前 言

GCN4与DNA的分子识别是基因转录过程的重要模型体系之一，研究它们的识别机制有利于揭示生物信息传递及调控的奥秘，并且对识别机制的研究有利于研制和开发以基因转录过程为靶标的新药，因此对GCN4与DNA分子识别的研究不仅具有重要的理论意义，也有很好的应用前景。本书研究的核心是GCN4与DNA分子识别过程的研究，力图阐明GCN4与DNA相互作用所涉及的复杂能量因素，探讨各种因素对识别作用的影响，并建立合理的理论模型来解释实验结果。主要研究如下：

① GCN4单体肽与DNA的分子识别。首次获得了GCN4碱性区，即单体肽GCN4-br能够专一性识别其二聚体的DNA结合位点AP-1和ATF/CREB的热力学证据。单体肽与DNA结合后构象从伸展构象转变为高度的α螺旋构象，热变性曲线为协同的S形曲线，反应焓变随温度的变化关系决定了比热容变化为负值，这都是单体肽GCN4-br与DNA特异性识别的证据。并且我们也首次观察到单体肽可以特异性识别DNA半位点。单体肽与DNA半位点的结合热变性曲线为协同的S形曲线，反应焓变随温度的变化关系决定了比热容变化为负值，这都是单体肽GCN4-br与DNA半位点特异性识别的证据。实验中还首次观察到单体肽GCN4-br与AP-1两个半位点的结合是有略微的差异的，这是因为AP-1位点与单体肽结合的两个大沟的碱基位置不同而引起的。我们的实验结果有力地支持了GCN4单体可以先与DNA结合，然后再二聚的识别机理，这对认识GCN4在基因转录调控过程中的作用具有一定的启示。

② 突变对GCN4与DNA分子识别的影响。设计了一个全新的能够区别性识别AP-1及ATF/CREB DNA位点的突变二聚体肽mGCN4-D。考虑到复合物中两个DNA位点序列和结构上的差异，我们认为略微弯曲的ATF/CREB位点比直链的AP-1位点有更好的疏水环境，可以使得突变后的Leu与ATF/CREB骨架形成更好的疏水作用。因此突变后的二聚体肽mGCN4-D可以区别性识别ATF/CREB和AP-1位点，它比天然GCN4具有更好的序列专一性。另外，我们研究了一系列N端突变单体肽对螺旋形成和对DNA分子识别过程的影响。研究结果显示突变后的单体肽仍然能够专一性识别DNA位点。通过比较分析突变前后的实验数据，我们认为端基上带负电的D和构象刚性的P对螺旋和分子识别过程的影响是有利的，并且在N端突变使其形成增强的N-cap，以及突变成Aib残基对螺旋和分子识别过程都产生正面的影响。我们的实验结果可以更好地理解氨基酸残基在GCN4与DNA分子识别过程中的作用，并对进一步的设计工作具有一定的指导作用。

③ 色氨酸标记的GCN4单体肽与DNA的分子识别。CD实验结果证实，经过色氨酸突变的单体肽GCN4-W仍然可以特异性识别其DNA位点。荧光滴定实验测得了突变单体肽GCN4-W与DNA特异性结合形成的复合物的表观解离常数，实验所得的解离常数与文献报道的解离常数相近，因此在肽链上引入色氨酸，利用荧光强度的变化来测定复合物的解离常数的方法是有效的。实验结果为研究单体肽与DNA的分子识别机理提供了重要的信息，并且这种方法可以用于进一步研究肽与DNA分子识别的快速反应动力学。

④ 多肽合成。根据上述GCN4与DNA分子识别研究的需要，通过多肽固相合成方法，采用Fmoc策略合成了天然蛋白GCN4的碱性区GCN4-br（序列226～252），以及5个以GCN4碱性区为基础的突变单体肽，其中一个C末端含有Cys残基的突变单体肽用空气氧化法得到了相应的二硫键（S—S）连接的二聚体肽。所有的多肽均经过RP-HPLC分离纯化，纯品肽都经过分析型RP-HPLC和MALDI-TOF-MS鉴定来保证多肽的准确性和纯度。

本书的研究是在来鲁华教授的悉心指导下完成的，书中的点滴成果都倾注着来老师的心血。来老师严谨的治学态度、广阔的学术视野和对学科前沿敏锐的洞察力都给我留下深刻的印象。研究进行当中，每当实验遇到困难或者没有思路的时候，总是想从来老师那里得到帮助，来老师耐心解答并且循循善诱，常常让我有豁然开朗的感觉。来老师对我很宽容，也锻炼我独立思考、独立研究的能力，对于我的好的想法和好的思路，总是在实验上不遗余力地支持我。经过历练感觉自己提高了很多，从开始只会跟着别人做实验慢慢向着能够独立思考和解决问题转变。在这个过程中，我从来老师身上学到了很多做学问的态度和方法。

回首二十多年艰辛的求学生涯，曾有成功的喜悦，也曾有失意的困惑。在此我要感谢我的父母、亲人，以及关心过我的朋友们，是他们给予我生活的保障和勇气，他们永远是我前进的动力。特别要感谢我的爱人宋战江，是他的鞭策、鼓励和永远默默地帮助和关心，支持我走过这漫长的岁月。

最后再次感谢所有关心和帮助过我的人！

王　旭

2018年3月于燕园