四、 种质资源的保存

种质资源的保存是指利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源。搜集到的种质资源经过整理分类后要妥善保存，使之能维持样本一定的数量，保持纯度、生活力和原有的遗传特性。主要作用在于防止资源流失，便于研究和利用。保存方法主要有：就地保存、移地保存、离体保存和种质库保存等。

（一） 种植保存

为了保持种质资源的种子或无性繁殖器官的生活力，并不断补充数量，种质材料必须每隔一定时间播种一次，即称种植保存。对于有性繁殖植物，繁殖时间因种子寿命不同而有较大的差异；对于无性繁殖的园艺植物，如苹果，需年年繁殖。这种保存方法主要用于果树和无性繁殖的园艺植物。种植保存可分为就地保存和移地保存。

1.就地保存

就地保存是指种质在原产地，通过保护其生态环境达到保存资源的目的。例如，我国自1956年到1991年已建成各种类型的自然保护区707处，其中长白山、卧龙山和鼎湖山三处已被列为国际生物圈保护区。这些是自然种质资源保存的永久性基地。就地保存还包括栽培的古树木和花木，如陕西楼观台的古银杏、山东无棣的躺枣、河北邢台的宋栗等都要就地保存原树，并进行繁殖，使其能得到长久利用，它们经历了长期的自然考验，大多具有丰富的遗传基础，具有很高的研究利用价值。

2.移地保存

移地保存是指把整个植株迁移到植物园、树木园或育种的种质资源圃进行种植，而达到保存的目的。常针对资源植物的原生环境变化很大，难以正常生长及繁殖、更新的情况，选择生态环境相近的地段建立迁地保护区，有效地保存种质资源。各地建立的植物园、树木园、药物园、花卉园、原种场、种质资源圃等都是移地保存的场所。例如，我国共建成32个国家级种质资源圃（表2-1），共保存数十种作物的45000余份种质，包括1000多个种。其中，野生稻种质资源圃建在广东省农科院和广西壮族自治区农科院，分别保存4300余份和4600余份种质。

（二） 种子贮藏保存

种子贮藏保存是以种子为繁殖材料的植物，通过种子贮藏保存种质资源的方法。种子容易采集、数量大而体积小，便于贮存、包装、运输、分发。所以，种子保存是以种子为繁殖材料的种类最简便、最经济、应用最普遍的资源保存方法。

大多数作物种子的寿命在自然条件下只有3～5年，多者10余年（表2-2）。由于种种内外因素的差异，种子寿命会有较大的变化。如莲藕、雅莲、合欢、山扁豆、湿地百脉根、红车轴草等都发现有百年以上仍保持正常发芽能力的种子。Posild等（1967）报道冻结在北极冻土带中的北极羽扇豆的种子，1万年后仍能发芽并长成健全植株。种子寿命长短主要取决于植物种类、种子成熟度及贮存条件等因素。研究表明，低温、干燥、缺氧是抑制种子呼吸作用从而延长种子寿命的有效措施。因此，种子贮藏保存主要是通过控制贮存温度、湿度、气体成分等措施来维持种子的生活力。一般而言，种子的含水率在4%～14%范围内，含水率每下降1%，种子寿命可延长一倍；在贮存温度为0～30℃范围内，每降低5℃，种子寿命可延长一倍。一般情况下，禾谷类种子寿命高于油料作物，成熟适度的种子比未成熟的寿命长。

用于保存种子的种质库按照保存的时间可以划分为三种类型。

① 短期库　一般由育种工作者或综合性大学临时建立，主要任务和功能是临时贮存应用材料，并分发种子供研究、鉴定、利用，也称为“工作收集”。保存时库温为室温或稍低，大约在10～15℃或稍高，相对湿度维持在50%～60%，种子存入纸袋或布袋，一般可存放5年左右。

② 中期库　一般由省级主管部门或综合性大学建立，相对规模较小，但比较稳定的种质库。又叫做“活跃库”，任务是进行定期的繁殖更新，并对所收集到的种质进行整理，描述鉴定并建立相关档案，向育种家提供种子。种质库库温0～10℃，相对湿度60%以下，种子含水量8%左右，种子存入防潮布袋、装有硅胶的聚乙烯瓶或螺旋口铁罐，要求安全贮存10～20年。

③ 长期库　一般由国家相关部门建立，主要工作是防备中期库种质丢失，一般不分发种子，只进行种质的储备；只有在必要时才进行繁殖更新，确保遗传完整性，所以也称为“基础收集”。长期种质库的库温周年维持在-10℃、-18℃或-20℃，相对湿度50%以下，种子含水量5%～8%，种子存入盒口密封的种子盒内，每5～10年检测种子发芽力，要求能安全贮存种子50～100年。

20世纪80年代以来，各国为长期保存种质已陆续建成现代化国家级种质库225个。为了更有效地保存种质资源，我国国家作物种子库于1986年在北京建成并投入使用。该库是世界一流的，库容量可达40余万份，常年温度控制在-18℃±2℃，相对湿度50%±7%。库内种子可维持50年或更长。至2005年底该库已保存各种作物（包括蔬菜）的种子50余万份，按植物学分类统计有191种作物，分属32个科，183个属，800多个种。为防止意外的天灾人祸，20世纪世纪90年代在我国青海省西宁建立了复份保存库，该库温度-10℃，由于西宁环境干燥，故库内不控制湿度，该库是目前世界上库容量最大的节能型国家级复份种子库，并在世界上首次安全转移了30余万份种质。

对于种质库来说，除了保存资源本身外，还应保存每份资源的档案资料，包括编号、名称、来源以及不同年度调查及鉴定评价资料等，输入计算机，建立资源数据库，以便随时检索、查阅。

（三）离体保存

离体保存就是利用试管保存组织或细胞培养物的方法，用以有效地保存种质资源材料。如高度杂合性的、不能产生种子的多倍体和不适合长期保存的无性繁殖器官，如球茎等。作为保存种质资源的细胞或组织培养物有：愈伤组织、悬浮细胞、幼芽生长点、花粉、花药、体细胞、原生质体、幼胚和组织块等。离体保存方法的技术含量高，需要设置专门的管理机构和人员，而且每种作物的保存方法不同，因此目前主要针对一些比较珍贵的种质资源。目前采用的主要方法有以下两种。

1.缓慢生长系统

缓慢生长系统主要是利用离体培养的方法使植物缓慢生长，延长植物的生长发育周期，适用于短期和中期保存。如甘薯腋芽的培养物在温度从28℃降到22℃时，继代培养的间隔从6周增加到55周，采用防止培养基蒸发的措施后，继代培养的期限增加到83周。再如，陈振光于1985年将一批柑橘试管苗培养在20℃，12h光照条件下，不做继代培养，经过13年，小苗处于生长停滞状态，但仍存活。用上述方法保存的试管苗进行继代培养后，可立即恢复生长。在培养基中加入化学抑制剂如甘露醇，或激素类物质如脱落酸，可提高延缓效果。缓慢生长系统由于需继代培养，时间周期长，加上培养基和激素类物质的影响，细胞继续分裂后，难以排除遗传变异的可能。

2.超低温保存系统

超低温长期保存是指在干冰（-79℃）、超低温冰箱（-80℃）、氮的气相（-140℃）或液态氮（-196℃）条件下保存植物组织或细胞。其保存原理：在超低温条件下，细胞处于代谢不活动状态，从而可防止或延缓细胞的老化；由于不需多次继代培养，也可抑制细胞分裂和DNA的合成，细胞不会发生变异，因而能保证种质资源的遗传稳定性。

① 悬浮培养细胞和愈伤组织超低温保存　在培养基内加入适量渗透剂（甘露醇、脯氨酸等），以提高细胞的抗寒力，然后将悬浮细胞和愈伤组织放在超低温条件下保存。现已成功保存的悬浮培养细胞有胡萝卜、玉米、水稻、蔷薇、单倍体烟草、人参等；已保存成功的愈伤组织有杨树、甘蔗等。

② 生长点超低温保存　植物茎尖的分生组织一般长0.25～0.3mm，在胚胎发育时期首先形成，并在整个营养生长时期都处于各级分裂状态，遗传性稳定。茎尖保存时需要结合茎尖培养技术，首先将茎尖放在含有5%DMSO的培养基内预培养数天，然后以每分钟下降1℃左右的速度冷却到-40℃，再放入液氮中。如苹果、胡萝卜、豌豆、草莓、花生、土豆、番茄、康乃馨等植物，冷冻保存后仍有50%以上的培养物可分化形成植株，有的分化率达100%。

③ 体细胞胚和花粉胚的超低温保存　体细胞胚和花粉胚处于球形期时较为耐寒，超低温保存的存活率在30%左右，解冻后经过2～4周的停滞期，就可恢复生长，通过以后的各个发育时期，最终可形成单倍体植株。

④ 原生质体超低温保存方法　其保存操作复杂，技术难度大，故成功的例子很少。

（四）基因文库保存

面对遗传资源大量流失、部分资源濒临灭绝的情况，建立和发展基因文库技术，为抢救种质提供了一个有效的途径。这一技术的要点是从资源植物提取大分子的DNA，用限制性内切酶切成许多DNA片段，再通过一系列步骤将DNA片段组装在载体上，通过载体把DNA片段转移到繁殖速度快的大肠杆菌中，通过大肠杆菌的无性繁殖，增殖成大量可保存在生物体中的单拷贝基因。这样建立起来的基因文库不仅可长期保存该物种的遗传资源，而且还可以通过反复的培养增殖，筛选出各种需要的基因。当需要某个基因时，可通过现代基因工程技术重新获得。