第一节　肝细胞癌的分子流行病学特点

一、流行概况与危险因素

(一)发病率、死亡率与分布特点

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第六位发病(748 300 新发病例)和第三位死因(695 900 死亡病例)的癌症。 全球而言,HCC 发病率在男性中居第五位,在女性中居第九位。 HCC 的发生存在种族、地域、性别差异。 80%的HCC 发生在发展中国家,特别是亚洲及撒哈拉以南的非洲国家。 HCC 恶性程度高,死亡率接近发病率。 目前除甲胎蛋白(AFP)以外,尚无有效的早期筛查和诊断方法,因此当HCC 被发现时,往往以接近中晚期。原位肝移植和外科切除是目前仅有的治愈性方案。然而接近70%的患者在接受手术治疗后5 年内复发。 来自我国社区人群资料显示,接受手术治疗HCC 患者5 年生存率为32.64%,而非手术治疗患者5 年存活期为9.01%。 高复发率是改善HCC 患者预后的主要障碍。

我国是HCC 的高发区,HCC 患者占全世界50%以上。 在我国大陆地区,最近5 年HCC 位居恶性肿瘤死亡原因第二位。 以上海市社区人群为基础的研究显示,肝癌每年在我国男性和女性人群中的发病率分别达到21.98/10 万和6.96/10 万,而死亡率分别为19.16/10 万和6.06/10 万。 可见HCC 是我国公共卫生领域面临的重大课题,如何提高患者术后生存率、改善其生存质量是目前公共卫生领域的重大需求,具有重要意义。

(二)危险因素

HCC 的主要危险因素包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染,丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)慢性感染,以及酒精性肝硬化。 其他因素还包括黄曲霉毒素B1(aflatoxins B1,AFB1)暴露、糖尿病等代谢综合征以及烟酒嗜好等。 此外,遗传因素如易感基因的存在和基因的甲基化修饰等也可能在HCC 的发生中起到一定作用。

HBV 慢性感染是我国HCC 最主要的危险因素。 在中国台湾地区进行的大规模队列研究发现,注射乙肝疫苗能显著降低HCC 的发病率,提示HBV 感染是HCC 的重要病因。 我国大陆地区现存约9400 万HBV 感染者。 虽然2002 年后出生人群疫苗接种等措施显著降低了HBsAg 携带率,但是此前出生人群HBsAg 携带率高达8.57%。 因此,未来50 年我国HCC 疾病负担仍然沉重。

HCV 通过诱发肝硬化导致HCC,HCV 感染人群的HCC 危险程度与肝硬化程度相关。 过量(>50～70g/d)和长期的酒精摄入增加肝硬化的几率,而肝硬化是典型的HCC 的癌前病变。 糖尿病患者容易患非酒精性脂肪性肝炎,5%的患者因此而进展成肝硬化。 糖尿病还可以导致一些潜在致癌因素,诸如胰岛素样因子的升高。 嗜酒并携带HCV、HBV 或患有糖尿病的人群中,肝硬化和HCC 的发生率会进一步增加。 男性及年龄高于75 岁的人群具有显著的HCC 患病风险。 男性发生HCC 的几率是女性的2～4 倍。 可能的原因是男性感染病毒性肝炎和酒精暴露比女性高,也可能与雄性激素如睾(甾)酮的致癌作用有关。 HCC 的发生和发展是由遗传因素和环境因素相互作用的结果。 目前我国HBV 感染者占全球1/3,而HCC 占全球50%以上,以及世界各地华人人群中的HCC 患病率显著高于当地人群的事实,表明不同种族人群对HCC 具有不同的易感性,我国HBV 感染者发生HCC 的风险更高。 此外,一部分HBV 感染者终身不发生肝硬化、HCC 等终末性肝病,而成为终身无症状携带者或慢性感染状态,提示宿主遗传因素在HCC 的发生中起重要作用。 目前发现的HBV-HCC 遗传易感位点较少且多与免疫炎症因子有关,提示先天遗传所致免疫功能缺陷与HBV 慢性感染导致了非可控性炎症,进而促进了HCC 的发生。

二、暴露生物标志物

全球而言,HBV 是HCC 最主要的危险因素。HBV 属嗜肝DNA 病毒科,基因组长约3.2kb,是已知真核细胞最小的DNA 病毒之一。 HBV-DNA 为不完全的环状双链DNA,其中长链核苷酸序列与病毒的mRNA 互补,为负链,短链为正链。 HBV 基因组包含4 个开放读码框(open reading frame,ORF),即S 区、C 区、X 区和P 区,分别编码外膜蛋白、核壳、聚合酶和X 蛋白。 由于HBV 的复制是以mRNA 为中间体的反转录复制,而在这一过程中缺乏校对酶的作用,容易发生碱基配对错误,因而HBV 基因变异十分频繁。 HBV 病毒变异、基因型、病毒滴度、HBeAg 状态等病毒因素与HCC 发生发展相关。HBV 感染在临床上可产生不同的肝脏疾病谱,包括无症状的表面抗原携带者、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化和HCC(图1-1-1)。

目前已根据HBV 全基因核苷酸序列异质性≥8%或S 基因异质性≥4%将HBV 分为A～H 共8 种基因型,其中HBV 基因型又可进一步分为基因亚型。 全球而言,HBV 基因型存在明显的地理分布特征。 基因型A 流行于非洲南部与西部(基因亚型A1,A3～A5),西欧与北欧(A2)。 基因型B 与C 流行于东亚及东南亚。 基因型D 流行于地中海地区,中东以及西亚。 基因型E 局限于非洲西部。 基因型F 常见于中美洲。 基因型G 和H 在南美洲(图1-1-2)。

我　国 HBV 主　要 基 因　型 为 C(68.3%)、 B(25.5%)、D(1.5%)和混合型(5.7%)。 HBV 基因亚 型 主 要 为 C2(58.0%)、 B2(27.3%)和 C1(10.7%)。 HBV C 型分布于全国,但在长江以南地区所占的比例显著低于长江以北地区;HBV B 型的分布与C 型相反(图1-1-3)。 在中国台湾地区,HBV 以基因型B 为主(80%左右)。 与我国福建省漳州市的流行状况一致,主要原因是中国台湾原住民主要是来自福建沿海地区。 在我国香港特别行政区流行一种HBV C1 亚型,与广东省原住民一致。HBV 基因型和基因亚型为人口迁徙提供有力证据。

HBV 基因型/亚型与临床疾病结局、预后以及对干扰素治疗的反应相关。 在中国内地和中国台湾地区,HBV B2 亚型在年轻的,尤其是未发生肝硬化的HBV 感染者中与HCC 的发生或复发相关,而HBV B1 亚型只在日本人群中存在,与急性重症肝炎相关。 在年龄较大的人群中,HBV C 相对B 型更能增加肝硬化和HCC 的发病风险。 HBV C 型是HCC 的独立危险因素。 中国台湾地区,30～75 岁期间单纯HBV 感染人群中男、女HCC 累计发病率分别为27.38%和7.99%;而非HBV 非HCV 感染人群HCC 累计发病率分别为1.55%和1.03%。 在中国台湾地区流行的HBV 基因型与大陆福建省漳州地区流行的HBV 基因型一致,基因型B 占80%;我国大陆地区HBV 整体以基因型C 为主。 HBV 基因型C 比基因型B 具有更强的致癌能力。 据此推测,我国大陆地区有超过30%的男性和10%的女性HBV慢性感染者在75 岁之前将发生HCC。

随着病情的进展,HBV 常发生变异,在免疫压力下,一些特异性HBV 突变株被选择出来,形成HCC 特征性HBV 变异,这一过程代表了HBV 的进化过程。 我们前期研究通过HBeAg 阳性ASCs 的HBV 序列分别建立了HBV B 和C 型的野生序列,并在此基础上研究HBV 基因型/亚型和对应的变异在我国大陆地区的流行现状及其与各种相关肝病的关系,揭示了持续的炎症状态、病毒浓度、HBV 基因型/亚型和HBV 变异与HCC 发生的密切关系:发现HBV 变异的种类和频率在HBV 致癌过程中逐渐累加,可预测HCC 的发生(表1-1-1)。

在慢性感染的过程中,HBV 病毒基因发生变异的几率很高,并且这些变异在不同阶段肝脏疾病中发生频率不同,提示变异与疾病发生发展相关,可以作为预测疾病结局的分子标志。 相关研究主要集中在基本核心启动子区(basal core promoter,BCP),前C 区(precore region,PC)、增强子Ⅱ(enhancer Ⅱ,EnhⅡ)以及preS 区的变异等。 目前,临床上使用核苷类药物如拉米夫定、阿德福韦酯等进行HBV 抗病毒治疗,使用这类药物进行长期治疗面临的重要问题便是HBV 的耐药性,特别是发现有患者在未使用过此类药物的情况下对其具有耐药性以及发生多重耐药现象,在临床引起极大关注,一般认为HBV 基因组P 区变异与这些耐药性的产生有关。

(一)EnhⅡ/BCP/PC 区基因变异

HBV PC/C 区基因转录、翻译的终产物为HBeAg,HBeAg 阳性表明病毒复制活跃,血清HBV DNA 含量高,增加HCC 发生的风险。 既往认为慢性乙型肝炎患者出现HBeAg 血清转换后会伴随HBV DNA 水平下降,转氨酶正常,提示HBV 复制停止,病情缓解和传染性降低。 但是近年来发现部分患者HBeAg 转阴后仍保持HBV 高水平复制,肝组织炎症继续发展,成为HBeAg 阴性慢性肝炎而引起人们的重视。 目前,大量研究表明这些患者中部分可能伴有HBV 前C 区或BCP 区变异及联合变异而造成HBeAg 表达下降或停止,但HBV 仍然能复制和传播。 慢性HBV 感染者的PC/C 区更易发生变异,最常见的是1896 位核苷酸G 到A 的变异,导致28 位密码子TGG(色氨酸)变异为终止密码子TAG,使前C 蛋白的翻译终止,从而使HBeAg 不能形成,尤其是与A1762T/G1764A 双突变的联合变异可能引起更严重的肝脏疾病。 G1896A 主要在HBeAg 阴性、抗-HBe 阳性和HBV DNA 滴度较高的活动性肝病中检出,是发生HCC 的重要因素之一。Myron J.Tong 等关于HCC 与ASCs 中BCP 和PC 区变异比较的研究发现,HCC 患者相对ASCs 具有更高的变异频率(G1896A 为77.7%与21.2%,P =0.0001)。 我们前期通过病例对照研究发现BCP 区的C1653T、T1674C/G、T1753V、C1766T/T1768A 是HCC 的独立危险因素。 因此,对HBV 感染者及时进行EnhⅡ/BCP/PC 区相关位点变异的检测,对于预测病情的转归和预后有重要临床意义。

近来,不少学者对HBV 前C 区变异与肝脏疾病临床类型的关系进行系列研究,发现该区变异易引起急性重症肝炎或使慢性肝炎活动加剧。 同时,PC 区变异在A 基因型感染者中很少发生,而在其他基因型感染者中变异频率较高,可能是因为在基因型B、D、E 及部分C 型中,nt.1858 为T,与G1896配对形成的ε 茎襻结构不稳定,易发生G-A 替代而形成T-A 配对以维持茎襻结构稳定,有利于HBV 的复制,而基因型A、F 及部分C 型的nt.1858 是C,与G1896 组成较稳定的C-G 配对,故很少发生G1896A变异。 Yuan 还报道了A1896 变异在C2 亚型较C1亚型高(P<0.002)。 因此,一般认为PC 区A1896 变异是基因型依赖的,以B、C、D 型为主。 此外,PC/C区的G1899A、C2002T、A2159G、A2189C、G2033A/T是HCC 的独立危险因素。

(二)S 基因变异

HBV 病毒S 区基因编码病毒的包膜蛋白,包括S、M 和L 三种蛋白,它们在病毒的生命周期中具有重要作用,具有附着和侵入细胞、促使病毒的装配和分泌、阻断宿主的免疫应答使感染持续等功能。 另一方面,该段基因携带与免疫应答有关的B、T 淋巴细胞表位,其中a 决定簇是提供保护性免疫的免疫源。 该区特别引人注目的变异是nt.546C→A,它可导致免疫优势表位a 决定簇aa131Thr(ACC)→Asn(AAC),另外还有nt.587G→A 变异使aa145Gly→Arg。 据报道,这些位点变异后可导致野毒株HBsAg制备的血源性或基因工程疫苗所产生的抗-HBs 对一些变异株的HBsAg 的亲和力或中和作用明显下降,从而致使乙肝疫苗阻断母婴传播和HB-sIg 预防移植肝HBV 再感染失败。 因此,在研究具有全面、均衡免疫效果的基因工程乙肝疫苗时应考虑该区基因变异。

preS 区包括preS1(nt.2848 ～ 3204)和preS2(nt.3205～154),preS1 蛋白包含肝细胞结合位点,对病毒的包装极为重要。 由于preS1 和preS2 含有T 和(或)B 细胞的抗原表位,因而在与宿主免疫反应的相互作用中发挥重要作用。 preS 最常见的变异是缺失变异,包括preS1、preS2 缺失或两者同时缺失,该变异可影响S 蛋白和M 蛋白的表达,导致细胞内L 蛋白的聚积。 最近的研究发现该变异与隐匿性HBV 感染和进展性肝脏疾病相关。 preS2 起始密码子变异株造成M 蛋白的缺失,与重型肝炎相关,可能是导致严重肝病的因素之一。 在我国江苏启东地区开展的研究发现在HCC 和CHB 中preS 缺失变异频率分别是51.1%和18.0%(P<0.01),preS2 启动子区域变异在HCC 中也更常检测到,提示该变异发生与HBV 疾病预后有关。 我们前期的病例对照研究发现preS 区的preS 缺失变异、preS2起始密码子变异、T53C、C2964A、A2962G、C3116T、C7A 是HCC 的独立危险因素,推测preS 区变异导致抗原表位发生变化而影响宿主对HBV 病毒感染的免疫反应。 但是由于preS 区位于P 基因的间隔区,所以对病毒的复制功能没有显著影响,这也是该区高发缺失变异的原因之一。

(三)X 区变异

X 基因编码含154 个氨基酸的X 蛋白,该蛋白可反式激活HBV 病毒基因,是HBV 基因组内结构和功能重叠最明显的区域。 因此,X 基因在HBV 复制、表达及致病中起关键性作用,其变异主要包括BCP 变异和X 基因羧基端的缺失变异。 目前研究BCP 变异的重点是A1762T/G1764A 双突变,该变异的出现减少了PC 区mRNA 而相应地使HBeAg水平下降,但对C 区mRNA 及病毒其他基因转录无影响。 也有报道认为A1762T/G1764A 双突变可以减少前C 区和C 区的mRNA 转录,从而使HBeAg表达受抑制,表现为HBeAg 阴性。 大量研究发现A1762T/G1764A 双突变与乙肝预后密切相关,而与HBeAg 阳性或抗-HBe 阳性状态无关。 A1762T/G1764A 双突变与HBeAg 血清转换的队列研究发现出现双突变的病例比未出现者更早出现HBeAg 血清转换(6.9 年和9.4 年,P=0.062),出现双突变与最终进展成为HCC 也有显著关联(P = 0.013)。HBeAg 消失后血清或血浆中仍有高水平HBV-DNA的患者比HBV-DNA 滴度下降的一组有更高的A1762T/G1764A 突变率(P=0.031),除这两个位点外其他变异也更多(P=0.037)。 可见,HBeAg 阴性CHB 患者虽然病毒载量较低,但一般处于疾病的较晚阶段,免疫耐受被打破,病毒复制激发病变活动,所以定期监测血清ALT 及HBV-DNA 水平,积极开展肝组织活检,可以判断HBeAg 阴性慢性乙型肝炎患者的病情,有利于制订合理的治疗方案,对延缓肝病进展有重要意义。

在中国台湾地区人群中的研究发现,LC 患者中有更高的A1762T/G1764A 双突变频率(OR =11.11,P<0.001),认为该突变与肝硬化的发生有关。 在HBV 引起的LC 中,A1762T/G1764A 双突变比例可以高达74.3%,在HCC 中的比例为55%。 检测患者血浆中HBV 的BCP 区A1762T/G1764A 双突变有助于肝癌的早期诊断。 就B 和C 基因型之间的变异比较,多数学者认为C 基因型的HBV 更容易发生BCP 区双突变,与C 基因型更容易引起严重肝病的结论一致。

X 基因羧基端的缺失变异主要是nt.1763～1770、nt.1770 ～ 1777、nt.1753 ～ 1772 和nt.1750 ～1770 等8 个、20 个、21 个核苷酸的缺失,该变异导致HBV 低水平复制,与HBsAg 阳性、HBeAg 阴性的无症状携带现象密切相关。

(四)P 区变异

P 基因区是HBV 病毒基因组中最大的一个编码区,编码病毒DNA 聚合酶(DNAP),根据基因功能,可将其活性部位在结构上分为A～E 共5 个区域,该区基因变异与临床治疗密切相关。 临床上使用拉米夫定(LAM)治疗慢性乙肝一定时间后部分病例会产生抗药性而使病情反复,原因在于其P 区发生了变异。 LAM 作用于DNAP 活性部位YMDD基序(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸),当发生基因变异时,YMDD 基序出现氨基酸替换,大多是此区的第552 个密码子即蛋氨酸被缬氨酸取代即YVDD 变异,或被异亮氨酸取代即YIDD 变异。 另外,B 区第528 个密码子亮氨酸被蛋氨酸取代即L528M 变异,常与M552V 合并出现,发生双位点突变。 YMDD 变异对宿主的危害在于影响拉米夫定的抗病毒活性,从而影响治疗效果。

服用拉米夫定4 年后耐药可以达到70%,服用阿德福韦5 年后29%产生耐药性,服用恩替卡韦1年有1%耐药,服用替比夫定2 年有9%～22%产生耐药性,这可能是由于HBV 变异体因为应答内源性免疫压力和抗体、抗病毒治疗的选择压力而出现,因而导致耐药。 最常见的是长期使用拉米夫定诱发HBV DNA 多聚酶编码基因区的点变异而耐药。YMDD 变异的检出率随拉米夫定用药时间的延长而增加,治疗1～4 年的耐药率分别为14%、38%、49%和66%。 A1762T/G1764A 双突变在LAM 治疗过程中对HBeAg 的清除有重要作用,在发生免疫清除与产生耐药或复发患者中该变异具有统计学差异。 另外,T1773、C1802、G1803 和T1846 等变异也可能与血清转换有关。 阿德福韦酯作为继拉米夫定后抗HBV 的又一种核苷类似药物,抗HBV 的耐药率低,但随治疗时间的延长耐药率不断升高,治疗 1～5年的变异率分别为0、3%、11%、8%和29%,目前发现的耐药位点主要为rtN236T 和rtA181V/T。 如果阿德福韦酯发生耐药,可导致HBV-DNA 的反弹及肝功能异常,因此对阿德福韦酯耐药的预防及耐药的处理显得尤为重要。

由于HBV 病毒基因变异产生的耐药性,现有抗病毒药物都不足以清除病毒或在大部分慢性乙型肝炎患者中达不到持续的病毒抑制作用,因此应对耐药机制进行更深入的研究及探索联合药物治疗。

三、易感性生物标志物

目前我国HBV 感染者占全球1/3,而HCC 占全球一半以上,以及世界各地华人人群中的HCC 患病率显著高于当地人群的事实,表明不同种族人群对HCC 具有不同的易感性,我国HBV 感染者发生HCC 的风险更高。 此外,一部分HBV 感染者终身不发生肝硬化、HCC 等终末性肝病,而成为终身无症状携带者或慢性感染状态,提示宿主遗传因素在HCC 的发生中扮演重要角色。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性,它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。 SNP 在人类基因组中广泛存在,平均每500～1000 个碱基对中就有1 个,估计其总数可达300 万个甚至更多。 近年来SNP 被发现和多种疾病的遗传易感性密切相关,国内外许多研究已报道了一系列和肝癌发生或乙肝病毒持续感染相关的SNP 位点。 由我国独立开展的基于广西人群的全基因组关联分析(GWAS)研究发现,位于染色体1p36.22 区域的KIF1B 基因内含子区的SNP 位点(rs17401966)和乙肝病毒感染者发生肝癌密切相关。 该研究结果也在随后的由1962 个乙肝后肝癌患者和1430 个乙肝感染者组成的大规模人群队列及159 个肝癌家系中得到了验证。 除了KIF1B 基因外,1p36.22 区域还和UBE4B 及PGD 基因紧密关联,提示我们这三个基因相关的信号通路可能在乙肝的恶性转化过程中起了至关重要的作用。GWAS 研究得出的结果固然可信,但是利用不同的SNP GWAS 平台来分析得到的疾病易感性位点却不尽相同。 在我国南方人群中开展的慢乙肝对比肝癌人群的GWAS 研究发现,染色体8p12 区域的四个SNP 位点(rs12682266, rs7821974, rs2275959,rs1573266)和慢乙肝进展为肝癌密切相关,体外功能研究提示,这一区域可能转录长链非编码RNA 来发挥致癌作用。 出现这种重复性低的现象可能是由于不同的SNP 平台包含不同的SNP 位点,也有可能是由于研究人群遗传背景的地域性差异所导致的。

在日本开展的两项SNP GWAS 研究分别发现了22 号染色体的DEPDC5 位点的内含子SNP(rs1012068)以及染色体6p21.33 上MICA 基因的5’末端SNP(rs2596542)和慢性丙肝患者发生肝癌密切相关。 且这种相关性均已在日本的大样本慢性丙肝患者和丙肝后肝癌患者队列中得到了证实。 但尚未有研究报道这些位点是否和乙肝后肝癌的发生相关或者在其他非日本人群中这种相关性是否持续存在。

微小RNA(miRNA)是一类只有22 个碱基且高度保守的非编码RNA,主要通过结合靶基因的3’末端非编码区来调节靶基因的表达。 研究表明,miRNA广泛参与体内的各种生理及病理过程,包括细胞增殖、分化、凋亡等。 近年来,miRNA 和肝癌发生的关系越来越得到重视,研究发现编码miRNA 前体基因的SNP 会影响成熟miRNA 的表达从而影响人群患肝癌的易感性。 例如miR-146a 前体的功能SNP(rs2910164)被发现在中国人群中和肝癌的发生密切相关,相对于C 等位基因来说,G 等位基因携带者具有更高的发生肝癌的风险。 体外功能研究表明该SNP 位点可以显著影响体内成熟miR-146a 的表达量,携带G 等位基因的人群比C 等位基因携带者体内拥有更多的成熟miR-146a 表达,而miR-146a可以显著刺激细胞增殖和克隆形成,具有促进癌症发生的潜在作用。

拷贝数变异(copy number variation,CNV)是指基因组中大于1kb 的DNA 片段插入、缺失和(或)扩增及其互相组合衍生出的复杂染色体结构变异。像SNP 一样,CNV 也可影响基因的表达、表型的变异和适应,因此也是一种重要的疾病易感变异,能引起疾病或增加复杂疾病的发病风险。 国外一项研究利用高密度Affymetrix SNP6.0 芯片平台探索了亚洲人群全基因组CNV 和肝癌、肝硬化的关系,结果发现位于T 细胞受体的γ 和　α 位点的CNV 和肝癌的发生密切相关。 这一变异起源于体细胞变异,体现了肝癌患者和健康人群在T 淋巴细胞受体处理过程中的不同,而这种不同和病毒感染是没有关系的。 结构变异分析发现了3 个易感性位点,其中包含了负责抗原递呈和免疫监视的MHC Ⅱ类分子,生物网络分析也进一步证实了抗原递呈及处理通路和肝癌的发生显著相关。 相对于SNP 来说,CNV 作为全基因组关联分析遗传标志时具有自己的优势,即由致病性CNV 引起的基因剂量改变足以改变表型,故基于CNV 的GWAS 研究更容易鉴定到致病突变,而单一位点的SNP 等位基因无法有效地将受累个体和健康对照区分开来。 因此在进行全基因组关联分析时,应当尽可能结合SNP 和CNV 基因分型结果,两者具有一定的互补性。