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第三节 实验动物神经行为学检查手段
创伤后应激障碍模型建立以后,需要对其行为学进行检测以确定模型的正确性。由于心理应激能够引起动物的生活习性改变、警觉水平过高、狂躁或抑郁性表现、免疫及耐受力下降、学习和记忆力受损、逃避行为欠缺等多种行为或生理性改变,因此观测方向为创伤后应激障碍动物模型的情感行为学、空间学习记忆力、焦虑或抑郁状态等。由于不同的观测环境条件,可能对动物模型的反应有影响,因此对模型检测通常在专门的环境下进行,室温恒定,保持通风与安静,阻断室外光线,室内通过人造光源获得照度恒定的漫反射光源,避免检测设备仪器被直接照射。实验中闲杂人等尽量少出现,实验员与设备保持距离,避免出现在大鼠视野,整个过程通过红外摄像机记录大鼠活动。针对不同的方面需进行不同行为学测试,主要有以下几类:
一、反映动物抗争行为或绝望情绪的行为实验
此类行为实验包括僵立行为检查、拒俘反应、强迫性游泳实验(Forced Swimming)、尾悬挂实验(Tail Suspension)、获得性无助实验(Learned Helplessness)等。
(一)僵立行为检查
1.制备方法
将经电击训练过的大鼠放入反射箱,适应3分钟允许自由探索。然后,只予以声音刺激而无电击,其他条件同模型制作时,观察3分钟内大鼠僵立时间,僵立时间之和占总时间的百分比即为僵立时间百分比。
2.模型特点
僵立行为是一种普遍见于啮齿类的防御行为,表现为刻板式的蹲伏姿势,可以有一定程度的摇摆,大鼠外观除呼吸运动以外其余的肌肉运动均消失,同时表现出全身情绪唤起的其他表现,如全身毛发竖立、背部拱起,是大鼠恐惧表达的行为方式。创伤后应激障碍模型通常重新置入电击箱中呈明显僵立行为,在不同的时间点僵立时间百分比均明显高于对照组。本检测可充分反映出创伤后应激障碍动物模型当暴露于与应激原类似场景时,再度体验到痛苦,警觉性明显增高的心理特征。
(二)拒俘反应
1.制备方法
在特定的时间对大鼠的活动性、精神状态进行观察,并通过对实验动物以从未接触过的手套抓捕,根据其反应而对拒俘反射进行评分。评分标准为:0即温顺,易抓捕;1即尖叫或躲避;2即尖叫并躲避;3即逃脱;4即尖叫与逃脱;5即试图撕咬手套;6即主动跳起攻击。所得分数可用于评价动物恐惧与冲突素质特征的改变。
2.模型特点
最为基础的行为观察方法,创伤后应激障碍模型大鼠表现出情绪不稳,容易激怒,过度警觉等情绪特征,得分通常高于对照组。
(三)强迫性游泳实验
1.制备方法
可分别以大鼠或小鼠进行实验,原理类似。
(1)大鼠强迫性游泳实验:
将体重180~220g的雄性SD大鼠单个的放入垂直放置的有机玻璃圆筒中(高40cm、直径18cm,水深15cm,水温25℃)强迫游泳。预试15分钟后在30℃室温下烤干,放回笼中。24小时后将大鼠再放入圆筒中实验,测定各大鼠在5分钟内保持漂浮不动的时间。
(2)小鼠强迫性游泳实验:
将小鼠放置于水深10cm的玻璃器皿(高20cm,直径14cm)中,水温保持25℃。观察6分钟,统计小鼠在后4分钟内的累积不动时间。
2.模型特点
动物最初在水中拼命游动、挣扎、试图逃脱,随之感到逃脱是不可能的,便不再挣扎的游动,仅将头部露出水面,肢体漂浮,维持一种不动状态,将此状态称为“行为绝望”。动物不动行为的判定标准为大鼠或小鼠微卷躯体,但保持垂直姿势,鼻孔露出水面。模型组动物保持漂浮不动的时间长于对照组。张中启研究认为国内昆明种小鼠和Wistar大鼠适合作为这种模型的动物,但此模型能否成为研究抑郁症的有价值动物模型,也有争议。有人认为动物强迫游泳表现的不动状态,可能是对应激反应的一种适应,或者是一种疲劳现象,并非是绝望行为。
(四)尾悬挂实验
1.制备方法
将小鼠尾端2cm的部位贴在一根水平木棍上,使动物成倒挂状态,其头部离台面约5cm,用板隔开相邻动物的视线,观察小鼠在6分钟内累积不动的时间,如图8-2。
图8-2 尾悬挂实验
将小鼠倒挂于水平木棍上,检测动物的抑郁情况
2.模型特点
Steru等1985年建立的一种行为学检测方法,通过小鼠的“绝望行为”,主要检测模型动物的抑郁情况。创伤后应激障碍模型组的不动时间长于对照组。
(五)获得性无助实验
1.制备方法
使用60cm×21cm×30cm的穿梭箱,由铜管构成其底面,管间隔1cm,穿梭箱被1块带有7cm×7cm小门的接骨板隔成2个相同的箱子,将大鼠单只放入穿梭箱的一端适应环境5分钟,然后进行30次回避训练,训练间隔30秒。每次训练的最初3秒出现一个光信号,允许大鼠在此期间到达另一端的箱内回避电击;如果此期间无回避行为发生,则光信号继续持续3秒,同时给予3秒0.8mA的足底电击;若仍无逃避行为发生,则电击和光信号立即停止,并记作1次逃避失败。在第3、4、5天上午均进行1次回避训练,记录每只大鼠的逃避失败次数。
2.模型特点
第5天记录逃避失败次数高于20次的大鼠为获得性无助大鼠,逃避失败次数低于8次为非获得性无助大鼠,逃避失败次数8~20次的大鼠淘汰。创伤后应激障碍模型组超过50%的大鼠表现为习得性无助,有抑郁表现,较对照组的逃避失败次数明显增加。
二、反映动物探究行为及情绪反应的实验
主要包括旷场实验(Open Field)、高架十字迷宫实验(Elevated Maze)及新颖物体实验(Novel Object)等。旷场实验主要反映动物的主动行为、探究行为以及抑郁或警觉等情绪反应。高架十字迷宫使动物同时产生了探究的冲动与恐惧,造成了“探究-回避”的冲突行为,能较好地反映动物的焦虑情绪。新颖物体实验主要反映了动物对外界事物的好奇行为以及对周围环境变化的敏感性。
(一)旷场实验
1.制备方法
(1)Stefanski法:
实验设备为1只直径80cm、高30cm的圆形敞箱,敞箱底部中央有直径分别为35cm和50cm的内、外两个圆圈,内圈所包含的区域为中央区。实验在弱光照明,65dB白噪声条件下进行。将大鼠放置于中央区,观察10分钟内大鼠的活动总次数,进入旷场中央的次数和在旷场中央区停留的时间。每次实验完成后,在进行下一只检测前将大鼠移除,并用酒精擦拭旷场,清除粪便、尿液乃至气味的影响,如图8-3。
图8-3 Stefanski法
圆形敞箱内有内外两个同心圆圈,内圈为中央区。将大鼠放入中央区观察其活动总次数、进入中央区的次数和在中央区的停留时间。进行下一次检测之前需要用酒精彻底清洁旷场
(2)旷场饮水实验:
实验设备为一只36cm×36cm×36cm的透明有机玻璃方箱,顶部敞开,箱的左侧、右侧、后侧和底部均为黑色,前侧面无色透明以便观察。箱中央倒置悬挂1个水瓶,瓶嘴离地面10cm,箱上方距离地面60cm处安置一盏25W的白炽灯。实验前3天大鼠限制饮水,每天仅15点~16点给予饮水1小时,同时需每天抚摸大鼠1分钟以减少非特异性应激对实验的影响。实验时将大鼠置于旷场中央,观察大鼠开始饮水的潜伏期、饮水时间、靠近水瓶的次数和站立次数等指标,观察持续时间为10分钟,如图8-4。每只大鼠实验后,均需要彻底清洁实验箱,避免嗅觉暗示影响下一只实验鼠。
图8-4 旷场饮水实验
实验箱的左、右、后侧和底部均为黑色,顶部25W灯光照明,箱中央倒置一水瓶。将限制饮水的大鼠放入实验箱中观察其饮水潜伏期、饮水时间、靠近水瓶的次数和站立次数等指标
2.模型特点
动物进入敞箱后,由于对新鲜环境具有恐惧心理,因此主要在旷场的周边区域活动。但动物的探索特性又促进其产生在中央区域运动、饮水等活动的动机,因此形成冲突状态。处于焦虑状态的大鼠在不改变活动计数的剂量下明显增加进入敞箱中央区域的次数以及在中央区域的逗留时间,或增加在中央区域饮水的时间。旷场实验设备简单,操作容易,在行为学研究中普遍适用,用以评价动物的活动特性等综合行为。
(二)高架十字迷宫实验
1.制备方法
实验装置由两条50cm×10cm的相对开放臂和两条50cm×10cm×40cm的相对闭合臂及10cm×10cm中央区连接而成,距离地面50cm,闭合臂由40cm高涂黑木板围成。测量时室内暗光,将大鼠置于高架十字迷宫的中央区域,并让其头部正对其中一个开放臂,释放后观察记录以下指标:①进入开放臂的次数(OE):进入到任一开放臂中,以4爪均进入臂内为准,中途任一爪从臂中完全退出即为该次进入活动结束。②进入开放臂的时间(OT):从进入到退出开放臂,在臂中持续的总时间。③进入封闭臂的次数(CE):进入到任一封闭臂中,以4爪均进入臂内为准,中途任一爪从臂中完全退出即为该次进入活动结束。④进入封闭臂的时间(CT):从进入到退出封闭臂,在臂中持续的总时间。如图8-5。根据各项指标分别计算出:代表大鼠的活动性的进入开放与封闭臂的总次数(OE+CE),进入OE的比例和进入OT的比例。实验中每只大鼠仅能检测1次,每次5分钟。每次实验完成后,在进行下一只检测前将大鼠移除,并用酒精擦拭旷场,清除粪便、尿液乃至气味的影响。
图8-5 高架十字迷宫
实验装置由两条相对开放臂和两条相对闭合臂及中央区组成,外观呈十字型。将大鼠放在中央区域,使其面对某条相对开放臂,观测大鼠的运动情况
2.模型特征
高架十字迷宫利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。高架十字迷宫具有一对开臂和一对闭臂,大鼠由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动,但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动,在面对新奇刺激时,动物同时产生探究的冲动与恐惧,这就造成了探究与回避的冲突行为,从而产生焦虑心理。焦虑状态的大鼠明显缩短进入开臂的次数与时间。高架十字迷宫被广泛应用于新药开发筛选评价、药理学、毒理学、预防医学、神经生物学、动物心理学及行为生物学等多个学科的科学研究和计算机辅助教学等领域,是开展行为学研究尤其是焦虑抑郁研究的经典实验。
(三)蔗糖偏爱性试验
1.制备方法
首先将大鼠在安静的房间内单笼喂养,每笼同时放置2个水瓶。第0~24小时,两瓶均装有1%蔗糖水;第24~48小时,一个瓶装1%蔗糖水,一个瓶装纯水。适应过后,对大鼠进行23小时的禁食禁水,然后进行糖水消耗实验。给予每只大鼠事先定量好的两瓶水:一瓶1%蔗糖水,一瓶纯水。60分钟后,取走两瓶并称重。计算动物的总液体消耗量、糖水消耗量、纯水消耗量、糖水偏爱(糖水偏爱=糖水消耗量/总液体消耗量)和均衡体质量因素后的比例(均衡体质量后比例=糖水消耗量体/质量)。
2.模型特点
糖水能带给实验大鼠愉悦特征。焦虑状态的大鼠糖水消耗率明显降低。可作为模型动物情绪状况的检测实验。
(四)明暗箱穿梭实验
1.制备方法
明暗箱穿梭实验可分别采用大鼠和小鼠进行实验,其原理相似。
(1)大鼠明暗箱穿梭实验:
实验设备为45cm×27cm×27cm的明暗箱,分为明箱和暗箱2个部分。暗箱占总体积1/3,顶部有盖;明箱占2/3,顶部敞开,亮光照明。两箱之间的隔板底部有一个7.5cm×7.5cm的洞供大鼠通过。明暗箱与动物活动计数仪相连,可同时记录大鼠的运动活性。将大鼠放置于明箱中央,背对洞口,记录10分钟内动物穿箱次数以及分别在明箱和暗箱中的停留时间,如图8-6。
图8-6 大鼠明暗箱穿梭实验
实验设备分为明箱和暗箱,中间隔板底部留一孔供大鼠穿梭。将大鼠放于明箱观察其穿梭次数和在明箱与暗箱中分别逗留的时间
(2)小鼠明暗箱穿梭实验:
在一只40cm×40cm×12cm的有机玻璃箱中央安装1个20cm×20cm×12cm的透明有机玻璃小敞箱,在敞箱的2个对角分别连有1个10cm×10cm×12cm的暗箱,暗箱的两侧各连有一个L形的跑道,暗箱与L形跑道有1个3.5cm×3.5cm的洞口相通。装置上方装有摄像系统并连接视频分析系统。实验时将小鼠背对暗箱洞口放置,记录10分钟内观察到的小鼠的穿箱次数和在明箱中的滞留时间。
2.模型特点
此实验根据大鼠或小鼠喜欢在暗箱中活动,但动物的探究天性又促使其试图探索明箱而设计的。但明箱中的光亮刺激可抑制动物在明箱中的探索活动。焦虑状态的小鼠在暗箱中的站立、滞留时间和运动活性增加,穿箱次数增加,在明箱中的对应指标较少,穿箱次数减少。此模型简单易行,对动物施加无痛性刺激,但所需时间漫长,另外由于动物上午和下午的活动性差异较大,需要在下午进行此实验。
(五)小鼠爬梯实验
1.制备方法
选择体重18~22g的雄性小鼠。实验装置为1个有机玻璃箱,长45cm、宽10cm、一端高12.5cm、另一端高25cm,箱内有5级宽10cm、高2.5cm的楼梯。实验时将小鼠置于箱的底部,使其背对楼梯,记录3分钟内小鼠的站立次数和爬梯数(以四肢都爬上楼梯为准)。实验环境保持安静,光线恒定。
2.模型特点
此方法简单易行,结果可靠,可大规模观察。为了简化观察,不需考虑动物上楼梯的级数。每只动物实验后需清洁实验箱,以排除嗅觉暗示对下一只动物的干扰。爬梯实验主要用于探讨动物探索性行为或活动性,动物的爬梯行为作为评价动物探索行为或活动性的指标,而直立则作为动物焦虑状态的参数。因此可同时评价焦虑状态的动物的两种状态。
(六)小鼠四板实验
1.制备方法
选择体重18~22g的雄性大鼠。实验设备为1只25cm×18cm×16cm的长方形箱,箱的底部有4块8cm×11cm的相同金属板,各块板之间均有4mm宽的间隙,它们均与电刺激器相连,处于对角线的2块板同电极。当小鼠每次跨越上下或左右金属板时受到1次电击,电流强度为0.2~0.8mA。将小鼠置于板上,让其探究15秒后打开电刺激器。当小鼠受到电刺激时产生明显的逃避反应,通常穿过2~3块板才会停下,如此记为1次。记录10分钟内每分钟的电击数。如图8-7。
图8-7 四板实验
实验箱底部有四块彼此间隔4mm的金属板,与电刺激器相连接,对角线的两块金属板电极相同。将小鼠放于板上观测其逃避反应,记录每分钟的被电击数
2.模型特点
四板法以被动回避为基础,小鼠渴望探究,但又因害怕足底电击而使探究活动受到限制。非焦虑状态的小鼠受到电击的次数明显更多。此方法操作简单,不需要训练动物,因此可广泛使用。
(七)新颖寻求行为实验
1.制备方法
前2天大鼠进行适应,其中第1天动物旷场活动量的测定也同时作为大鼠对该环境的适应过程。大鼠第1天和第2天在测定装置中各停留、适应15分钟,两天共30分钟。第3~4天,连续2天测量大鼠的新颖寻求行为。测试时提前在旷场中心置入7cm×7cm×7cm的新颖物体,第3天和第4天的新颖物体分别为橡胶块与铁笼。考虑到大鼠避光趋暗和在旷场中避免停留在旷场中心的生物本性,依据大鼠平均身长,设定以旷场中心为圆心,10cm为半径的区域为“新颖寻求区域’,记录动物在新颖寻求区域停留的时间,作为新颖寻求行为的量化指标,测试时间共15分钟,测定时给予白噪声掩蔽。根据大鼠在15分钟新颖寻求测试中停留在新颖寻求区域的时间,运动轨迹和新颖寻求行为进行分析。
2.模型特点
此实验根据大鼠喜欢在暗处活动,但其探究天性又促使其试图探索新颖事物而设计的。焦虑状态的小鼠在新颖寻求区域的滞留时间明显缩短。此模型简单易行,对动物施加无痛性刺激,另外由于动物上午和下午的活动性差异较大,需要在下午进行此实验。
三、评价动物记忆力和学习能力的实验
有较多的研究资料证实,应激因素作用于机体时,通过多种通路引起神经递质、信号转导以及突触可塑性等方面的改变,从而显著影响了机体的学习和记忆能力,因此,对记忆力和学习能力的评估也是评价心理应激水平的重要方法。目前常用的有跳台法(Step Down)、Morris水迷宫(Morris water maze)、辐射状水迷宫(radial armmaze)等。
(一)跳台法
1.制备方法
实验装置为一长方形黑色塑料板制成的反射箱,分割为5个小间,每个小间的大小为12cm×12cm×20cm(实验动物为小鼠)或23cm×25cm×40cm(实验动物为大鼠)。反射箱底面铺以铜栅,间距为1cm,可以通电,电压强度由一变压器控制。每间内有1个可自由移动的橡胶平台,高4.5cm、直径4.5cm(实验动物为小鼠)或高为5cm,直径为8cm(实验动物为大鼠)。一般平台置于左后角或者右后角,如图8-8。将动物放入反应箱内适应环境3分钟,然后立即通以36V交流电。动物受到电击,其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击后又迅速跳回平台。如此训练5分钟,并记录每只动物受到电击的次数亦称错误次数,以此作为学习成绩。24小时后重做测验,此即记忆保持测验,将动物放在平台上,然后予以通电,记录受到电击的动物数,动物第一次跳下平台的潜伏期和5分钟内在铜栅上所呆的累积错误总次数。
图8-8 跳台法
将黑色的反射箱分成五个小间,每个小间内均为铜栅底面,可接通电源。每一小间左后角和右后角有一橡皮平台可供小鼠或大鼠躲避电击。通过电击训练后,观察大鼠或小鼠第一次跳下橡皮台的时间和在铜栅上所呆的累积错误总次数
2.模型特点
跳台模型属于回避性条件反射实验,本法简单易行,一次可同时测试多只动物,既可观察影响因素对记忆过程的影响,也可观察对学习的影响,敏感性较高。不足之处在动物的回避性反应差异较大,需对动物提前进行预选以减少差异性。
(二)避暗法
1.制备方法
此法是利用鼠类的嗜暗习性而设计的,常用动物为小鼠。实验设备包括明、暗两室。明室大小为11cm×3.2cm,其上方约20cm处有1盏白炽灯照明;暗室大小为17cm×3.2cm,两室之间隔板底部有1个直径为3cm的圆洞。两室底部均为铜栅,暗室的铜栅可以通电,电压强度由一变压器调控,通常采用40V电压。暗箱与一计时、计数器相连,可自动记录动物由明室进入暗室的潜伏期和进入暗室的次数。实验时将小鼠背朝洞口放入明室,同时启动计时、计数器,动物穿过洞口进入暗室即受到电击,此时间为动物首次进入暗室遭到电击所需时间,即潜伏期;取出动物,24小时后再次测试,记录动物进入暗室的潜伏期,5分钟内的电击次数和受电击的动物数。
2.模型特点
本模型属于回避性条件反射实验。方法简便易行,以潜伏期为指标,准确度较高,对记忆过程特别是记忆再现有较高的敏感性。
(三)Morris水迷宫实验
1.制备方法
设计特制的水迷宫主要由一圆柱形水池和一可移动位置的站台组成。水池高70cm,直径80cm,站台直径8cm,水池上空通过一个数字摄像机与计算机相连接。预先在水池中注入清水,水深15cm,加入炭素墨水使池水变为不透明的黑色,站台表面为黑色,使小鼠不能看到,水面高出站台表面0.5cm。水温控制在22℃±0.5℃,在水池上标定相同一点作为每次实验小鼠的入水点。站台置于离入水点较远的象限中间,实验过程保持站台位置不变,如图8-9。
图8-9 Morris水迷宫
圆柱形水池中有一站台,上方用摄像机观测小鼠在水迷宫的运动情况
(1)定位航行训练:
实验前1天无平台,让大鼠自由游泳5分钟适应环境,不需要记录。正式实验开始时将平台固定在水面下1.5cm处,实验室中的人员和设备保持固定不变,以作为大鼠空间记忆的参照物。将大鼠面朝池壁轻轻放入水中,入水点位于非平台区域的随机位点。检测时间为60秒,让大鼠找到并爬上水中的隐藏平台。将大鼠自入水到找到平台并四肢爬上平台所花的时间作为逃避潜伏期,并让其在平台上停留30秒。如果入水后在限定时间内为能找到并爬上平台,则记录总时间为60秒,同时人为将大鼠放置于平台30秒,然后取出让其休息30秒,再进行下一轮实验。每天每只大鼠进行4次实验,连续进行4天。通过试验评价大鼠空间记忆的获得能力。在实验中,可将每天第一次实验的轨迹进行组间对比,以避免短时记忆的影响。
(2)空间探索实验:
定位航行实验结束24小时后,拆除平台后选择随机位点将大鼠放入水中,正常动物会在原平台位置不断寻找,记录大鼠60秒内穿过原平台所在位点的次数,在原平台区域的游程及时间占总游程和总时间的比率,以此评价小鼠的空间记忆能力。
2.模型特点
Morris水迷宫通过观察记录动物入水后搜索目标所需时间、采用的策略和它们的运动轨迹,有助于分析和推断动物的学习、记忆、空间定向以及认知功能等能力,现在较为广泛采用。
影响实验结果的因素很多,其中以实验环境比较重要。由于动物往往会利用实验室内固定的环境作为搜索目标时的参照物,因此实验室的设备仪器、工作台、门窗等陈设的位置和实验操作者所站位置在整个实验中都需要固定,避免影响实验结果。另外由于Morris水迷宫的水容量大,所以动物的排泄物和分泌的外激素不会影响其他动物的成绩,优于其他的动物行为实验方法。此方法操作简便,准确可靠,适用于各种因素引起的记忆障碍模型,使得模型动物潜伏期延长,撤台实验时穿过原平台位置的次数明显减少,并伴有定向障碍和运动轨迹混乱。
(四)辐射状水迷宫
1.制备方法
经典的Morris水迷宫的逃生平台位置在整个实验过程中固定不变,这使得海马工作记忆加工过程得以简化,所以对聪明小鼠的轻度学习记忆能力损害的检测就显得不灵敏。Arendash等首次使用了六臂辐射状水迷宫,即由六臂辐射状旱迷宫衍生的水版本,对转基因鼠的空间学习记忆能力进行研究。该程序主要利用赢则停策略,即一旦小鼠发现逃生平台,则可停留在平台上,实验即结束。
2.模型特点
水是啮齿类动物非常厌恶的刺激或环境。鼠在水池中就会急于寻找逃路。它们的习性为在水池四周寻找出口逃避,但深而光滑的垂直池壁阻碍了这种企图。实验中设置的水下平台可提供鼠栖身的场所。但在巨大的水面上,强迫游泳的动物不能看见平台。它们若要快速找到平台而避免淹没就必须利用环境中的线索进行定位。从而检测了小鼠记住环境中的线索及其与平台位置关系而对平台进行定位的能力,可反映小鼠的空间学习和记忆能力。
此模型的优点在于①对检测轻度学习记忆能力下降的敏感性比Morris迷宫强。这主要是因为六臂辐射状水迷宫中采用了在一天的实验中平台位置恒定不变,而在每天的实验中改变平台位置来观察动物的工作记忆。因此小鼠在实验中必须掌握这个规律来解决问题。②既可判断参考记忆,又可判断工作记忆。③避免了在Morris水迷宫中的趋触性行为,即靠池边游泳的倾向。④避免了实验动物需被剥夺食物和水的不足。⑤避免了气味对动物行为的影响。⑥避免了在Morris水迷宫中那样游泳能力对成绩产生的显著影响。⑦避免了电击。⑧不需复杂的装备,容易开展工作。
但它也有不足:①年老体弱鼠有时较难完成任务。②个体间的成绩差异巨大。③可能不是所有鼠株都能完成任务。④也受视觉障碍的限制。⑤实验过程中需同时观察记录大量复杂的数据。
(五)Y迷宫实验
1.制备方法
实验设备由PVC板制作,内、外壁贴黑色胶纸。共3个臂,各个臂之间夹角120°,每一臂尺寸30cm×8cm×15cm,在中央处各有一个可移动的隔板,在迷宫各个臂内贴上不同几何图形,作为视觉标记。Y迷宫的3个臂被随机设为:新异臂(novel arm)、起始臂(start arm)和其他臂(other arm)。其中新异臂在实验的第1个阶段即训练期时用隔板挡住,在第2个阶段即测试期时打开;起始臂为小鼠进入迷宫时所在的臂。整个实验过程中起始臂和其他臂都是一直打开,动物可以自由出入。迷宫内铺垫木屑,每次训练或测试结束后,混匀各个臂里的锯末,以防动物残留气味干扰。迷宫上方1.5m处安置摄像镜头,全过程录像。Y迷宫实验包含两个阶段,间隔1小时。第一个阶段为训练期,新异臂被隔板挡住,小鼠由起始臂放入,在起始臂和其他臂中自由活动10分钟,训练结束后,小鼠被放回饲养笼。1小时后进行第2个阶段实验。第2个阶段为检测期,抽开新异臂隔板,小鼠由起始臂放入,在3个臂中自由活动5分钟。录像记录5分钟内每只小鼠在各个臂停留的时间和穿梭次数。在某些实验中还可通过食物诱惑或者电击胁迫增强小鼠的活动性。实验中,随机安排不同动物对应的Y迷宫的起始臂、新异臂和其他臂,但对于同一只小鼠,在迷宫实验的两个阶段,三个臂是固定的。由于小鼠对该迷宫测试的记忆时间最长不超过数小时,所以该迷宫测试可以在同一只小鼠上反复进行,但两次实验需间隔至少1周,并改变三个臂的搭配。
2.模型特点
Y迷宫主要应用于动物的辨别性学习,工作记忆及参考记忆的测试。根据分析动物进入各臂的次数、时间、路线等参数可以反映出实验动物的空间记忆能力。相对而言,Y迷宫简便、可行,有一定的实用性,现常用于学习记忆功能评价。Y迷宫这类迷宫任务能够检测小鼠的海马和前额叶脑区相关的空间参考记忆和空间工作记忆。通过Y迷宫研究小鼠的空间识别记忆能力,相对于被动回避等实验,其优势在于这种迷宫利用了啮齿类动物对新异环境天然探究的自然习性,不需要动物学习任何规则来趋利避害,能够有效地反映出动物对新异环境的识别记忆能力。
(六)T迷宫实验
1.制备方法
实验设备由2根46cm×10cm×10cm的选择臂(goal arms)和一个与之垂直的71cm×10cm×10cm的起始臂(approach alley)组成。起始臂内置1个16cm×16cm的起始箱,并有闸门与起始臂的另一部分相联。选择臂的末端各有1个食物杯,用来放食物为增加小鼠寻觅食物的动力,在测试前3天对小鼠食量进行限制,禁食6小时,使其体重下降至正常获取食物时的80%~90%。实验前2天,抚摸小鼠并将其放入T迷宫适应10分钟,在迷宫两臂碗里放入食物,待小鼠取食完毕后将其取出。实验在安静的房间内进行,环境条件保持稳定。在测试时,第一步先将迷宫的一个臂挡住,只允许动物到达T迷宫的另一个臂,在此动物得到食物,取食完毕,立即取出,用酒精清洗去除气味;在第二步,将T迷宫的两臂都开放,但只有原来被挡住的臂内有食物,小鼠只有选择进入与第一步方向相反的臂才能得到食物,记为1次正确,如小鼠重新进入第一步实验时去过的臂记作1次错误。如此两步为一组,两步实验间隔15秒。每只小鼠每天进行10或15组实验,记录其正确选择次数,共测3天。
2.模型特点
最初人们证明大鼠能辨别T迷宫两臂颜色的变化,他们发现,将雄性大鼠置于T迷宫的起始臂15~30分钟,让其能看见、但不能进入黑白两臂。然后,改变其中一个臂的颜色,使两臂同为黑色或白色。让大鼠自由选择,结果显示,大鼠总是选择改变了颜色的那个臂(新异臂)。这一过程要依靠动物的记忆来完成。由此发展而成的T迷宫实验成为目前用于评价空间记忆的最常用的动物模型之一。现在的T迷宫使用的是食物而不是臂的颜色作为动物探究的动力。通常用这一模型来研究动物的空间工作记忆(spatial working memory),即测定动物只在当前操作期间有用的信息。经改进后的T形迷宫也可用来评价参考记忆(reference memory),即记录在这一实验中任何一天、任何一次的测试都有用的信息。
大鼠和小鼠具有良好的空间辨别功能,能很快学会并准确操作迷宫。因此,T迷宫被广泛用于测试动物的空间记忆能力。①T迷宫用于研究不同脑区对空间记忆的影响。它对某些脑结构,尤其是海马的毁损作用敏感。此外,许多药物或毒素都可增强或削弱动物在T迷宫的空间记忆。实验所用的动物除大鼠和小鼠外,还包括猪、羊、乌龟和鸽子等。②动物选择的准确性与两次选择之间的间隔及每一训练间期内的选择训练次数等有关。正常动物经短时间的间隔,其选择准确性非常高。而经过极长时间的间隔,例如超过1小时,其选择接近随机性操作。强迫选择训练后。如只给一次目标臂选择,准确性通常很高。但是,如给予多次选择,则选择次数越多,准确性越差。③啮齿类动物有单向偏爱的特性。这种单向偏爱与动物种属和品系有关。例如,C57BL/6J小鼠、ICR小鼠和Purdue-Wistar大鼠更偏爱左侧,而Spague-Dawley大鼠和Wistar大鼠更偏爱右侧。研究表明,超过2/3的雄性Spague-Dawley大鼠偏爱右侧,而偏爱左侧的不到1/5。这种单向偏爱可影响对动物学习记忆的评价。④起始臂的闸门是T迷宫的重要特征。它既可用于在两次选择之间将动物限制在起始箱内一定的时间,也可防止动物在两次选择训练之间探究迷宫。因此,两次选择训练之间应将动物迅速放回起始臂内的起始箱。⑤当动物对迷宫或实验者的应激恐惧超过其对探究和觅食的渴望程度时,动物对迷宫的探究减少,甚至待在迷宫某处不动而不去探究迷宫。这种恐惧表现为动物在迷宫内排便和排尿;当抓它时,动物还会发出尖叫声。因此,足够的应激适应是必要的。
此外,还有其他的行为学测试方式,例如①负重游泳:在小鼠尾部负荷3g铁丝,将其放入28℃水中。观察小鼠从游泳至沉入水中3秒未浮出的时间为潜伏期。②爬杆:在15cm×5cm×40cm反射箱内,安置木杆和电栅底板,动物在电栅底板受到电击一定时间内爬杆为逃避反应,给予条件刺激未受到电击前即行爬杆为主动回避反应。训练一天后测试,如图8-10。③群居模型敝箱:将相互不熟悉大鼠放入敝箱,以其彼此间嗅,爬上或下钻,理毛,性探究,跟随或围绕转等正常的群居接触行为减少作为评价焦虑指标。这些实验在其设计思路与上述各方法基本类似。
图8-10 爬杆实验
反射箱内安置木杆和电栅底板,动物在受到电击后爬杆为逃避反应,测试给予条件刺激未受到电击前即行爬杆的主动回避反应