第一节　菌株保存

一、目的

分枝杆菌菌株是微生物学以及生命科学相关研究的基本材料，为了更好地保护和利用生物资源，实验室根据需要可对分枝杆菌菌株进行保存管理。

二、原理

菌株保存主要是根据微生物的生理生化特点，人工地制造环境条件，使微生物代谢活动尽量降低，减少变异，即采取低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等方法达到长期保存的目的。

三、方法

菌株保存方法，根据需要移种传代间隔的时间，可分为短期（3～24个月）和长期（≥2年）保存方法。

短期保存方法主要针对于实验室日常使用菌株，为了保持分枝杆菌的活性，需要定期转种传代，一般6个月需要转种一次。

这是一种最基本的方法，适用范围广，对生长速度快、慢的分枝杆菌都可应用。分离的分枝杆菌转种罗氏培养基（L－J）斜面、在适当孵育温度条件下生长良好后，菌株置于4℃左右保存。该方法对一般慢生型分枝杆菌可保存3～6个月；生长速度快的分枝杆菌能够保存2～3个月。到期后重新转种一次。对于个别菌种需要结合菌种所需的营养条件、生长速度、繁殖能力对移种传代的时间间隔进行适当调整。这种方法的弊端是传代次数多容易发生变异，如导致部分分枝杆菌繁殖能力下降、生物性状发生变化、毒力减小甚至基因失落等；同时传代次数多也容易使污染机会增加。应挑选对数生长期的菌株进行传代保存，保存温度应控制2～4℃之间。

适用于仪器设备齐备（如超低温设备、真空干燥设备）、实验防护设施和相关措施较完善、开展科研和检查项目的实验室采用。每支保存管中要求的细菌数量在10^8～10　cfu（≥10mg）。以保证被保存菌株经过长期、低温冷冻保存后能够传代复活。

4.7g　7H9粉、200ml丙三醇、700ml蒸馏水，高压灭菌（121℃，15分钟），冷却后加100ml OADC营养添加剂，4℃保存。

4.0g天门冬素、2.0g柠檬酸、0.5g K₂HPO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.05g柠檬酸铁铵、200ml丙三醇、800ml蒸馏水，用氨水调pH至7.2，高压灭菌15分钟，4℃保存。

胰蛋白胨10g，蒸馏水1000ml，调pH至7.0，121℃高压灭菌15分钟，4℃保存。