第三节　中药毒理学研究

中药毒理学研究主要包括急性毒性、长期毒性、一般药理、三致、局部毒性、免疫毒性、依赖性等毒理学实验，毒作用机制研究和毒性评价分析与管理。

一、毒理学实验

中药毒理学实验主要包括急性毒性、长期毒性、局部毒性、一般药理、特殊毒性等实验内容。

1.急性毒性实验　中药急性毒性实验是指在不同的给药途径条件下，1次或24小时内多次给予动物受试药物（包括中药、复方、中药或复方的提取物、中成药）后，短期（最长到14天）内观察受试药物所产生的毒性反应及动物死亡状况。其目的主要是初步估计受试药物毒性大小，提供有关药物可能的毒性靶器官及可能死亡原因的信息，提示在后续试验中需要重点观察的指标信息，为长期毒性实验剂量设计提供重要的参考依据，为临床用药的安全及监测提供依据，减少实验中的风险等。

中药急性毒性实验方法常用的主要包括LD50法、最大耐受量法和最大给药量法。LD50法适合于毒性大的中药，是反映有毒中药半数动物死亡的剂量，是标志动物急性毒性反应程度的重要指标。最大耐受量法适合于无法测出LD50值的中药的安全性评估，通常采用一次或一日内多次给予动物受试物，观察动物是否出现中毒症状及其他病理变化，但应注意，应用该法若动物未出现毒性，则仅说明在该条件下未能测出LD50，不代表受试物无任何毒性。最大给药量法适用于因中药药物浓度或给药体积限制而无法测出LD50或最大耐受量的中药急性毒性研究方法。如鼻腔喷雾剂、阴道洗剂、膏药、贴剂等，值得注意的是，应用该法未测出毒性仅说明在此给药体积、给药浓度及给药途径下，受试药物对某种动物无明显毒性，但不代表受试物无毒。

2.长期毒性实验　中药长期毒性实验是指在不同的给药途径条件下，长期、反复给予受试中药、复方、中药或复方的提取物、中成药后，长期观察实验动物所表现的毒性特征。中药长期毒性实验的主要目的包括五个方面：①预测受试物可能引起的临床不良反应（包括不良反应的性质、程度、剂量-反应和时间-反应关系、可逆性等）；②推测受试物重复给药的临床毒性靶器官或靶组织，为临床安全用药的剂量设置提供参考依据；③预测临床实验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围；④提示临床实验中需重点监测的生理生化指标；⑤为临床实验中的解毒或解救措施提供参考信息。

中药长期毒性研究动物实验方法主要有口服给药长期毒性实验、注射给药长期毒性实验和皮肤外用药长期毒性实验。其中，口服给药长期毒性实验适合于丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、酒剂、口服液等剂型；注射给药长期毒性实验适合于混悬注射剂和提纯成分的澄明注射剂，给药方式主要有肌肉、腹腔、静脉、皮下注射；皮肤外用药长期毒性实验主要适合于针对临床皮肤或骨科疾患的膏药、涂膜剂，也有散剂等剂型。

中药长期毒性实验一般需采用两种动物进行，即啮齿类（常用大鼠）和非啮齿类（常用Beagle犬或猴）；皮肤外用药的长期毒性实验常用家兔和豚鼠，特别需要也可用猴。受试药物应选用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品。剂量设计，高剂量应使动物出现明显毒性或严重的毒性反应或个别动物出现死亡，中剂量应使动物出现轻微的或中等程度的毒性反应且其剂量在高、低剂量之间并与二者成倍数关系，低剂量应高于药效学试验的最佳有效剂量且动物不出现毒性反应；一般情况下至少应设3个剂量组和溶媒或赋形剂对照组，必要时还需设立空白对照组和/或阳性对照组。受试物的给药途径一般要求与临床拟用途径一致，当临床给药途径在动物身上难以达到或根本无法达到时可允许用别的给药途径，但应与临床的给药途径尽量接近并充分保证受试物给药剂量的准确性和药物的稳定性。给药周期应是临床疗程的3倍，恢复期观察时间的长短应视实验的具体情况而定，若实验中某些检查指标出现异常，可将恢复期相应延长。恢复期观察的目的是了解被试药物致动物毒性反应的可逆程度，发现可能出现的迟发性反应。

需要注意的是，长期毒性动物实验指标若没有统计学意义，不等于没有生理学意义，有统计学意义不等于有生物学意义；还应注意长期毒性实验结果的判定与药效学实验结果的统一性问题和两种动物长期毒性实验结果的不一致性分析。

3.局部毒性实验　中药局部毒性实验是指观察受试药物（包括中药、复方、中药或复方的提取物、中成药）是否对机体局部产生刺激性、溶血性、过敏性、光敏性等毒性的研究方法。其主要目的是研究所观察到的药物不良反应和病理生理毒性作用机制，确定受试药物可能关系到人的安全性的非期望出现的毒性反应，为临床研究和安全用药提供参考信息。

中药局部毒性实验主要包括刺激性实验、溶血性实验、过敏性实验、光敏性实验等方面。

（1）刺激性实验　是考察动物的血管、肌肉、皮肤、黏膜及眼等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性、坏死或结膜充血、水肿及分泌物增多等局部反应，包括血管刺激性、肌肉刺激性、皮肤刺激性、眼刺激性、肠黏膜刺激性和子宫黏膜刺激性等实验。血管刺激性实验是评价中药静脉注射剂对血管刺激作用的常用方法，实验动物常用家兔；肌肉刺激性实验是评价中药肌内注射剂对肌肉刺激作用的常用方法，实验动物常用家兔、大鼠和豚鼠；皮肤刺激性实验包括完整皮肤和破损皮肤的刺激性实验，实验动物常用家兔和豚鼠；眼刺激性实验主要用于评价滴眼剂、头面部皮肤外用药、头部杀虫或清洁消毒的洗剂等对眼刺激的影响，实验动物常用家兔；黏膜刺激性实验是评价肠道、妇科外用方药对肠黏膜或阴道黏膜刺激的常用方法，但应注意，人类和哺乳类动物肠道、阴道的生理结构差异对药物的反应有很大不同，故结论应慎重。

（2）溶血性实验　是指观察受试物是否引起溶血和红细胞凝集的反应。体外溶血性实验是评价中药有无溶血作用的常用方法，但体外实验结果易致假阳性，故实验结果仅供参考。

（3）皮肤过敏性实验　是观察外用中药较长时间接触皮肤后，对机体是否产生如红斑、丘疹、瘙痒等过敏性反应的实验方法。实验动物常用豚鼠，因其皮肤对药物敏感性强，能较好地预测药物对人类的致敏性，但应注意实验结果易出现假阴性。全身过敏性实验是评价注射剂有无过敏性的常用方法，豚鼠是目前公认的进行过敏性实验的最适动物，但应注意没有一种动物的反应机制与人类完全一样这个事实，结论宜审慎。

（4）皮肤光敏性实验　主要用于预测皮肤外用中药对人类的光敏性危险发生率，分为皮肤光敏实验和光毒性实验两种。其中，皮肤光敏实验需要药物、免疫系统和光三种条件具备才会发生，目前较成熟的、应用较多的实验方法有弗氏完全佐剂法。光毒性较光敏性发生率高，常在第一次接触受试药后数小时内发生，其严重程度与剂量相关。常用实验动物有小鼠、豚鼠和大鼠；小鼠实用、价格低廉易得、操作简便、指标客观，但因其皮肤较薄，易致假阳性结果；豚鼠较小鼠评价红斑指标更容易和客观；大鼠的光毒性表现可致尾肿胀。鉴于动物种属差异，光毒性实验应采用不同动物进行。

4.一般药理实验　中药一般药理实验是指除受试药物（包括中药、复方、中药或复方的提取物、中成药）主要药效学以外广泛的药理作用研究，也称为系统药理学研究，是在一次性给予动物实验药物后观察其对动物中枢神经、心血管和呼吸等系统的影响研究。其主要目的是确定受试药物可能关系到人的安全性的非期望出现的药物效应，评价受试方药在毒理学或临床研究中观察到的药物不良反应及病理生理作用，研究所观察到的不良反应和病理生理作用并推测药物导致不良反应的作用机制，为临床研究和安全用药提供信息，为长期毒性试验设计和开发新的适应证提供参考。

中药一般药理学实验主要是观察药物对中枢神经、心血管和呼吸系统的影响，此外，根据研究发现和药物的特点还可进行后续实验，包括药物对消化系统、泌尿系统等的影响。实验应尽量在清醒动物身上进行，选用麻醉动物时应注意麻醉药的选择是否会影响该动物或该指标的观察；受试药物给药途径原则上应与临床拟用途径一致，与主要药效学实验的给药途径一致；受试药物剂量的选择主要依据是主要药效学实验的剂量，要求其高剂量、中剂量应高于药效学的有效剂量并与低剂量呈倍数关系，理论上高剂量应有部分动物出现毒性反应或死亡，其低剂量相当或高于药效学有效剂量，不出现任何异常；还应根据实验指标的具体要求设置空白对照组或阳性对照组。

5.特殊毒性实验　中药特殊毒性实验是指进行受试药物（包括中药、复方、中药或复方的提取物、中成药）的致突变、致畸、致癌实验。其目的主要是证实受试药物有无“三致”，为临床该药的受试人群提供参考信息，降低临床风险。

（1）中药致突变实验　研究方法主要包括以遗传基因突变为指标的实验、以染色体畸变为指标的实验、以DNA损伤为指标的实验。其中，以遗传基因突变为指标的实验包括鼠伤寒沙门菌营养缺陷型回复突变实验（Ames实验）和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）位点分析实验两种。以染色体畸变为指标的实验，包括染色体畸变实验和微核实验两种，染色体畸变实验是公认的成熟和可靠的细胞遗传学检测方法之一，分为体外实验和体内实验。以DNA损伤为指标的实验是评估一种化学物质到达DNA分子并引起DNA改变的一种手段，目前常用大鼠原代肝细胞DNA修复实验，该法是分析化学物质基因毒活性和潜在致癌性的非常有价值的方法。中药致突变实验研究时，受试方药的适用性问题、受试药的溶解性问题、代谢活化和阳性对照问题及结果的判断与评价问题是应特别注意的。当前，大部分中药的样品为混合物，其澄明度和理化性质难以控制，使体外实验结果难以判断而容易造成假阳/阴性结果，因此，中药致突变实验研究体外实验结果的参考价值是有限的，应以体内实验结果为主，但也应注意受试方药作用靶器官问题。

（2）中药生殖毒性实验　包括一般生殖毒性、致畸敏感期生殖毒性、围产期生殖毒性3方面，可分别判定受试物对妊娠前和妊娠初期生殖毒性、胚胎毒性和致畸性，分娩、哺乳及胎儿晚期发育、出生后生长和发育毒性的可能影响。围产期生殖毒性实验可以发现在一般生殖毒性、致畸敏感期生殖毒性实验中可能掩盖的致畸性，该期实验是评估药物生殖毒性的关键。近年来发展了3种生殖毒性短期体外筛查实验，即细胞体外培养、器官体外培养、全胚胎培养。这3种实验方法具有节约经费、快速检查致畸原的优点，但操作复杂，且应注意同一药物体内实验和体外实验对胚胎发育的异常影响存在差异。

（3）中药致癌实验　是在中药研究和新药开发的安全性评价中实验周期最长、实验费用高昂、动物消耗量大的一种实验。我国中药新药致癌实验要求中对致癌实验的动物选择、剂量设置、实验结果评估与判断标准均有规定。若中药有效成分及其制剂、中药新药材制成的制剂、中药材新的药用部位制成的制剂、无法定标准的中药材代用品、来源于无法定标准中药材的有效部位制剂、含有无法定标准药材的现代中药复方制剂中，如果含有与已知致癌物有关、代谢产物与已知致癌物质相似的成分，或长期毒性实验中有细胞毒作用及对某些脏器和组织细胞有异常显著促进作用、致突变实验为阳性的中药新药，要求进行致癌实验。致癌性实验结果的判断标准是：给药组出现了对照组没有发生的肿瘤类型；对照组和给药组均发生肿瘤，但给药组肿瘤发生率高于对照组；与对照组比较，给药组有更多不同器官和组织发生肿瘤；对照组和给药组之间的肿瘤发生率虽然没有差异，但给药组的肿瘤发生时间比对照组早，符合上述条件之一的可判定受试物致癌阳性。

二、毒作用机制研究

毒作用机制主要包括四个阶段，即毒性物质从暴露部位到靶部位的转运，终毒物与靶分子的反应，细胞功能障碍及其导致的毒性，修复与修复紊乱引起的毒性。有毒中药的毒性物质多样，产生毒性的机制相当复杂，研究的广度和深度都有待加强。现对常见的几类毒性物质的毒作用机制进行简述。

1.生物碱类　生物碱多具有比较强烈的毒性作用，引起毒性反应的含生物碱中药很多，对机体的毒性可因所含生物碱性质的不同而异。如川乌、草乌、附子、雪上一枝蒿所含乌头碱的毒理作用，主要是使中枢神经与周围神经先兴奋后抑制甚至麻痹，直接作用于心脏，导致心律失常、室颤。雷公藤、昆明山海棠所含生物碱可引起视丘、中脑、延脑、脊髓的病理改变，肝脏、肾脏、心脏可发生出血与坏死。天仙子、洋金花所含莨菪碱、东莨菪碱的毒理作用主要累及神经系统，对周围神经的作用为阻断M-胆碱反应系统，有抑制或麻痹迷走神经等副交感神经作用。马钱子所含番木鳖碱可选择性地兴奋脊髓，对中枢神经有极强的兴奋作用，中毒剂量则抑制呼吸中枢。半夏、天南星所含类似烟碱及毒芹碱，除刺激黏膜，引起喉头水肿外，对呼吸中枢可发生抑制作用，中毒症状表现为口唇及肢体发麻、恶心呕吐、心慌心悸、吞咽困难、胸闷、流涎、面色苍白、烦躁不安或间有抽搐、血压下降等，最终可因呼吸麻痹及心力衰竭而死亡。

2.糖苷类　糖苷类包括强心苷、皂苷、氰苷和黄酮苷等。如洋地黄、万年青、八角枫、夹竹桃等含强心苷，小剂量有强心作用，较大剂量或长时间应用可致心脏中毒，严重时可出现传导阻滞、心动过缓、异位节律等，最后因心室纤颤、循环衰竭而死亡。杏仁、桃仁等含氰苷，在体内被酶水解产生氢氰酸，有强烈的细胞毒作用，能迅速与细胞线粒体膜上氧化型细胞色素酶的三价铁结合，阻止细胞的氧化反应，表现为组织缺氧，如头昏、头痛、呼吸困难、紫绀、心悸、四肢厥冷、抽搐、血压下降等，严重者往往可因窒息及呼吸衰竭而死亡。商陆、黄药子等所含皂苷，可引起肠胃刺激症状，产生腹痛、腹泻，大剂量可引起中枢神经系统麻痹及运动障碍，长期服用可损害肾脏、肝脏等。芫花、广豆根等所含黄酮苷，刺激胃肠道、损害肝脏，引起恶心呕吐、黄疸等症状。

3.二萜类　雷公藤所含二萜急性毒性比较大，对心脏、肝脏有损伤，对骨髓有抑制，有明显的遗传毒性和潜在的致癌性。闹羊花所含闹羊花毒素为二萜类化合物，有不同程度的神经麻痹作用。土荆皮等所含土荆皮二萜酸，有胃肠毒性和生殖毒性。大戟、芫花、甘遂等所含大戟二萜类化合物，对消化道和皮肤有严重的刺激性。黄药子所含二萜内酯类化合物若长期使用，有肝脏、肾脏毒性，其肝毒性可能与二萜内酯类化合物引起线粒体氧化损伤有关，肾毒性则是直接损伤肾小管，导致肾功能下降。

4.毒蛋白类　毒蛋白分植物毒蛋白和动物毒蛋白。如巴豆、苍耳子、蓖麻子等植物所含植物毒蛋白，对胃肠黏膜有强烈的刺激和腐蚀作用，能引起广泛性内脏出血，甚者死亡。金钱白花蛇所含动物毒蛋白毒性很强，主要引起循环衰竭和急性肾功能衰竭。蜈蚣含动物毒蛋白毒性较强，类似蛇毒，且有很强的溶血性。

5.重金属类　重金属类有毒中药，所含重金属类别不同，毒性靶器官和毒作用机制有别。如砒霜成分为三氧化二砷，雄黄含硫化砷，可由呼吸、消化道进入体内，急性中毒者有口腔、胃肠道黏膜水肿、出血、坏死等，并能使全身的毛细血管极度扩张，大量的细胞液渗出，致使血压降低，尚可导致肝脏萎缩、中枢神经损害及心肾的严重损害。水银、轻粉、朱砂等含汞类中药，对人体具强烈的刺激性和腐蚀作用，并能抑制多种酶的活性，引起中枢神经与自主神经功能紊乱。如中毒后可出现精神失常、胃肠道刺激症状及消化道出血，严重时可发生急性肾功能衰竭而死亡。密陀僧、广丹、铅粉等含铅类中药，主要损害神经、造血、消化和心血管系统。

三、评价分析与管理

中药毒理学安全性评价是指通过动物实验和对人群的观察，阐明待评物质的毒性及其潜在的危害，决定其能否进入市场或阐明安全使用的条件，以达到最大限度地减小其危害作用、保护人民身体健康的目的。①毒理学安全性评价程序的选用原则：根据受试化学物质的种类和用途，采用分阶段进行的原则。②不同阶段的毒理学试验项目：第一阶段——急性毒性实验和局部毒性实验；第二阶段——重复剂量毒性实验、遗传毒性实验与发育毒性实验；第三阶段——亚慢性毒性实验、生殖毒性实验和毒动学实验；第四阶段——慢性毒性实验和致癌实验。

中药毒理学危险性分析是指对机体、系统或人群可能暴露于某一危害的控制过程，包括危险度评定、危险性管理、危险性交流。①危险度评定，指在综合分析人群流行病学观察、毒理学实验、环境监测和健康监护等多方面研究资料的基础上，对中药毒性物质损害人类健康的潜在能力进行定性和定量的评估，以判断损害可能发生的概率和严重程度。分为四个阶段，即危害性认定、剂量-反应关系评价、接触评定、危险度特征分析。②危险度管理，指以危险度评定结果为根据，结合费用-效益分析、政策分析、社会经济和政治等因素，决定可接受危险度和适当的管理措施，制定相关标准和规章条例。可接受危险度是指公众和社会在精神、心理等各方面均能承受的危险度。③危险性交流，指评估者、管理者、消费者和其他有关各方之间进行有关危险性和危险性相关因素的信息和观点的交流过程。应当贯穿于危险性分析的全过程。

管理毒理学是现代毒理学的重要组成部分，管理的物质包括药品、食品、化妆品、杀虫剂、工业和环境毒物等。毒理学的科学评价与国际组织、政府部门的强制性法规管理相互促进，形成了一系列标准、指南和规范。因此，中药毒理学应在安全性评价、危险性分析的基础上，按照管理毒理学的要求，做好以下工作：①良好实验室工作规范（good laboratory practice，GLP），即按照《药品非临床安全研究工作质量管理规范》要求，保证中药毒理学的安全性评价试验在高标准、统一规范下进行。②动物保护与3Rs原则，对实验动物实施人道主义管理，即安死术、仁慈终点和3Rs原则，并开发非动物的研究模型，如物理化学技术、计算机和数学模型、微生物系统和细胞组织培养。3Rs原则是指replacement-替代、reduction-减少和refinement-优化。③人体医学科学研究的伦理学要求，涉及人体试验者，应当遵循《赫尔辛基宣言》《人体生物医学研究国际伦理指南》《药物临床试验质量管理规范》等原则。尤其重要的是建立伦理审查委员会（Institutional　Review　Board，IRB）和知情同意（informed consent）原则。