶液NaNO₃（0.085g）溶100ml PBS（pH7.0、0.067M）内，121℃灭菌20分钟，每管分装2ml。

B试剂：35%的浓盐酸等倍稀释。

C试剂：0.2%氨基苯磺胺水溶液（4℃保存，4周内使用）。

D试剂：0.1%N－甲萘基乙烯二胺盐酸盐水溶液（4℃可保存4周）；E试剂：锌粉：0.1g。

牛分枝杆菌（M.boive）CMCC（B）93006；结核分枝杆菌H₃₇Rv ATCC　27294CMCC （B）95053。

磨菌瓶（内含2mm无菌玻璃铺满一层瓶底，螺旋盖）、22SWG标准接种环、无菌吸管、无菌吸头、移液器、无菌试管。

同耐热触酶试验。

将装有菌悬液的试管和含2ml试剂A的空白对照试管放于37℃水浴2小时，试管取出后立即冷却；缓缓加入1滴试剂B和试剂C、D各2滴；混匀。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

主要用于鉴定结核分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

Ⅱ级生物安全柜、通风橱、恒温培养箱、涡旋振荡器。

A：3%联苯胺乙醇溶液。

B：10%溴化氰溶液（剧毒！在通风橱内配制）。

注：上述试剂必须存放于褐色试剂瓶中，瓶口密封，4℃可保存2周。溴化氰溶液如发生沉淀，应在室温下溶解后使用。

4%NaOH溶液。

牛分枝杆菌（M.boive）CMCC（B）93006；结核分枝杆菌H₃₇Rv ATCC　27294CMCC （B）95053。

无菌吸管；无菌试管

结果观察完毕后，加入4%NaOH溶液，加塞混匀后放置24小时后方可消除溴化氰的毒性。如阳性对照或阴性对照无结果，本次实验结果为无效。

烟酸试验结果阳性为结核分枝杆菌，结果阴性为其他分枝杆菌。

（1）由于烟酸含量在2g以上才出现阳性结果，故培养基上生长的菌落数一般必须在50个以上，否则可能出现假阴性结果。

（2）对INH高度耐药的结核分枝杆菌可能此实验为阴性，届时需结合硝酸还原实验结果判定。

（3）使用过的试管、磨菌管、吸管、消毒缸等废弃物品均要要高压灭菌，确保无菌后再处理。

（4）生物安全柜台面要使用5%苯酚或75%乙醇进行消毒严格按照消毒，柜内紫外照射2小时，对分离培养实验室紫外照射2小时消毒。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

同噻吩－2－羧酸肼（TCH）培养基生长试验。

四、非结核分枝杆菌菌群生长特征鉴定试验

主要用于区分快速和缓慢生长分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

Ⅱ级生物安全柜、恒温培养箱。

（1）试剂：中性改良罗氏培养基；无菌生理盐水。

缓慢生长对照菌株：堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）ATCC　12478CMCC（B）95013；快速生长对照菌株：草分枝杆菌（M.phlei）ATCC　111758CMCC（B）95024

（2）耗材：磨菌瓶（内含2mm无菌玻璃铺满一层瓶底，螺旋盖）、麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）、22SWG标准接种环、无菌吸管、无菌吸头、移液器、无菌试管。

（1）菌液制备：同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

（2）稀释：同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

（3）接种及培养：取2管中性改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期，用22 SWG标准接种环分别沾取1环（即0.01ml）10^－1mg／ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10^－3毫克／管。接种后的培养基置于培养架上，1只置于恒温培养箱28℃培养，另一只置于37℃培养。

同样接种快速和缓慢对照菌株培养。

如快速对照不生长或缓慢生长对照菌株不生长，本次实验结果为无效。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

在临床中作为生长速度的测试方法。

主要用于区分光产色、暗产色和不产色分枝杆菌。

分枝杆菌的纯分离培养物。

Ⅱ级生物安全柜、恒温培养箱、涡旋振荡器。

中性改良罗氏培养基、生理盐水。

光产色对照菌株：堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）ATCC　12478CMCC（B）95013；暗产色对照菌株：戈登分枝杆菌（M.gordonae）ATCC　14470CMCC（B）95018；不光产色对照菌株：胞内分枝杆菌（M.intracellulare）ATCC　13950CMCC（B）95002；颜色随温度变化菌株：苏加分枝杆菌（M.szulgai）NTCT10831

磨菌瓶（内含2mm无菌玻璃铺满一层瓶底，螺旋盖）、麦氏1号标准比浊管（MacFarland No.1）、22SWG标准接种环、无菌吸管、无菌吸头、移液器、无菌试管。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

取4管中性改良罗氏培养基，标记好样品编号、姓名、接种日期和稀释浓度，用22SWG标准接种环分别沾取1环（即0.01ml）10^－1　mg／ml的菌液，用划线法均匀接种至培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10^－3毫克／管。接种后的2支培养基以锡纸或黑纸包裹密封，另2支不包。将两支培养基（1支包纸和1支不包纸）在37℃培养，另2支于28℃培养。不包纸的培养基长出菌落时，打开2支包纸的培养管观察：有色素产生为暗产色菌；无色素产生者或者有淡黄色、浅黄褐色、黄褐色色素，在生物安全柜内放松管盖进行通气，同时以100W钨灯近距离（灯至试管的距离≤50cm）照射3小时，放置于原温度孵育3d，每日观察。

同样接种培养四种对照菌株并观察。

如阳性对照不生长或阴性对照生长，本次实验结果为无效。

同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

每次试验必须有四种对照菌株，其他同对硝基苯甲酸（PNB）生长试验。

暗产色菌和光产色菌为非结核杆菌；不产色菌可能为结核杆菌复合群。