第三节 肝癌微环境的分子病理学检测
在肝癌微环境中,肝癌细胞不仅与基质细胞发生相互作用,还可与细胞外基质成分相互作用,从而影响肝癌的生长和转移,在这过程中有许多肝癌微环境相关分子参与,如缺氧诱导因子、膜离子转运体、炎症因子、生长因子和蛋白水解酶等。 因此,应用分子生物学等技术检测这些肝癌微环境相关分子的变化有助于肝癌的临床诊断与预后判断。
一、肝癌微环境的分子病理学检测技术
目前,应用于肿瘤微环境研究的分子病理学检测技术主要包括有芯片技术、聚合酶链反应、原位杂交、免疫组织化学技术、ELISA、组织低氧检测技术及组织pH 成像技术等。
(一)芯片技术
芯片技术包括有基因芯片、蛋白芯片及组织芯片等技术。
基因芯片(gene chip)也称DNA 芯片、微阵列(microarray)或生物芯片(biochip)。 基因芯片主要用于检测细胞全部基因在特定时刻的表达谱。 通过将肿瘤细胞总mRNA 反转录为cDNA 再杂交到具有不同基因探针的DNA 芯片上,就可得到不同基因在不同条件(如肿瘤低氧或低pH 等)下的表达情况。该方法可用于发现与肝癌微环境相关的特定类型基因,并可应用于肝癌临床诊断等。
蛋白质芯片技术是一种新型蛋白质分析技术,它在很小的固相支持物(载体)表面固定大量蛋白探针(可以是抗原、抗体、受体、配体、酶或底物等),形成高密度排列的蛋白质点阵,将生物分子的特异结合性和高分辨光学成像技术相结合,仅需微量样品,即可以同时检测不同的生物分子和目标分子间的相互作用。 它能直接测量血浆等样品,可应用于高通量检测与肝癌微环境相关的分泌蛋白等。
组织芯片技术(tissue microarray)是将数十个甚至数千个不同个体组织标本集成在一张固相载体上所形成的组织微阵列,是DNA 芯片技术的发展和延伸。 通过组织芯片与基因芯片和蛋白芯片的有机结合,对肝癌微环境相关新基因的发现及蛋白质表达谱等的研究均有着重要的作用。
(二)聚合酶链反应
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种将特定DNA 片段在体外快速扩增的方法。该方法操作简便,在数小时内可使几个拷贝模板序列甚至一个DNA 分子扩增至107～108 倍。 近年来,在经典PCR 技术基础上又发展起了定量PCR 及原位PCR 等技术。 应用定量PCR 等技术可研究不同条件下肝癌微环境相关特定基因的表达变化情况。
(三)原位杂交
原位杂交技术(in situ hybridization,ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门技术,其基本原理是将放射性或非放射性的外源核酸分子(即探针)与染色体、细胞或组织上待测DNA或RNA 互补配对,结合特定的核酸分子,经一定的检测手段将待测核酸在染色体、细胞或组织上的位置显示出来。 该技术包括有基因组原位杂交(genome in situ hybridization,GISH)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)及原位PCR 等。
(四)免疫组织化学技术
免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)是利用抗体与抗原特异性结合的特性,通过化学反应使标记抗体的显色剂(如荧光素、酶、金属离子、核素等)显色,对组织细胞内抗原进行定位、定性及定量研究。 可应用该技术对特定微环境相关分子在肝癌组织的定位及表达情况进行分析。
(五)ELISA
酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)简称酶联免疫法或ELISA法,它的基本原理是利用抗体与抗原特异性结合的特性,检测时加入酶标记的抗体或抗原分子,进一步通过与酶底物反应显色来间接检测目标分子的表达量。 该方法可应用于检测肝癌微环境中的分泌蛋白、细胞因子等,在临床诊断及预后监测中起重要作用。
(六)肿瘤组织低氧检测技术
测定实体瘤内的氧压力对判断患者预后有较高的临床应用价值。 其测定方法包括有体内氧电极测定法、生物还原药物(如硝基咪唑类等)测定法及放射自显影技术等,其中利用放射性核素18F、62Cu、123I等标记的缺氧组织显影剂进行SPECT(single-photon emission computed tomography)或PET(positron emission computed tomography)显影技术可对肿瘤组织内低氧情况进行定性和定量检测,是目前检测肿瘤内低氧状态较成熟的技术。 此外,也可通过检测低氧细胞内源性标志物(如HIF-1α 等)来间接反映肿瘤组织的缺氧情况等。
(七)组织pH 成像技术
该方法是将磁共振成像(MRI)与碳-13 标记的碳酸氢盐静脉注射联合使用,从而测定体内组织pH。 在碳酸酐酶的催化作用下,碳酸氢盐可与二氧化碳反应影响组织pH 值,根据Henderson-Hasselbalch 方程,标记的碳酸氢盐与二氧化碳的比例可用来计算pH 值。
二、肝癌微环境相关分子
(一)肝癌低氧微环境相关分子
细胞缺氧引起的主要结果之一是缺氧诱导因子(hypoxia inducible factors,HIFs)的稳定性增加。 肿瘤微环境缺氧可使肿瘤细胞中HIFs 稳定性增加,HIFs 主要通过与糖酵解、血管新生、细胞增殖及转移等相关基因调控区域的缺氧反应元件(HREs)相结合,调控这些基因的表达,从而引起肿瘤细胞存活、黏附、迁移及侵袭能力的改变。 研究表明HIF-1α 在肝癌组织中的表达高于癌旁组织,且其表达水平与肝癌预后呈负相关。 缺氧时,HIF-1 可诱导血管内皮生长因子(VEGF)的表达,促进肿瘤血管新生和肿瘤生长。 同时,缺氧可影响转移相关的关键基因,从而促进肿瘤细胞发生转移,例如HIF-1 可通过上调Snail 等E-cadherin 抑制因子,从而下调E-cadherin 表达而促进肿瘤细胞转移。 此外,缺氧可通过诱导己糖激酶Ⅱ等代谢相关基因的表达,从而刺激肝癌细胞的生长。
(二)肝癌酸性微环境相关分子
肿瘤酸性微环境的形成可能主要与肿瘤细胞缺氧和糖酵解代谢增强有关。 肿瘤细胞主要通过一些膜离子转运体(如囊泡型H+-ATPase 和Na+/H+交换体等)来维持这种肿瘤酸性微环境。
1.囊泡型H+-ATPase
囊泡型H+-ATPase(Vacuolar H+-ATPase,VHA)普遍存在于真核生物中,是一种由多亚基组成的ATP 酶,包含有V1 和V0 两个功能域。 V1 位于胞浆,由8 种不同亚基组成(3A、3B、C、D、E、F、2G、H),具有水解ATP 的功能;V0 位于胞膜,由6 种不同亚基组成(a、d、e、c、c′和c″),发挥质子运输通道作用。 在肝癌中,研究发现V-ATPase 在肝癌组织的表达量明显高于癌旁组织,且V-ATPase 高表达与肝癌患者预后差密切相关。 体内外实验发现,应用RNAi 技术下调VHA 表达可抑制肿瘤细胞V-ATPase 活性,降低肝癌细胞的运动和侵袭能力,且能抑制人肝癌细胞移植瘤的生长与转移。
2.Na+/H+交换体
Na+/H+交换体(Na+/H+exchangers,NHE)是存在于哺乳动物细胞质膜上的离子转运体。 NHE 蛋白家族共有9 种亚型,命名为NHE1～9,其中NHE1～5 位于细胞膜表面,而NHE6～9 分布于胞内的细胞器表面。 在这些亚型中NHE1 最为重要,其广泛存在于各种组织细胞。 研究表明,NHE1 在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且NHE1 表达增高与肝癌瘤体增大、血管浸润及预后差相关。
此外,肝癌细胞还可通过上调碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ,CA-Ⅸ)及单糖转运体4(monosaccharide transporter 4,MCT4)等来调节内碱外酸的酸性微环境。 有研究发现肝癌组织中MCT4 高表达的患者总生存期及无病生存期明显缩短。
(三)肝癌炎性微环境相关分子
肝纤维化是肝癌的高风险因素之一,慢性肝损伤引起的炎性环境促进了肝纤维化的进程,并最终导致了肝癌的发生发展。 肝癌的发生发展与炎症相关因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)等有重要联系。 IL-6 是一种具有多种生物学功能的炎症因子,在肝细胞损伤时由肝kupffer 细胞产生,刺激肝细胞代偿性增殖。 血清IL-6 浓度在肝纤维化时期即可增高,而肝癌患者血清中IL-6 浓度增高往往提示该患者的预后较差。 由于雌激素可抑制kuppfer 细胞分泌IL-6,因此部分解释了肝癌的发生存在性别差异。 近期研究显示,IL-6 与肥胖引起的肝癌密切相关,在肥胖小鼠体内IL-6 与肿瘤坏死因子(TNF)的表达量增高,并通过激活下游STAT3 与ERK 信号通路,从而促进了肝内肿瘤的形成。 TNF-α 同样也是一种具有多种生物学功能的炎症因子,主要由kuffper 细胞及其他免疫细胞分泌,通过激活下游NF-κB 及Akt 信号通路在肝再生中发挥重要作用。 类似的,IL-1 通过促进MyD88 接头蛋白依赖的肝细胞代偿性增生参与了肝再生进程。 同时IL-1 也促进了肝星状细胞的增殖、激活、分化为肌纤维母细胞,此外还刺激肝星状细胞分泌、激活基质金属蛋白酶9(MMP9)等多种基质金属蛋白酶。
(四)肝癌微环境相关分泌性蛋白
1.生长因子 在肝癌微环境中,肝癌细胞可自分泌或通过周围基质细胞旁分泌一些生长因子如TGF-β、FGFs、HGF、PDGF 及VEGF 等,从而影响肝癌生长与转移。 其中对TGF-β 在肝癌发生发展中作用的研究较多。 TGF-β1 以非激活形式释放入细胞外基质,被肿瘤微环境中大量存在的MMP-2 或MMP-9 激活。 激活状态的TGF-β1 通过与TGF 受体Ⅱ结合,使TGF-βR Ⅰ磷酸化,通过Smad-2 和Smad-3 激活下游信号通路。 TGF-β1 在肝癌组织及周围基质中表达量增高,并且在肝纤维化及肝癌发生过程中起重要作用。 TGF-β 通常通过抑制细胞增殖、激活凋亡相关信号通路等方式,在癌前状态起肿瘤抑制因子的作用。 TGF-β1 通过募集周期蛋白依赖性激酶抑制剂实现抑制增殖作用,通过下调抗凋亡蛋白及抑制c-Myc 表达实现促凋亡作用。 TGF-β的肿瘤抑制作用不仅仅针对肝细胞自身,它同样对肿瘤基质细胞分裂及肿瘤相关炎症有抑制作用。 但不同情况下,TGF-β1 的肿瘤抑制作用可能转变为促进肿瘤生长作用。 已有相关研究表明,肝细胞分泌的TGF-β 原本通过磷酸化Smad3 的C 末端发挥抑癌作用,而在HBx 及HCV 激活JNK 信号通路的条件下可转变为促癌因子,并通过促使Smad3 形成链接磷酸化Smad3 发挥作用。 已有研究证实TGF-β1可上调Snail 的表达,降低E-cadherin 的表达,进一步说明了它参与了细胞的上皮间质转化过程(EMT过程)。 与这些分子水平的结论相符,TGF-β1 在细胞水平表现出促进肿瘤的侵袭、血管浸润(通过对整合素β1 的修饰及增加整合素α3 的表达)、血管新生(通过产生VEGF)、肿瘤与基质间的对话及转移(通过增加结缔组织生长因子)的作用。 TGF-β1同样也通过激活PDGF 信号通路促进了EMT 的过程。 TGF-β1 通过调节促癌miRNA 的表达促进了肝癌发展进程。 暴露在TGF-β1 中的肝细胞miR-181b表达量增加,该miRNA 在肝癌中促进了肝癌细胞的增殖、存活、迁徙和转移。 类似的,TGF-β 还能诱导产生miR-23a、miR-27a 及miR-24,这些miRNA 同样促进了肝癌细胞的增殖与存活。
除TGF-β 外,PDGF、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)等其他肝素结合性生长因子在肝癌的发生发展中同样发挥着重要作用。 PDGF 促进了肝纤维化及细胞增殖,在肝星状细胞转变为肌纤维母细胞的过程中发挥重要作用。 Campbell 等研究发现转基因小鼠肝脏中血小板衍生生长因子C(PDGFC)的过表达可通过激活Erk 和PKB/Akt 信号通路促使肝星状细胞增殖活化,导致组织纤维化加剧,进而演变为肝细胞癌。 肝细胞癌是一种高血管质的肿瘤,因此血管新生是肝癌发生发展中的关键步骤。VEGF 是正常组织及癌组织中调节血管新生的重要因子。 在炎症环境下,VEGF 因NF-κB 信号通路处于激活状态而表达量增多。 VEGF 不仅仅在调节血管上皮细胞增殖方面起重要作用,它还能通过下游的Akt/mTOR 通路促进表达VEGF-A 受体的肿瘤细胞的增殖。 FGFs 是一类与组织新生、创伤愈合及血管新生相关的生长因子。 肝癌中FGFs表达异常,并且通过激活下游Erk 和AKT 信号通路促进了血管内皮细胞及癌细胞的增殖。 HGF 是一类表达在肝星状细胞或肌纤维母细胞的生长因子,研究表明它能通过肌纤维母细胞促进肝癌细胞的增殖与侵袭,进而调节肿瘤与细胞基质的交互作用。
2.基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶(MMPs)于19 世纪60 年代首次发现,它是一种锌依赖的肽链内切酶。 MMPs 在炎症进程中参与了组织的重构及调控过程。 现今已知的人MMPs 总计共23 种,不同的基质环境中的各类肿瘤细胞分泌产生各种不同的MMPs。 MMPs 的主要亚型有以下几类:①胶原酶(collagenases),如MMP-1、MMP-8、MMP-13;②白明胶酶(gelatinases),MMP-2、MMP-9;③间质溶解酶(matrilysins),MMP-7、MMP-26;④膜型MMPs(membrane type MMPs),MMP-14～17、MMP-24～25;⑤基质溶解素(stromelysins),MMP-3、MMP-10～11。
MMPs 促进了组织重构,炎症反应,在多种癌症中促进了肿瘤细胞的生长,侵袭和转移,并且MMPs作为肿瘤微环境的重要调节因子,在肝癌发生发展中起重要作用。 肿瘤侵袭往往是由于MMPs 蛋白水解酶活性升高,引起细胞外基质降解,促进肿瘤细胞播散而引起的。 近期研究表明MMPs 的作用不仅仅能引起细胞外基质的降解,还能调节肿瘤细胞相关信号通路。 MMP-2,-9 及-14 能激活TGF-β1,后者是肝癌中上皮细胞间质化的关键调节因子。 TGF-β1 同时也能反向激活MMPs。 TGF-β1 通过调节MiR-181b 上调MMP-2 与MMP-9 的表达,从而促进肝癌细胞的侵袭转移。 MMPs 同时也抑制了肿瘤细胞的凋亡。 例如Fas 配体,通常与Fas 受体结合从而启动凋亡信号,而MMP7 能使其裂解从而阻断凋亡信号的启动。 MMP-2、MMP-9 与MMP-14 通过调节血管生成因子(VEGF)促进肝癌的血管新生。MMPs 通过调节炎症因子及趋化因子参与炎症反应,促进肿瘤的发展进程。 MMP9 在肝癌中高表达,并且往往与包膜浸润相关。 同时,MMP-9 还通过促进骨桥蛋白(OPN)前体转化为活性形式促进肝癌的侵袭转移。
3.可作为临床诊断及预后判断的分泌蛋白甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是白蛋白家族的一种糖蛋白,在胚胎早期的卵黄囊中高表达,出生后18 个月即降低,在正常人血液中浓度较低,仅5～10g/L,而在肝癌发生时重新升高。 AFP 是现今最常用的肝细胞癌血清学诊断标志物,并且被用于对高危患者的监测筛查。 但相关研究表明,AFP 对肝癌的检测灵敏度仅25%～65%,在早期肝细胞癌中则更低,并且在其他肝脏疾病,如肝炎及肝硬化中也有不同程度的升高,降低了检测的特异性。
近期一项大规模临床多中心试验结果显示分泌蛋白DKK1 对肝细胞癌,尤其是早期肝细胞癌具有较好的诊断价值,同时可弥补AFP 对肝细胞癌诊断能力的不足,其在AFP 阴性肝癌患者中仍具有较高的诊断灵敏度。 而DKK1 与AFP 联合应用,可将肝细胞癌的总体检出率提高至88%。
随着各种组学技术和高通量技术的发展,一系列新型可能作为候选肝癌标志物的异常分泌蛋白相继被发现并研究,如小扁豆凝集素反应性AFP(lectin lens culinaris agglutinin reactive AFP,AFP-L3),异常凝血酶原(des-γ-carboxyprothrombin,DCP),蛋白多糖3(glypican-3,GPC3),高尔基蛋白73(golgi protein 73,GP73),骨桥蛋白(osteopontin,OPN)等。