第三节 液基夹层杯法
一、检验目的
检测样本中有无抗酸杆菌，为结核病的临床诊断提供参考依据。
二、方法原理
运用夹层杯技术，通过标本消化液消化后，选择有效成分离心附着于透明高分子薄片上，经过自动或手工染色（应用萋－尼氏或荧光抗酸染色来检测抗酸菌），将完成染色的标本膜片用取片针取出，人工或计算机辅助阅片。
三、检测样本
适用于人体各种体液标本和病理组织标本的抗酸杆菌形态学检验。
四、设备和试剂
生物安全柜、自动离心涂片机、天平、高压蒸气灭菌器、冰箱、光学显微镜或荧光显微镜、涡旋振荡器，液基夹层杯配套试剂。
五、操作步骤
（1）在生物安全柜中，小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。
（2）在标本中加入2～4倍于标本的标本消化液，轻摇至痰块消散，用一次性吸管取消化好的标本5ml（范围3～7ml为宜）于夹层杯－Ⅰ中，盖紧杯盖，至振荡器震荡3分钟。移至离心机中，4500转／分钟，离心5分钟。
（3）从离心机内轻轻取出夹层杯－Ⅰ，倾去上清液，置干片机内烘干表面水分，滴加无水乙醇数滴，固定数秒，倾去多余的无水乙醇。
（4）滴加抗酸染色液A液5～7滴，干片机内加温60℃左右染色保持5分钟，小量流水沿杯壁轻轻冲洗，沥干。滴加B液4～6滴，脱色至无色。小量流水洗净，沥干。滴加C液4～6滴，染色1～3分钟，水洗，烘干。
（5）用取片针将夹层杯－Ⅰ内基片顶出，用镊子夹出基片，在吸水纸上轻轻印干表面水分，置干片机内彻底烘干，标本面向下，用中性胶封片，用记号笔在玻片上面上注明实验序号及标本序号，确保玻片的编号与痰盒上的编号相同。
（6）显微镜检查。
六、结果判读
结核分枝杆菌基本形态为细长、直或稍弯、两端钝圆、有微荚膜、无芽胞、无动力的杆菌，常呈分枝状生长。菌体宽度在0.2～0.6μm之间，菌体长1～10μm（通常3～5μm）。菌体的一端或两端有较深的异染颗粒，富含多磷酸盐，可能是能量储存和氧化还原反应的场所，有时可呈串珠状。在结核病人痰标本中结核分枝杆菌可单个散在、2个以上呈“人”、“Y”等排列，缠绕呈索状或丛状时为有毒株的典型形态学特征。
结核分枝杆菌在不利条件下导致细胞壁缺陷或部分缺陷（L型细菌）呈现出颗粒型、滤过型和球菌型等不典型形态。在结核分枝杆菌发育的特定阶段，可表现为非抗酸性、非细菌细胞性、革兰染色阳性的颗粒型体。
非结核分枝杆菌形态和抗酸性通常都不典型。
1.抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。
2.抗酸杆菌阳性抗酸杆菌菌数：1～8条／300视野。
3.抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条／100视野，连续观察300个视野。
4.抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条／10视野，连续观察100个视野。
5.抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条／1视野。
6.抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条／1视野。
报告“1＋”时至少观察300个视野，报告“2＋”至少观察100个视野，3＋、4＋时至少观察50个视野。
不典型抗酸菌（如：颗粒体、丝状体、巨球体等），按实际观察情况描述报告结果。例如：萋－尼氏染色阳性颗粒体（2＋）。
七、注意事项
1.一张载玻片上只能涂抹一份痰标本；
2.每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于抗酸染色涂片检查；
3.涂抹后的痰膜不能太厚或者太薄，透过痰膜看报纸上的五号字时，字迹较模糊为适宜的厚度；看不见5号字或很清晰，则表明该玻片涂抹过厚或过薄；
4.由于香柏油（cedarwood oil）能够溶解复红染料，使萋－尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害；故禁止使用香柏油，必须使用显微镜专用的镜油（immersion oil for microscopy）。镜油折射系数（RI）应大于1.5，20℃黏度系数应在100～120mPas之间。
1.必须使用新玻片进行涂片检查。
2.染色时勿使玻片上的染液干燥。
3.滴加染色液或镜油时，避免容器滴口直接接触痰膜。
4.严禁物镜镜头直接接触痰膜。
5.作为对照，可采用已知结果为阴性的玻片完成染色镜检过程。
6.完整、准确的标注痰盒、玻片和登记实验登记本。
7.登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
8.准确记录和报告结果。
1.确认标本是痰而非唾液。
2.确认每份标本至少有3ml。
3.选择干酪痰、血痰和黏液痰涂抹制备玻片。
4.制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。
5.使用高质量染料、严格按照配方配制染液。
6.严格按照操作程序完成染色过程。
7.判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。
8.作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。
9.完整、准确的标注痰盒、玻片和实验登记本。
10.登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
11.准确记录和报告结果。
八、质量控制
质量控制包括室内质量控制和室间质量控制。室内质量控制指实验室内部的操作规程、设备和耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告，以及痰片保存等整个过程的内部检查和监测。
对当日不能进行涂片检查的痰标本，须置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。
1.为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触涂片上的痰膜。
2.按照结果报告标准仔细观察足够的视野数。
3.每个工作日，一名镜检人员的涂片阅读量不应超过25张。
4.连续阅读10～12张涂片后，应休息20分钟左右。
5.采用自查和互查方式，至少抽查复检当日10%涂片，并填写室内质控登记表。
其他同萋－尼氏抗酸染色法。
九、临床意义
夹层杯法染色抗酸杆菌阳性，说明在检测样本中有抗酸菌存在，但不能确定为结核、非结核或其他分枝杆菌（如诺卡菌属，广泛分布于自然界，亦可引起人和动物的诺卡氏菌病），需要进一步通过分枝杆菌培养和菌种鉴定才能确定。在临床诊治意义如下：
结核病的控制是以发现和控制传染源为主，而痰涂片AFB阳性的肺结核患者是社会上最主要的传染源，故痰涂片AFB检查结果对诊断传染性肺结核是一项重要指标，抗酸染色可以作为分枝杆菌选择性培养基中培养时鉴别是否存在其他菌污染的参考依据之一。
结核病是由结核分枝杆菌引起的，现行化疗方案的制订也主要以结核分枝杆菌的生物学特性为依据，所以对化疗效果的评价，也将细菌学检查结果作为根据。
由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义，因此，在反映某一国家或地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患病率、涂阳发病率被更多关注。