1.2　GCN4的结构和功能特点

碱性区-亮氨酸拉链结构域是Landschulz等于1988年在研究调节蛋白c/EBP时发现的一种新的结构域形式［34］。GCN4是碱性区-亮氨酸拉链（basic region-leucine zipper）模型中典型的一种。与其他几种DNA结合蛋白结构域相比，bZIP结构域模型简单清晰，两个结构单元碱性区和拉链区分工明确，既相互依赖又彼此相对独立。因此，bZIP型结构域是人们开展蛋白质与DNA相互识别、相互作用研究的一个理想的结构域类型。人们对这一类蛋白的氨基酸对于蛋白与DNA特异性结合的影响进行了广泛且深入的研究。

酵母转录激活因子GCN4（1～281）在酵母细胞中调控氨基酸的生物合成，是一个非常典型的含bZIP结构域的DNA结合蛋白［35］，它的bZIP结构域位于C端约60个氨基酸残基处（226～281）（如图1-1所示）。GCN4的两个结构单元：拉链区（zipper region）和碱性区（basic region）分工明确，在功能上二者互相依赖，又彼此相对独立，发挥其自身的特定功能，因此，GCN4是研究蛋白与DNA位点识别作用的非常好的蛋白模型。

与bZIP类型结合蛋白特异性结合的DNA位点一般很短，只有7～10个碱基对，并且具有回文结构（图1-1），以满足亮氨酸拉链形成的二聚体对称性的结构特征，即两个单体分别与两个半位点结合，这种结构特征有利于与DNA识别的专一性和亲和力的增强［36，37］。

1.2.1　拉链区的结构特征和功能

拉链区（zipper region）位于蛋白的C端，大约含有30个氨基酸，呈α螺旋构象。它含有重复出现的亮氨酸残基，它们精确地相距7个氨基酸残基重复一次，这些Leu位于螺旋一侧并排成一列，每两圈出现一次。两个这样的分子可以由α螺旋一侧的Leu之间的疏水相互作用形成“拉链”，它以α螺旋超卷曲（α-helical coiled coil）的连接方式形成二聚体［38～40］。

两个蛋白单体形成“拉链式”二聚体时，一般以同型二聚体的形式出现，有时也采取异型二聚体。二聚体的形成具有特异性，如：癌蛋白c-Jun的同型二聚体形式不稳定，结合DNA的效果也不佳；而Jun-Fos异型二聚体却很稳定，增强了与DNA位点结合的亲和力［41］。采用这种相互组合的方式进行基因调节，能增加基因调控的多样性和精确性。

形成的拉链式二聚体有平行和反平行两种形式。P.S.Kim等证实GCN4是以平行方式形成二聚体的，而且形成的是经典式α螺旋超卷曲［42］。CD谱和NMR实验证实这些二聚体几乎形成100%的α螺旋结构。研究拉链区的折叠热力学过程和各种变性性质证实［43～50］，亮氨酸拉链区的热变性是一个两态过程，即只存在折叠二聚体和无序的单体两种形式，不存在折叠的单体。当肽的浓度降低，二聚体就会解离，同时伴随着α螺旋程度降低，Tm值减小，说明单体不稳定，两个α螺旋之间的相互作用对二聚体的稳定性起重要作用。

1.2.2　碱性区的结构特征和功能

与亮氨酸拉链区相邻的区域富含Arg和Lys等碱性氨基酸，因此称为碱性区（basic region），这是与DNA结合的部位，它含有专一性DNA位点识别的残基［40，42］。这一区域也包含大约30个氨基酸残基。亮氨酸拉链区是具有明确构象的刚性分子，碱性区是相对可变的柔性分子。碱性区片段和连有拉链区的碱性区片段的NMR结构几乎没有多大变化，说明二聚作用不改变碱性区结构。

在溶液中，没有与DNA结合时，碱性区的结构松散，但当与序列特异性DNA位点结合后，其螺旋含量显著增高，几乎形成100%的α螺旋构象［42，51，52］。这是因为没有与DNA结合时，碱性区的带正电的氨基酸侧链之间的作用使其构象不稳定，但与DNA位点大沟的碱基之间的特异性结合以及与磷酸基团之间的相互作用中和了这些正电荷，使碱性区发生构象变化，螺旋含量增高，这一作用是协同的，碱性区的螺旋构象的形成也有利于序列专一性识别。

T.E.Ellenberger等测定了GCN4结合蛋白的碱性区和拉链区bZIP，即GCN4的226～281片段，与AP-1和ATF/CREB位点形成复合物的晶体结构［53］。复合物的晶体结构为深入研究bZIP蛋白的氨基酸残基与DNA位点相互识别的作用机制打下了基础。在这个复合物中，GCN4以Y形的“叉式”模型与DNA结合（图1-3），碱性区与拉链区形成连续的α螺旋，拉链区形成二聚体，在接近DNA双螺旋时分叉，两个叉的碱性区以相反的方向进入DNA的两个半位点的大沟中，产生特异性结合。碱性区中234～243位的氨基酸残基直接涉及与DNA的识别作用，其中5个高度保守的残基Asn-235、Ala-238、Ala-239、Ser-242和Arg-243通过氢键或疏水作用与DNA的碱基接触，直接影响GCN4与DNA识别的特异性。为了更清楚地分析GCN4的碱性区的重要氨基酸残基与DNA的碱基之间的相互作用，将GCN4和AP-1、ATF/CREB的序列编号如下：

根据这两个复合物的晶体结构，GCN4的氨基酸与DNA的碱基主要涉及下列相互作用，如图1-2所示。

具体分析GCN4主要的氨基酸残基与DNA碱基间的相互作用如下［54］：

① 五个直接影响GCN4的、具有DNA结合特异性的氨基酸残基通过氢键或疏水相互作用与DNA的碱基接触（图1-2）。

a. Asn-235的NH和OH提供两个H原子与Cyt-2'L的N4和Thy-3L的O4形成氢键。

b. Ala-238与Thy-3L的CH3形成疏水相互作用。

c. Ala-239与Ade-1L、Thy-1L的5-CH3形成疏水相互作用。

d. Ser-242与Ade-4L、Thy-3L的磷酸基团的非酯氧原子形成氢键，以及与Thy-3L形成疏水相互作用。

e. Arg-243上氨基的1号氢原子、2号氢原子分别与中心的Gua-0'的N6、N7形成氢键，这是蛋白-DNA识别中Arg与Gua相互作用的基本模式。在GCN4：AP-1中，AP-1的左右两个半位点与GCN4的两个单体的作用方式不同，其中一个GCN4分子的Arg-243与AP-1的右半位点的Cyt-O、Ade-1L的磷酸基团的非酯氧原子形成氢键。而在GCN4：ATF/CREB中，两个GCN4单体的Arg-243与ATF/CREB的作用相同，都与Cyt-O的非酯氧原子和Gua-O'的N7形成氢键，形成二重对称的结构。

② Lys-231、Arg-232和Lys-246处于GCN4碱性区的两端，与DNA的磷酸基团形成静电作用或通过H2O分子形成氢键，起到稳定复合物的作用。

a. Lys-231通过H2O分子与Ade-3L的非酯氧原子形成氢键。

b. Arg-232的两个NH与Thy-1L的磷酸基团的两个O原子形成盐桥。

c. Lys-246的NH与Gua-2'R的非酯氧原子形成盐桥。

③ Glu-237和Arg-240分别通过形成氢键起稳定复合物的作用。

a. Glu-237通过H2O分子与Ala-233的羰基氧原子形成氢键。

b. Arg-240与Gua-O的非酯氧原子形成氢键，并通过H2O分子与Cyt-O的磷脂氧原子形成氢键。

c. Glu-237的两个氧原子与Arg-240的氢原子形成氢键。

④ GCN4碱性区α螺旋的中心Thr-236、Ala-238和Ala-239与DNA形成一个疏水核心。Thr-236的Cr与Gua-O的脱氧核糖的C2'和C3'形成疏水相互作用。

⑤ 总体观察6个Arg残基，其中5个Arg的侧链（Arg-234、Arg-240、Arg-241、Arg-243、Arg-245）与DNA的碱基形成氢键，只有Arg-232与Thy-1L上的磷酸基团形成盐桥。

1.2.3　GCN4与AP-1、ATF/CREB的相互作用分析

综上所述，其中Asn-235、Ala-238、Ala-239、Ser-242和Arg-243五个主要残基决定了GCN4与DNA的专一性识别。Suckow等已详细研究了突变这五个残基对GCN4与DNA专一性识别的影响［55，56］，发现分别将Asn-235用Glu、Trp替换，Ala-238用Asn、Ser、Tyr、Cys替换，Ala-239用Glu、Ser、Thr、Val替换，Arg-243用Lys、Tyr替换，这些突变体与DNA能特异性结合，只是有的结合亲和力降低；但是对于Ser-242，将其突变为Cys、Phe、His、Leu、Met、Glu、Thr、Val和Trp等，几乎与天然GCN4具有相同的DNA结合亲和性，只是专一性有所降低。

酵母转录激活因子GCN4不仅与AP-1位点特异性结合［57］，而且与具有真正回文结构的ATF/CREB位点也结合［58］，结合亲和力基本相同。对比AP-1和ATF/CREB的序列，它们都是由两个具有回文序列的ATGA半位点组成，AP-1位点是在两个半位点之间由单个碱基对C：G隔开，而ATF/CREB位点则由C：G和G：C两个碱基对隔开，形成一个具有真正回文结构、二重对称性的DNA序列。分析GCN4与这两个DNA位点复合物的晶体结构发现［59］，在复合物中GCN4与AP-1、ATF/CREB的作用方式基本相同，都是由5个氨基酸残基与DNA的碱基进行特异性结合，但是AP-1和ATF/CREB位点序列和构象上的差异导致在这两个复合物中存在两点不同：

① 在GCN4：AP-1复合物中，一个单体的Arg-243与G0'的N6和N7形成两个氢键，另一个单体的Arg-243与DNA另一股链的磷酸骨架结合；而在GCN4：ATF/CREB复合物中，两个Arg-243都与G0'的N7形成一个氢键，并与邻近的磷酸基团作用。

② AP-1是典型的直链B型构象，而ATF/CREB的双螺旋由中心向蛋白弯曲约20°（图1-3），DNA的构象具有某些A型特征，说明蛋白与ATF/CREB的作用诱导DNA弯曲变形，以保证ATF/CREB位点与AP-1位点一样，与GCN4产生相同的识别作用，因此DNA的弯曲变形是二聚体作用的结果。由于在这两个复合物中，蛋白质-DNA相互作用模式和结合能量的高度相似性，T.J.Richmond认为，这两个复合物的DNA构象能也相同，即具有典型的B型构象和带有某些A型构象特征的变形B型构象的柔性DNA具有相同的能量［59］。