第一节 分枝杆菌固体培养
一、检验目的
分离培养临床标本中的分枝杆菌。
二、方法原理
分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点，能耐受碱性消化液的处理，消化液直接接种于酸性培养基上，酸性培养基能中和碱性标本处理液，分枝杆菌能在酸性的培养基上生长。
三、检测样本
痰标本、咽拭子、胃灌洗液、其他体液标本、组织等。
四、仪器设备
1.Ⅱ级生物安全柜。
2.恒温培养箱。
3.涡旋振荡器。
4.冷冻离心机（水平转子、具备防气溶胶的离心杯（桶）、相对离心力能达到3000xg）。
5.天平。
6.蒸气恒温箱。
7.高压蒸气灭菌器。
五、试剂耗材
1.4%氢氧化钠（NaOH）溶液：4.0g NaOH，100ml蒸馏水，高压灭菌。
2.6%氢氧化钠（NaOH）溶液：6.0g NaOH，100ml蒸馏水，高压灭菌。
3.2.9%柠檬酸钠（citrate－2H2O）溶液：2.9g柠檬酸钠二水化物，100ml蒸馏水，高压灭菌。
4.N－乙酰－L－半胱氨酸（N－acetyl－L－cysteine，NALC）。
5.NALC－NaOH混合溶液配制 配制100ml NALC－NaOH混合溶液：在无菌的螺旋口试剂瓶（100ml）中加50ml 6%NaOH和50ml 2.9%柠檬酸钠溶液，用时加入0.5克NALC粉末，此溶液必须在配制好的24小时内使用（保存在2～8℃），因为存放过程中NALC逐渐失去黏液溶解的活性。如果一天内需要或多或少这一溶液，适当准备所需要的体积。
6.磷酸盐缓冲液（pH6.8，0.067M） 配制1.5L磷酸盐缓冲液，在2L或4L烧瓶中混合7.1g磷酸氢二钠（Na2HPO4），6.8g磷酸二氢钾（KH2PO4）和1500ml去离子水。在磁性搅拌器上用磁性搅拌棒搅拌。检查pH应该是6.8。如果需要进行调整，加磷酸氢二钠提高pH，加磷酸二氢钾降低pH。用100ml、200ml螺旋口试剂瓶分装缓冲液，标记名称、制备日期、失效期、配制人。盖紧瓶盖并在高压锅内高压消毒。
1.带螺旋盖的前处理管。
2.50ml离心管。
3.2ml无菌吸管。
4.酸性改良罗氏培养基。
5.中性改良罗氏培养基。
六、操作步骤
（1）对照标记的患者姓名，在生物安全柜内将约1～2ml标本转移至相应前处理管中，旋紧痰标本容器螺旋盖。
（2）视标本性状，将1～2倍的4%NaOH溶液加入到前处理管中，旋紧处理管螺旋盖，立即开始计时15分钟。
（3）在生物安全柜内，将处理管在涡旋振荡器上涡旋震荡30秒直至痰标本充分液化。
（4）将前处理管置于试管架内，置于生物安全柜内，室温静置，直至15分钟计时结束。
（5）拧开罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的凝固水，如果凝固水过多，则沿着斜面相对的一面的培养管内壁，将凝固水弃去。
（6）用无菌吸管吸取前处理后的痰标本，保持培养基斜面水平，均匀接种于酸性罗氏培养基上，每支培养基接种0.1～0.15ml（约2～3滴），接种时第一滴液体接种至斜面中部，第二滴接种到培养基上部（距离培养基顶端1cm处），拧紧螺旋盖，轻轻转动并放低培养管底部，使接种的液体均匀的在斜面上铺开。
（1）对照标记，在生物安全柜内将约2～5ml痰标本置于相应的离心管中。
（2）视标本性状，在生物安全柜内向前处理管内加入1～2倍体积NALC－NaOH混合溶液，并开始计时15分钟。
（3）旋紧盖子，在涡旋振荡器上涡旋震荡10～20秒，直至痰标本充分液化。
（4）将离心管室温静置，直至计时15分钟结束。
（5）在生物安全柜内打开离心管螺旋盖，向离心管中加入磷酸盐缓冲液至45ml，然后旋紧离心管螺旋盖。
（6）在生物安全柜中将离心管成对放入离心桶（杯）中，旋紧离心桶（杯）螺旋盖。
（7）从生物安全柜中拿出离心桶（杯）到低温冷冻离心机进行离心，设定制冷温度8～10℃，3000g离心15～20分钟。
（8）在生物安全柜内打开离心桶（杯），取出离心管，小心弃去上清液，加入1ml磷酸盐缓冲液，混匀。
（9）拧开罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的凝固水，如果凝固水过多，则沿着斜面相对的一面的培养管内壁，将凝固水弃去。
（10）用无菌滴管吸取前处理后的痰标本均匀接种于中性罗氏培养基上，每支培养基接种0.1～0.15ml（约2～3滴），接种时第一滴液体接种至斜面中部，第二滴接种到培养基上部（距离培养基顶端1cm处），拧紧螺旋盖，轻轻转动并放低培养管底部，使接种的液体均匀的在斜面上铺开。
1.将培养基放置在斜面放置架上，保持培养基斜面水平向上。
2.连同斜面放置架将培养管置于恒温培养箱内，36℃±1℃孵育。
3.待24小时后，直立放置培养管，36℃±1℃条件下继续孵育。
七、结果判读
1.接种后第3日和第7日观察培养情况，此后每周观察一次，直至第8个周末。每次观察后要在培养结果记录本上记录观察结果。
2.肉眼判定：结核菌的典型菌落形态为：不透明淡黄色、粗糙、干燥、凸起于培养基、有的成菜花样。如果发现培养基液化、或者长霉菌，则报告污染。
3.根据肉眼的初步判定，按以下生长情况记录结果：
无菌落生长报告培养阴性
菌落生长不及斜面面积1／4时，报告实际菌落数
菌落占斜面面积1／4 报告（1＋）
菌落占斜面面积1／2 报告（2＋）
菌落占斜面面积3／4 报告（3＋）
菌落布满培养基斜面报告（4＋）
如果发现培养基污染，按污染面积报告
污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1／4 报告（C1＋）
污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1／2 报告（C2＋）
污染菌有明显界限，且不超过斜面面积3／4 报告（C3＋）
污染菌没有明显界限或布满培养基斜面报告（C4＋）
4.初步判定、报告 按照培养的目的，按如下程序处理：
（1）以药物敏感性测试为目的（包括耐药性诊断和耐药监测等），不需要对培养物进行涂片检查，只需将培养物送至进行药物敏感性测试的实验室，并附培养物生长情况的报告单。
（2）以培养作为诊断或评价疗效为目的，需要对培养物进行涂片染色显微镜检查和菌种鉴定实验，根据涂片和鉴定结果进行报告。
培养物经涂片显微镜检查确定为抗酸菌后，结合菌落形态、生长时间，报告：罗氏培养分枝杆菌阳性。经菌种初步鉴定，证实为结核分枝杆菌复合群后，报告：罗氏培养结核分枝杆菌阳性。
5.结果解释 按生物学分类规则，结核菌属于分枝杆菌属，具有生长缓慢、抗酸染色等特性。结核菌是结核分枝杆菌复核群的笼统称呼。这一类菌主要包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌，它们的生长速度、菌落形态、生化特性、天然耐药属性非常相近，是结核病的病原菌。
从患者的标本中培养出结核菌，对诊断和评价治疗效果具有重要意义。
如果发现有黄色、光滑、湿润的菌落，可能为非结核分枝杆菌，即除结核菌以外的分枝杆菌。如果发现这类菌应送上级实验室进行菌种初步鉴定，并通知医生，嘱患者再留取一份标本，进行培养。如果再次非结核分枝杆菌培养阳性，将对诊断非结核分枝杆菌病和治疗具有重要意义。
如果发现典型结核菌菌落形态的细菌和污染菌并存，或者结核菌和非结核分枝杆菌并存，应立即将培养管送上级实验室进行分离。
八、注意事项
1.留取标本后，尽可能立即进行处理，进行培养实验。如果不能立即处理，应在4℃冰箱保存，在7天内必须处理并进行培养实验。
2.将试剂放在4℃冰箱保存。将氢氧化钠分装成若干小瓶，每次使用新的氢氧化钠；如果需要缓冲液，也照此准备；从而保证每次操作前，氢氧化钠溶液（或缓冲液）及其容器没有接触过开放的痰标本。
3.如果只有一台生物安全柜，避免同时进行涂片和培养操作。
4.在同一批处理的痰标本中，优先处理涂片阴性的标本，其次处理阳性级别低的标本，最后处理涂片阳性级别高的标本。
5.打开标本容器盖子时要缓慢以减少气溶胶的产生，同时避免剧烈震荡标本，震荡后静置几分钟，然后再打开盖子。
6.吸取处理过的痰标本时，应在吸管前端保持一段空气，防治吸管中标本滴落。
7.选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行培养，避免弱处理和过处理。
8.处理标本时，尽可能随时盖上容器盖子，避免在生物安全柜内敞开所有的标本容器或者离心管。
9.对于含有痰栓或者难以液化的标本，可以在加入预选高压灭菌的玻璃珠，以便涡旋时打碎痰栓；如果经过20分钟处理，痰标本中仍有未液化的痰栓，应避免吸取痰栓接种培养基。
10.接触过污染物（痰或其他标本）的无菌吸管应置于废液缸中。
11.正确标记培养管避免标本之间混淆。
12.控制前处理去污染的接触时间，从向标本中加入氢氧化钠到接种时间不能超过20分钟。当标本数量较多时，应分批处理，通常每批标本数量不超过6份为宜。
13.应将培养结果及时反馈给临床医生。7天以内的结果观察中如果发现污染，应告知病人及时收集另一份标本；如果发现快速生长分枝杆菌（7天内长出的菌落）。立即报告结果并要求再收集另一份痰标本。
14.结核菌可能在3～4周内生长。发现菌落并鉴定后立即报告结果。报告阴性培养结果时应孵育满8周。
15.登记内容应包括：菌落初生长的日期以及阳性培养物的菌落特征；污染结果应随时检出并报告。
九、质量控制
质量保证包括室内质量控制（QC）、室间质量评估（EQA）、质量提高（QI）。其中室间质量评估又包括现场评价（on－site evaluation）、盲法复检（blinded－rechecking）、批量测试（panel testing）。结核病实验室对于固体培养的质量控制主要靠室内质量控制并结合现场评价来实现。在室间质量评估中现场评价虽然是一种质量保证的实现形式，但需要一定的人力、物力，难以达到日常监控的目的。对于盲法复检，由于痰标本难以重复的特性，此方法很难实现；对于批量测试，质量控制样本准备方面还需要更多的技术投入，现阶段我国也很难实现。
（1）制订适合本实验室的标准程序操作手册。
（2）实验人员经过培训合格。
（3）人员、设备、房间固定。
（4）配制试剂要有配制记录、准确性验证。
（5）各个使用的仪器需要有温度记录（一天两次）、检测记录、维修记录。
（6）培养基需要有制作记录、直立避光保存、使用之前要观察外观并进行无菌性测试、敏感性测试、生长度测试等。
（7）严格按照标准程序操作手册进行操作。
（8）所有实验结果和记录必须装订成册。
（9）每月进行数据统计分析，包括标本量、阳性率、涂阳培阳率、涂阳培阴率、污染率。
公式：
（初诊病人涂阳培阳率应大于90%） 
（控制在2%～5%）
合格培养基的外观为斜面颜色新鲜，斜面表面光滑无气泡，无变形，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。
如果自制培养基，实验员应在制作完毕检查培养基发现问题分析原因；如果使用外部来源培养基，则在使用前，从以下几方面查验培养基，质量不好的培养基应弃去不用。
培养基颜色鲜艳，酸性罗氏培养基绿色略偏蓝，中性罗氏培养基为绿色；如果培养基异常颜色灰暗，过蓝或过黄，均不能使用。
同一批制作的培养基如果呈现不同的颜色可能是由于混匀不充分。若颜色为非常深的蓝色可能是由于孔雀绿过多或者pH太低（呈酸性）。非常深的黄色表明培养基中孔雀绿质量不好或者pH太高（呈碱性）。凝固的培养基颜色变浅还可能是由于过高的温度所致。
培养管的底部应该有少量凝固水。在接种前应倾去过多的凝固水。
培养基中出现了较大块状物表明匀质性较差。
（1）抽取5%的培养基，置于恒温培养箱内，36℃±1℃孵育。
（2）48小时后观察是否有细菌生长。
（3）培养基斜面无培养物生长，即为无菌性测试合格。
（4）如果发现任何一支培养基有培养物生长，则将同一批次的所有培养基置于36℃± 1℃孵育48小时，逐一检查培养基，弃去有细菌生长的培养管，没有培养物生长的培养管拧紧螺旋盖保存备用。
（5）填写无菌测试记录，保存记录备查。
培养基应在冷藏环境下置于密封袋内保存，保存期不超过2个月。
菌悬液制备方法：
挑取菌株至磨菌容器，加入无菌生理盐水2～3滴，研磨后加入生理盐水制备McFarland NO.1悬液。
使用无菌生理盐水稀释至10－3 mg／ml，然后用无菌22SWG接种环挑取菌液，接种至5支现有的质量合格的培养基和5支被检培养基二环（约0.02ml），最终接种菌量为2×10－5 mg。稀释接种方法也可将菌液稀释至10－4 mg／ml，使用无菌吸管接种0.2ml，36℃保持斜面水平放置24小时后直立继续培养，最终接种菌量同样为2×10－5 mg（预计菌落形成单位不少于20个）。21天观察结果。
符合以下两条标准即为敏感性测试合格：
培养基菌落平均初生长时间一般不超过21天。
不少于20个。
每次进行培养基敏感性检测的结果都应记录备查。
每年国家级结核病实验室对省级结核病实验室、每半年省级实验室对市级实验室、每三个月市级结核病实验室对区县级实验室进行现场督导。
十、临床意义
1.对痰涂片阴性的病人进行诊断。
2.获得菌种鉴定试验所需的纯培养物。
3.获得药敏试验所需的纯培养物。
4.疗效判断 是评价治疗效果的重要指标。